Summary
Исследованиях развития у мышей препятствует недоступность эмбриона во время беременности. Способствовать долгосрочных культуры эмбриональном сердце на поздних стадиях беременности, мы разработали протокол, в котором вырезали сердце культивируют в полутвердых, разбавленных Матригель.
Abstract
Исследованиях развития у мышей препятствует недоступность эмбриона во время беременности. Таким образом, протоколы, чтобы изолировать и культуры отдельных органов интереса имеют важное значение в создании способа обоих визуализации изменений в развитии и позволяя стратегии нового лечения. Способствовать долгосрочных культуры эмбриональном сердце на поздних стадиях беременности, мы разработали протокол, в котором вырезали сердце культивируют в полутвердых, разбавленных Матригель. Эта подложка обеспечивает достаточную поддержку, чтобы поддерживать трехмерную структуру, но является достаточно гибкой, обеспечивая дальнейшее сокращение. Короче говоря, сердца вырезали из зародыша и помещают в смесь холодной Матригель разводили 1:1 ростовой среды. После разбавленной Матригель затвердевает, ростовой среде добавляют в чашку для культивирования. Сердца вырезали еще в эмбриональный день 16,5 были жизнеспособны в течение четырех дней после вскрытия. Анализ коронарных сплетения показывает, что этот метод ненарушить коронарных сосудов развития. Таким образом, мы представляем новый метод долгосрочного культуры эмбриональных сердцах.
Introduction
За последние годы трансгенных мышей была преобладающей модельной системой для изучения пороки развития сердца. Тем не менее, другие организмы модели, такие как данио, оказались иметь значительные преимущества по сравнению мыши. Три основных преимущества данио являются внешними кладку яиц, для облегчения доступа к эмбрионов; оптической прозрачности эмбрионов, что позволяет легко визуализировать развития сердца и простота применения низкомолекулярных лечения, чтобы модулировать развитие эмбриона 1. Таким образом, развитие культуры метод, который позволил бывший внутриутробного роста эмбриональных орган в обход, по крайней мере частично, ограничения в настоящее время сталкиваются исследователи, изучающие процессы развития у трансгенных мышей.
Экс естественных сердечной системы культуры были разработаны как в куриных эмбрионов мыши и которые позволяют обработки с малыми молекулами и анализ того, как различferent области сердца связь 2-6. Для целой культуре сердце мыши, сердца, взятых из эмбрионов до эмбриональных (E) 12,5 возраста могут быть размещены в культуральной среде с или без раскачивания 2,3,5. При использовании этого метода, эмбриональные сердца были успешно инкубировали в эквивалентности E13.5, и сердца культивировали с качалки были сохранены в течение трех дней (начиная с Е10.5) 3. Тем не менее, никаких исследований не сообщили об успешном культуру сердца из старых эмбрионов. Кроме того, спасательные эксперименты были ограничены применением терапевтического агента глобально в культуральную среду 2.
Система срез культуры, в котором сердца вырезали, встроенные, и секционные использованием Vibratome, также была использована как для младших сердца, таких как мыши Е12.5 сердца и гамбургер-Гамильтона этап 36 (примерно E16 у мышей) куриного сердца 2,4,6, и старше сердца, таких как послеродовое и взрослой мыши чearts и сердца взрослого человека 7,8. В то время как эмбриональная анализы обычно используется 150-мкм срезы толщиной 2,4, толщина сечения может быть большим, чем 500 мкм без признаков кислородного голодания 8. Эти срез культуры были сохранены в течение двух месяцев в области культуры, с большинством ломтиками поддержание сократительной протяжении всего этого периода 9. По сравнению с исследований в отдельных кардиомиоцитов, эти срез культуры позволить совместного культивирования кардиомиоцитов с соседними типами клеток и обеспечивает полезный способ бывший анализ естественных условиях. Тем не менее, эти культуры требуют более сложные настройки, чем просто поместив сердце в культуральной среде (например, встраивание живого сердца для резки на Vibratome) и любой анализ, очевидно, ограничена часть сердца внутри раздела.
Учитывая описанные выше ограничения для культивирования эмбриональных сердцах мыши и богатство трансгенных мышей AVAтестированию нет доступа для исследования, мы разработали бывших естественных условиях сердце мышей культуры системы, подобной бывших естественных легких культуре система, разработанная Уивер, и др.. культуры 10 Наша система позволяет долгосрочное культуры и визуализации ремоделирования коронарного кровообращения в целом эмбрионального сердца мыши. Кроме того, использование Матригель позволяет бисера, который состоится в месте недалеко от центра, обеспечивая тем самым локализованные лечения терапевтических агентов. Эти эксперименты могут быть выполнены в различных временных точках развития сравнить эффект данного лечения на процесс, такой как коронарные артерии образование. Поскольку малые молекулы могут диффундировать через Матригель, эта культура система может быть также использована для культуры расчлененный области сердца рядом друг с другом, чтобы определить, является ли конкретный межклеточных контактов необходимы для определенных процессах развития или же паракринных сигналов от одной области к другой необходимо.
Эта культура системыотносительно проста и, в отличие от системы культуры ломтик, использует основные реагенты культуры и установок, которые легко доступны в большинстве лабораторий. Короче говоря, вырезали эмбрионального сердца культивируют в разбавленной Матригель, что обеспечивает полу-твердом носителе. Эта поддержка является достаточным для поддержания трехмерной морфологии сердца, а также позволяет сжатие сердца. Используя эту систему, всем сердцем из старых мышиных эмбрионов (E14.5-E16.5), может поддерживаться в культуре на срок до четырех дней. Все коронарное сплетения поддерживается, в отличие от срез культуры, поэтому любые сигналы сигнализации, которые происходят из разных регионов сердце сохранит свое присутствие. Кроме того, живых клеток флуоресцентные красители могут проникать Матригель, чтобы позволить визуализации живого сердца, и белок конъюгированные гранулы могут быть размещены вблизи сердца, чтобы обеспечить локализованный источник сигнализации. Вместе эти преимущества делают этот метод идеальным методом для изучения процессов развития эмбрионаIC сердце мыши.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Вырезанием Эмбриональные сердца
- Усыпить тайм-беременные мыши на нужной день эмбрионального развития с использованием утвержденной эвтаназии технику. Все эксперименты были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилл.
- Обильно распылить женщин с 70% этанола до вскрытия. Откройте брюшную полость самки для получения и акцизных роге матки.
- Поместите рога матки в чашку Петри, содержащую холодный 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) и полоскание по мере необходимости. Разрезать рог матки через среднюю линию, чтобы открыть прилагаемый эмбриональных мешков.
- Разрежьте зародышевого мешка и извлечения эмбриона. Поместите эмбриона во второй чашке Петри с холодным PBS. Вернуться чашки Петри с роге матки в лед.
- Обезглавить эмбриона для улучшения доступа к грудной стенке. Если генотипирования необходимо, снимите и сохраните хвост в пробирку Эппендорф помещают на лед.
- Сэмбриона на спине, разрезать грудную стенку для визуализации сердца и легких. В зависимости от стадии, грудной стенки может быть прозрачным.
- Осторожно поднимите сердца с помощью щипцов и перерезал сосуды ниже. Затем на голову выше магистральных сосудах, чтобы освободить сердце. При необходимости, удалить посторонние ткани.
- Поместите сердца в одну лунку в 24-луночный планшет, заполненного холодной PBS и поместите блюдо на льду.
- Повторите предыдущие шаги, пока сердце не был вырезан из всех эмбрионов.
2. Культура настройка
- В ламинарном капот, объединять холодный Матригель и желаемого культуральной среды (например, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в модифицированной Eagle Дульбекко среде Игла (DMEM)) в соотношении 1:1. Не предварительно теплой культуральной среды.
- Хранение разбавленных Матригель на льду, пипетка 500-1000 мкл разбавленного раствора в лунку 24-луночного чашку для культивирования, которая сохраняется на льду.
- В кожухе, осторожно подобрать и разместить вырезалиСердце в скважине Матригель содержащей культуральную чашку, держа чашку для культивирования на льду.
- Если ориентация встроенных сердца имеет решающее значение: Обильно распылить инвертированный микроскоп и окружающего пространства с 70% этанола. В капюшоне, поместите вырезали сердце в лунку Матригель культуры, содержащей пластину в то же время на льду. Затем поместите пластину на микроскоп и быстро ориентироваться вырезали сердце, как Матригель начинает затвердевать.
- Место культуры блюдо в увлажненной 37 ° C инкубаторе (5% CO 2) и позволяют Матригель укрепить в течение приблизительно 30 мин.
- Добавляют 1 мл предварительно нагретой питательной среды в каждую лунку, содержащую сердца.
- Сердца может оставаться в культуре в течение по крайней мере четырех дней. Изменение в культуральную среду каждые два дня рекомендуется.
3. Фиксация и визуализация
- При желании добавить флуоресцентный живых клеток краситель (например, Сыто-16), чтобы визуализировать живые сердца. Фото будетограничивается стороне сердца, которая является видимой на основе положения, в котором он был внедрен.
- Если после культивирования анализ (например визуализаацию крепления или секционирования) будут выполнены, удалите культуральной среды и заменить холодные 4% формальдегида. Положите блюдо на льду в течение 30 мин.
- После холодного формальдегида и льда стимулировать растворение Матригель, замените фиксатор (и Матригель) свежей формальдегида и исправить сердца в течение ночи при 4 ° С.
- Вымойте сердца буфер (например, PBS или Трис) и хранить при температуре 4 ° С до дальнейшего анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При использовании этого метода, сердце сохраняет свою трехмерную морфологии и остаются жизнеспособными, как показано продолжение сокращений (фильм 1). Эти сокращения являются последовательно более заметным в предсердиях, чем в желудочках. После культуры, сердца может быть зафиксирован и обрабатываются как для иммуногистохимии или гистологии для рассмотрения конкретных экспрессии маркеров или структур. На фиг.1А показан базовый желудочков и магистральных артерий эмбриональном сердце мыши, который культивировали в течение 24 ч, фиксированы, и обработаны для иммуногистохимии для обозначения эндотелия. Эти конфокальной микрофотографии показывают, что коронарных артерий появляется похожий на сердце вырезали из сравнительно возрасте эмбрион, который поддерживался в внутриутробно (рис. 1В). Тем не менее, коронарных сосудов в сердце культурной бывших естественных условиях делают кажутся меньшими, чем в сердце, которое поддерживается в период внутриутробного развития. В обоих сердцах, тыс.электронной верхушки желудочка были удалены, чтобы лучше доступ антител к ткани.
Гематоксилином и эозином (H & E) Анализ сердца вырезали в E16.5 и культивировали в естественных условиях бывший в течение 4 показывает, что общее морфологии, включая стены магистральных сосудов (2А) и желудочка и межжелудочковой перегородки миокарда (рис. 2В) сердце остается нетронутым. Несмотря на отсутствие кровообращения, коронарной Остии очевидны (рис. 2А). Тем не менее, фрагментация ДНК, наблюдается как с H & E (рис. 2А, 2В) и DAPI (данные не показаны), проявляется в компактном миокарде и вокруг крупных сосудов. Кроме того, миокард менее плотная по сравнению с сердцем от E18.5 эмбрионов, которые развивались в внутриутробно (рис. 2в, 2г), хотя экс естественных условиях культурной сердце еще билось. Таким образом, существуют ограничения на длинувремени, в течение или стадии, на которой эти сердца может быть сохранен.
Эта культура метод может быть также использован для обозначения флуоресцентно сердца в то время как в культуре. В этом случае, сердца культивировали в течение 48 ч после инкубации с эндотелиальными конкретных флуоресцентным красителем. В этом случае, визуализации ограничена на основе ориентации сердца и непрозрачность ткани (фиг. 3А, 3В). Однако последующие гистологических срезов через миокарде подтвердить, что это флуоресцентные молекулы могут проникать через наружный слои ячейки для обозначения суб-эпикарда сосудов в желудочки (фиг. 3C, 3D), и эта флуоресцентным красителем локализуется с изо-лектин (фиг. 3D).
Рисунок 1. Развитие кажется нормальным в условиях бывших естественных условиях. (А) Через 24 ч в культуре, экс виво сердца от E14.5 эмбрионы были фиксированными, меченные эндотелиальный маркер (зеленый), очищена, и полученную с использованием конфокальной микроскопии. Легочной артерии (ПА), аорты (Ао) и основания сердца показаны. (B) Сердечки вырезали из E15.5 эмбрионов, которые разработаны внутриутробно были так же обрабатывается. Шкала бар, 100 мкм.
Рисунок 2. Морфология грубо поддерживаться во время бывшего Vivo культуры. (A, B) Сердечки вырезали из E16.5 эмбрионах и культуре бывших естественных условиях в течение 4 дней. Сердца были затем срезы и окрашивали гематоксилином и эозином (H & E). (A) поперечное сечение показывает выравнивание аорты (Ао) и легочной артерии (ПА). Один из устьев коронарных (стрелка) является видимым. Миокарде Surокругление аорты менее плотный, чем в контрольной (С), и некоторые фрагментация ядер (стрелка) также присутствует. (B) общей морфологии компактного миокарда желудочков и межжелудочковой перегородки (IVS) кажется нормальной, но миокарда менее плотным, чем в контрольной (D), а некоторые фрагментация ядер (стрелка) проявляется в ИВС. (С, D) для сравнения фронтальной H & E-окрашенных срезов от E18.5 сердца показаны. (C) коронарной устье наблюдается прилегающей к Ао (стрелка). (D) межжелудочковой перегородки корректно. Шкала бар, 70 мкм.
Рисунок 3. Экс естественных сердца могут быть флуоресцентно меченных во культуры. (A, B) После 48 часов в культуре, экс естественных условиях от сердцаE16.5 эмбрионы инкубировали с Сыто 16 (зеленый) в течение 1 ч и флуоресценции можно было наблюдать, как в конце 48 ч после инкубации. (С, D) Эта флуоресценции была осуществляться через замороженных срезов и можно было наблюдать в субэпикардиального эпителиальных клеток в миокарде желудочков. В D, раздел в миокарде была совместно помечены изо-лектин (красный). Изо-лектин со-этикетки зеленый Сыто 16-позитивных клеток (стрелки), а также маркирует сосудов в миокарде, которые не окрашивают Сыто 16. AB, 4x увеличением; шкалы в CD, 120 мкм.
Фильм 1. После культивирования бывших естественных условиях в течение 30 ч, сердце вырезали из E14.5 эмбрионов показывает последовательное сократимость и ходить между предсердий и желудочков. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нынешняя система культуры создает значительные преимущества для эмбриональных исследованиях сердца мыши. Эта культура система сохраняет способность миокарда и коронарный сплетение, с ограниченным признаки некроза, даже после четырех дней в культуре. Кроме того, полутвердую матрицу обеспечивает достаточную поддержку для поддержания трехмерной морфологии развития сердечно позволяя при этом гибкость договора, а также провести покрытые гранулы в месте во время культуры. Несмотря на эту поддержку, эта матрица является проницаемой для флуоресцентные красители, такие как Сыто 16, что позволяет флуоресцентного анализа живого сердца.
Методы фрагмент культуры поместить сердце раздел, содержащий его часть коронарных сплетения, на пористую мембрану при воздух-жидкость для поддержания оксигенации через капиллярное действие 7. В отличие от предыдущего метода культуры целого сердца полагаться на качалке и ограниченные исследования эмбриональных возрастов до функционального коронарного vasculatЮр необходимо 2,3,5. Используя текущее метод, однако, сердца может быть легко культивировать после коронарного сплетение сформировал без дополнительной сложности раздела воздух-жидкость.
Несмотря на наши опасения, что конце эмбрионального сердца (например E16.5) станет некротической после длительного периода времени в культуре, лишь ограниченный некроз наблюдается после четырех дней культуры (т.е. эквивалент послеродовой день 1 сердца). Оригинальный протокол, а выполняется с использованием эмбриональной почки легких, 10 сообщили об отсутствии некроза, но также используются легкие от ранее поставил эмбрионов. Таким образом, некроз можно избежать путем ограничения исследований, ранее эмбриональных моменты времени.
Это бывшая система Vivo культуры имеет свои ограничения. После двух дней в культуре, эпикард начинает распространяться на матрице, и в течение четырех дней, эпикард придает культуре блюдо. Поскольку эпикардиальной вырост ланьы не влияют на визуализацию, однако, этот вопрос может быть первостепенное значение для эпикардиальной исследований. На этапах проанализированы здесь (E14.5-E16.5), эпикард уже давно охватила сердца 11 и при условии, сигналы на развивающихся сплетения 12, таким образом, его результат, кажется, не имеют негативного влияния на коронарные сплетения. Кроме того, в культуре сердца, могут перестать расти все больше, как и их коллеги внутриутробно. Еще одним ограничением является то, что эмбриональном сердце мыши не является прозрачной, как эмбрионов рыбок данио. Любая живая визуализации, таким образом, ограничивается тем, что можно наблюдать на внешних слоях сердца. Тем не менее, живой эндотелиальных маркер может проникать достаточно сердца, чтобы маркировать часть коронарных сплетения и видна в культуре.
Несмотря на эти ограничения, мы ожидаем, что эта бывшая метод Vivo культуры будет полезно для ряда приложений. Широкое разнообразие трансгенных мышей линии, которые автомобильRY флуоресцентно меченых типы клеток могут быть легко использованы для оценки различных аспектов развития с использованием покадровой съемки. Кроме того, лечение эмбриональными естественных бывших сердца с низкомолекулярных соединений, будь то роман или уже используется в клинической практике, будет легко сделать, и имитирует как лекарственной терапии применяются в людях.
В заключение, мы приспособили бывший метод Vivo культуры для эмбриональном сердце мыши. Эта техника обеспечивает легкий доступ к недоступным органов, таких как печень или почки, во время разработки и позволяет для манипулирования и живых анализ этих органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Андреа Портбери за критическое прочтение рукописи и NIH (грант № R01HL061656) для финансовой поддержки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
References
- Tu, S., Chi, N. C. Zebrafish models in cardiac development and congenital heart birth defects. Differentiation. 84, 4-16 (2012).
- Lavine, K. J., et al. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells. Nature. 464, 549-553 (2010).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Dev. Biol. 255, 334-349 (2003).
- Zhang, J., et al. The FGF-BMP signaling axis regulates outflow tract valve primordium formation by promoting cushion neural crest cell differentiation. Circ. Res. 107, 1209-1219 (2010).
- Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cellular Physiology and Biochemistry: international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 16, 127-132 (2005).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5, 62-66 (2009).
- Janssen, P. M., Lehnart, S. E., Prestle, J., Hasenfuss, G. Preservation of contractile characteristics of human myocardium in multi-day cell culture. J. Mol. Cell Cardiol. 31, 1419-1427 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc. Res. 93, 50-59 (2012).
- Weaver, M., Dunn, N. R., Hogan, B. L. Bmp4 and Fgf10 play opposing roles during lung bud morphogenesis. Development. , 127-2695 (2000).
- Viragh, S., Challice, C. E. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse. Anat. Rec. 201, 157-168 (1981).
- Kirby, M. L. Cardiac Development. , Oxford University Press. (2007).
- Arima, S., et al. Angiogenic morphogenesis driven by dynamic and heterogeneous collective endothelial cell movement. Development. 138, 4763-4776 (2011).
