Summary
Estudos de desenvolvimento no rato são dificultados pela inacessibilidade do embrião durante a gestação. Para promover a cultura de longo prazo do coração embrionário em fases tardias da gestação, foi desenvolvido um protocolo no qual o coração excisado é cultivada num Matrigel semi-sólido, diluída.
Abstract
Estudos de desenvolvimento no rato são dificultados pela inacessibilidade do embrião durante a gestação. Assim, os protocolos de cultura e para isolar os órgãos individuais de interesse são essenciais para proporcionar um método de visualização de ambas as alterações no desenvolvimento e permitindo que novas estratégias de tratamento. Para promover a cultura de longo prazo do coração embrionário em fases tardias da gestação, foi desenvolvido um protocolo no qual o coração excisado é cultivada num Matrigel semi-sólido, diluída. Este substrato proporciona suporte suficiente para manter a estrutura tridimensional, mas é suficientemente flexível para permitir a contracção continuada. Em resumo, os corações são cortados a partir do embrião e colocado numa mistura de Matrigel frio diluído 1:1 com meio de crescimento. Após o Matrigel diluída solidifica, meio de crescimento é adicionado à placa de cultura. Corações excisadas tão tarde como dia embrionário 16,5 eram viáveis por quatro dias após a dissecação. A análise do plexo coronária mostra que este método não fazperturbar o desenvolvimento vascular coronária. Assim, apresenta-se um novo método para a cultura de longo prazo de corações embrionárias.
Introduction
Nos últimos anos, o ratinho transgénico tem sido o sistema modelo para o estudo predominante de desenvolvimento de defeitos cardíacos. No entanto, outros organismos modelo, tal como o peixe-zebra, provaram ter vantagens significativas sobre o rato. Três importantes vantagens do peixe-zebra são a colocação externa de ovos, para facilidade de acesso para os embriões, a transparência óptica dos embriões, o que permite a fácil visualização do desenvolvimento cardíaco e a facilidade de aplicação de pequenas tratamentos moleculares para modular o desenvolvimento do embrião 1. Assim, o desenvolvimento de uma técnica de cultura que permitiu o crescimento ex utero de um dos órgãos embrionários seria ignorar, pelo menos em parte, as limitações actualmente experimentado por investigadores que estudam processos de desenvolvimento de ratinhos transgénicos.
Sistemas de cultura ex vivo cardíacos foram desenvolvidos tanto em embrião do pinto e do rato que permitem que o tratamento com pequenas moléculas e análise de como differentes regiões do coração comunicar 2-6. Para a cultura do coração de rato inteiro, corações feita a partir de embriões até embrionária (E), 12,5 de idade podem ser colocados em meio de cultura com ou sem balançar 2,3,5. Usando esta técnica, os corações embrionários foram incubadas com êxito para a equivalência de E13.5, e os corações foram cultivadas com agitação foi mantida enquanto três dias (a partir de E10.5) 3. No entanto, não existem estudos têm relatado a cultura de sucesso de corações de embriões mais velhos. Da mesma forma, as experiências de resgate foram limitadas a aplicação do agente terapêutico a nível mundial para o meio de cultura 2.
Um sistema de cultura fatia, em que corações são excisadas, incorporado, e seccionados usando um vibratome, também tem sido utilizada para ambos os corações mais jovens, como E12.5 corações de rato e Hamburger-Hamilton estágio 36 (cerca de E16 no mouse) bico corações 2,4,6, ou mais corações, como o pós-natal e do rato adulto hearts e corações humanos adultos 7,8. Enquanto as análises embrionárias têm tipicamente utilizado de espessura 150 mícrons 2,4, espessura de corte pode ser um grande como 500 mM, sem evidências de privação de oxigênio 8. Estas culturas foram mantidas de fatia, enquanto dois meses em cultura, com a maioria das fatias mantendo contractilidade ao longo deste período de 9. Em comparação com estudos em cardiomiócitos isoladas, estas culturas fatia permitir a co-cultura de cardiomiócitos com os seus tipos de células vizinhas e fornecem um método útil para a análise ex vivo. Contudo, estas culturas requerem mais elaborada configurar do que simplesmente colocar o coração no meio de cultura (por exemplo, incorporando o coração vivo para o seccionamento num vibratome), e qualquer análise é, obviamente, limitada a parte do coração no interior da secção.
Dadas as limitações descritas acima para a cultura de coração de rato embrionárias ea riqueza de camundongos transgênicos available para o estudo, foi desenvolvido um sistema de cultura do coração de rato ex vivo semelhante a um sistema de cultura ex vivo de pulmão desenvolvidas por Weaver, et al 10 O nosso sistema de cultura. permite a cultura a longo prazo e a visualização da circulação coronária remodelação corações inteiros dentro embrionárias de ratinho. Além disso, a utilização de grânulos de Matrigel permite ser mantido no lugar perto do coração, proporcionando assim um tratamento localizado de agentes terapêuticos. Estas experiências podem ser realizadas em momentos diferentes de desenvolvimento para comparar o efeito de um determinado tratamento com um processo tal como a formação da artéria coronária. Porque as moléculas pequenas podem difundir através de Matrigel, este sistema de cultura pode também ser utilizada para a cultura regiões dissecadas do coração perto uns dos outros para determinar se os contactos célula-célula específicos são necessários para certos processos do desenvolvimento ou se parácrinos sinalização de uma região para a outra é necessário.
Este sistema de culturaé relativamente simples e, ao contrário do sistema de cultura fatia, faz uso de reagentes básicos da cultura e set-ups que estão disponíveis na maioria dos laboratórios. Em resumo, os corações são excisados de embriões cultivados em Matrigel diluído, o qual proporciona um suporte semi-sólido. Este apoio é suficiente para manter a morfologia tridimensional do coração, ao mesmo tempo, permitindo que o coração contrato. Usando este sistema, corações inteiros de embriões de ratos mais velhos (E14.5, E16.5) podem ser mantidas em cultura durante quatro dias. Todo o plexo coronário é mantido, ao contrário das culturas de fatia, de modo quaisquer sinais de sinalização que ocorrem a partir de diferentes regiões do coração continuar presente. Além disso, corantes fluorescentes em células vivas, podem permear o Matrigel para permitir a visualização do coração, ao vivo, e os grânulos de proteína conjugada pode ser colocado perto do coração para proporcionar uma fonte de sinalização localizada. Juntos, esses benefícios fazem desta técnica um método ideal para o estudo de processos de desenvolvimento no embryoncoração do mouse ic.
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Protocol
1. Extirpando os corações embrionárias
- Sacrificá um rato timed-grávida no dia embrionário desejado usando uma técnica de eutanásia aprovado. Todos os experimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da Universidade da Carolina do Norte em Chapel Hill.
- Liberalmente pulverizar a fêmea com etanol 70% antes da dissecação. Abra cavidade abdominal da fêmea para recuperar e impostos especiais de consumo do corno uterino.
- Coloque a trompa uterina de uma placa de Petri contendo a frio 1x salina tamponada com fosfato (PBS) e lavagem conforme necessário. Cortar abrir o corno uterino através da linha média para expor os sacos embrionários em anexo.
- Cortar abrir um saco embrionário e recuperar um embrião. Coloque o embrião de uma segunda placa de Petri com o frio PBS. Retorne a placa de Petri com o corno uterino em gelo.
- Decapitar o embrião para melhorar o acesso à parede torácica. Se a genotipagem é necessário, remover e guardar a cauda num tubo Eppendorf colocada em gelo.
- Com oembrião em suas costas, cortou a parede torácica para visualizar o coração e os pulmões. Dependendo da fase, a parede torácica pode ser transparente.
- Levante cuidadosamente o coração usando uma pinça e cortar os vasos abaixo. Em seguida, corte acima dos grandes vasos para libertar o coração. Se necessário, remover os tecidos estranhos.
- Colocar o coração num poço de um prato de 24 poços cheios com PBS frio e colocar o prato em gelo.
- Repita os passos anteriores até que os corações foram retirados de todos os embriões.
2. Cultura Set-up
- Num capuz laminar, combinar Matrigel frio e o meio de cultura desejada (por exemplo, 10% de soro fetal bovino (FBS) em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM)) numa proporção de 1:1. Não pré-aquecer o meio de cultura.
- Mantendo o Matrigel diluído em gelo, pipeta 500-1.000 ul da solução diluída para um poço de uma placa de cultura de 24 poços que também é mantido em gelo.
- Na capa, escolha com cuidado e coloque o excisadascoração num poço da placa de cultura de Matrigel contendo mantendo a placa de cultura em gelo.
- Se a orientação do coração encaixado é crucial: Liberalmente pulverizar um microscópio invertido e o espaço circundante com etanol a 70%. Na capa, colocar o coração retirado de uma cavidade da placa de cultura de Matrigel contendo, enquanto ainda no gelo. Em seguida, coloca a placa em um microscópio e orientar rapidamente o coração excisado como o Matrigel começa a solidificar.
- Colocar a placa de cultura de 37 ° C humidificado incubadora (5% de CO 2) e permitir que o Matrigel para solidificar durante aproximadamente 30 min.
- Adicionar 1 ml de meio de cultura pré-aquecido a cada poço contendo um coração.
- Corações podem permanecer em cultura durante pelo menos quatro dias. A alteração do meio de cultura de dois em dois dias é recomendado.
3. Fixação e Visualização
- Se se desejar, adicionar um corante fluorescente em células vivas (por exemplo, Syto-16) para visualizar o coração vivo. Fotografia serálimitado ao lado do coração, que é visível com base na posição em que foi incorporado.
- Se as análises pós-cultura (por exemplo, toda a imagem de montagem ou o corte) será realizada, remova o meio de cultura e substituir com frio formaldeído 4%. Coloque o prato no gelo por 30 min.
- Após o formaldeído frio e gelo promover a dissolução do Matrigel, substituir o fixador (e Matrigel) com formaldeído fresco e corrigir corações durante a noite a 4 ° C.
- Lave os corações com tampão (eg PBS ou Tris) e armazenar a 4 ° C até as análises.
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Representative Results
Utilizando esta técnica, o coração mantém a sua morfologia tridimensional permanece viável e, como indicado por contracções contínuas filme (1). Essas contrações são consistentemente mais proeminente nos átrios do que nos ventrículos. Após a cultura, os corações podem ser fixadas e processadas para histologia e imuno-histoquímica ou para examinar a expressão do marcador específico ou estruturas. Figura 1A mostra a base dos ventrículos e grandes artérias do coração de um embrião de rato que foi cultivado durante 24 horas, fixadas e processadas para imunohistoquímica para rotular o endotélio. Estas micrografias confocal demonstram que a vasculatura coronária parece semelhante a um coração excisado a partir de um embrião comparavelmente envelhecido que foi mantida no útero (Figura 1B). No entanto, as artérias coronárias no coração cultivadas ex vivo fazer aparecer menores do que no coração, que foi mantida no útero. Em ambos os corações, thelectrónicos ápices dos ventrículos foram removidas para permitir um melhor acesso dos anticorpos para o tecido.
HE análise (H & E) de corações excisadas no E16.5 e cultivadas ex vivo para 4 d demonstra que a morfologia geral, incluindo as paredes das grandes artérias (Figura 2A) e do miocárdio ventricular e do septo interventricular (Figura 2B) de o coração permanece intacta. Apesar da falta de circulação, os óstios coronários são evidentes (Figura 2A). No entanto, a fragmentação do ADN, observada tanto com H & E (Figuras 2A, 2B) e DAPI (dados não mostrados), é aparente no miocárdio compacto e em torno dos grandes vasos. Além disso, o miocárdio é menos densa em comparação com um coração de um embrião E18.5 que se desenvolveu no útero (Figuras 2C, 2D), mesmo que o coração cultivadas ex vivo foi ainda batendo. Assim, há limitações à duraçãode tempo ou para a fase em que estes corações pode ser mantida.
Esta técnica de cultura pode também ser usado para marcar por fluorescência ao coração em cultura. Neste caso, os corações são cultivadas durante 48 horas depois de serem incubados com um corante fluorescente específico endotelial. Neste exemplo, a visualização é limitada com base na orientação do coração e a opacidade do tecido (Figuras 3A, 3B). No entanto, as secções histológicas subsequentes, através do miocárdio ventricular confirmar que esta molécula fluorescente pode penetrar as camadas exteriores da pilha para rotular recipientes sub-epicárdio dentro dos ventrículos (Figuras 3C, 3D), e o corante fluorescente colocaliza com iso-lectina (Figura 3D).
Figura 1. Desenvolvimento parece normal em condições ex vivo. (A), após 24 h em cultura, ex vivo a partir de corações E14.5 embriões foram fixados, marcado com um marcador endotelial (verde), foi afastada e fotografadas com um microscópio confocal. A artéria pulmonar (PA), a aorta (aorta), e da base do coração são mostrados. (B) dos corações excisados de E15.5 embriões que se desenvolveram no útero, foram processados de forma semelhante. Barra de escala, 100 mm.
Figura 2. Morfologia é grosseiramente mantida durante a cultura ex vivo. (A, B) Os corações foram excisados a partir de embriões E16.5 e cultivadas ex vivo, durante 4 dias. Os corações foram seccionados e corados com hematoxilina e eosina (H & E). (A) Uma secção transversal mostrando o alinhamento da aorta (Ao) e da artéria pulmonar (PA). Um dos óstios coronários (seta) é visível. O miocárdio surarredondamento da aorta é menos denso do que o controlo (C), e alguns fragmentação nuclear (seta), também está presente. (B) A morfologia geral do miocárdio compacto dos ventrículos e no septo interventricular (SIV) parece normal, mas o miocárdio é menos denso do que o controlo (D), e alguns fragmentação nuclear (seta) é aparente no SIV. (C, D) Para fins de comparação, na região frontal de H & E secções coradas de um E18.5 coração são mostrados. (C) Um óstio coronário é observada adjacente à Ao (setas) (D). Septo interventricular é bem definida. Barra de escala, 70 mM.
Figura 3. Ex vivo corações podem ser marcados com fluorescência durante a cultura (A, B). Após 48 horas de cultura, ex vivo corações deE16.5 embriões foram incubados com Syto 16 (verde) durante 1 hora, e a fluorescência pode ser observada tão tarde quanto 48 horas após a incubação. (C, D) A fluorescência foi mantida através de seccionamento congelado e pode ser observada nas células epiteliais subepicárdicas no miocárdio ventricular. Em D, a secção dentro do miocárdio ventricular foi co-marcadas com iso-lectina (vermelho). As iso-lectina co-rótulos das células verdes Syto 16 positivos (setas) e também rotula vasos dentro do miocárdio que não foram coradas com Syto 16. AB, ampliação de 4x; barra de escala em CD, 120 mM.
Filme 1. Após a cultura ex vivo por 30 horas, um coração cortado de um E14.5 embrião mostra contratilidade consistente e ritmo entre os átrios e ventrículos. Clique aqui para ver filme .
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Discussion
O atual sistema de cultura apresenta vantagens significativas para os estudos cardíacas embrionárias de camundongos. Este sistema de cultura preserva a contractilidade do miocárdio e do plexo coronária, com sinais limitadas de necrose, mesmo após quatro dias de cultura. Além disso, a matriz semi-sólida proporciona suporte suficiente para manter a morfologia tridimensional do coração em desenvolvimento, permitindo flexibilidade de contrato e também para segurar esferas revestidas no lugar durante a cultura. Apesar deste apoio, esta matriz é permeável à corantes fluorescentes, tais como Syto 16, permitindo a análise de fluorescência do coração ao vivo.
Métodos de cultura de fatia colocar a secção de coração, contendo a sua porção do plexo coronária, sobre uma membrana porosa a uma interface ar-líquido para manter oxigenação através da acção capilar 7. Em contraste, os métodos de cultura de todo coração anteriores dependem de estudos de balanço e restritos às idades embrionárias antes de um vasculat coronária funcionalure é necessário 2,3,5. Usando a técnica actual, contudo, os corações podem ser facilmente cultivadas após o plexo coronária foi formada sem a complexidade adicional de uma interface ar-líquido.
Apesar das nossas preocupações que os corações embrionárias tardias (por exemplo, E16.5) que se tornam necróticas após um período prolongado de tempo em cultura, só foi observada necrose limitada após quatro dias de cultura (isto é, o equivalente a um dia 1 pós-natal do coração). O protocolo original, como é realizada utilizando brotos pulmonares embrionárias, 10 relataram não necrose, mas também pulmões utilizados a partir de embriões anteriores encenadas. Assim, necrose pode ser evitada pela restrição estudos para pontos de tempo mais cedo embrionárias.
Este sistema de cultura ex vivo não tem limitações. Após dois dias em cultura, o epicárdio começa a propagação da matriz, e dentro de quatro dias, o epicárdio atribui ao prato de cultura. Porque a conseqüência epicardial does não afeta a visualização, no entanto, este problema pode ser de primordial importância para os estudos do epicárdio. Nos estágios aqui analisado (E14.5-E16.5), o epicárdio tem muito que englobava o coração 11 e desde sinais para o desenvolvimento do plexo 12, assim, o seu crescimento não parece ter efeitos negativos sobre o plexo coronário. Além disso, o coração da cultura parecem parar de crescer maior, como em vias seu útero. Outra limitação é que o coração de rato embrionário não é transparente como o embrião do peixe-zebra. Qualquer visualização vivo é, portanto, limitada ao que pode ser observada nas camadas exteriores do coração. No entanto, um marcador endotelial suficientemente vivo pode permear o coração para rotular algum do plexo coronária e é visível em cultura.
Apesar destas limitações, podemos antecipar que este método de cultura ex vivo irá ser útil para uma série de aplicações. A ampla variedade de linhas de ratinhos transgénicos que carrory tipos de células marcadas com fluorescência pode ser facilmente utilizado para avaliar diferentes aspectos do desenvolvimento, utilizando imagens de lapso de tempo. Além disso, o tratamento de coração embrionário ex vivo com os compostos moleculares pequenos, se nova ou já em utilização clínica deverão ser fáceis de realizar e simula como terapias de droga são aplicados nos seres humanos.
Em conclusão, nós adaptamos um método de cultura ex vivo para o coração embrionário mouse. Esta técnica permite o acesso fácil aos órgãos inacessíveis, tais como o fígado ou os rins, durante o desenvolvimento e permitirá a manipulação e análise directo destes órgãos.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Andrea Portbury para a leitura crítica do manuscrito e do NIH (Grant # R01HL061656) para apoio financeiro.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
References
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