Summary
Los estudios de desarrollo en el ratón se ven obstaculizados por la falta de acceso al embrión durante la gestación. Para promover la cultura a largo plazo del corazón embrionario en las últimas etapas de gestación, se desarrolló un protocolo en el que el corazón extirpado se cultiva en un semi-sólido, Matrigel diluido.
Abstract
Los estudios de desarrollo en el ratón se ven obstaculizados por la falta de acceso al embrión durante la gestación. Por lo tanto, los protocolos para aislar y cultivo de órganos individuales de interés son esenciales para proporcionar un método de visualización de los dos cambios en el desarrollo y permitiendo nuevas estrategias de tratamiento. Para promover la cultura a largo plazo del corazón embrionario en las últimas etapas de gestación, se desarrolló un protocolo en el que el corazón extirpado se cultiva en un semi-sólido, Matrigel diluido. Este sustrato proporciona apoyo suficiente para mantener la estructura tridimensional, pero es lo suficientemente flexible para permitir la contracción continua. En breve, los corazones se escinden a partir del embrión y se colocaron en una mezcla de Matrigel frío diluido 1:1 con medio de crecimiento. Después de la Matrigel diluido se solidifica, se añade medio de cultivo a la placa de cultivo. Corazones extirpados tan tarde como el día embrionario 16,5 eran viables durante cuatro días después de la disección. Análisis del plexo coronaria demuestra que este método no haceinterrumpir el desarrollo vascular coronaria. Por lo tanto, se presenta un nuevo método para el cultivo a largo plazo de los corazones embrionarias.
Introduction
En los últimos años, el ratón transgénico ha sido el sistema de modelo predominante para el estudio de defectos cardíacos de desarrollo. Sin embargo, otros organismos modelo, tales como el pez cebra, han demostrado tener ventajas significativas sobre el ratón. Tres principales ventajas de la pez cebra son la colocación externa de los huevos, para la facilidad de acceso a los embriones; la transparencia óptica de los embriones, lo que permite una fácil visualización del desarrollo cardíaco, y la facilidad de la aplicación de tratamientos moleculares pequeños para modular el desarrollo del embrión 1. Por lo tanto, el desarrollo de una técnica de cultivo que permitió el crecimiento ex útero de un órgano embrionario pasaría por alto, al menos en parte, las limitaciones actualmente experimentadas por los investigadores que estudian los procesos de desarrollo en ratones transgénicos.
Sistemas de cultivo cardíacos ex vivo se han desarrollado en tanto que el polluelo y embrión de ratón que permiten el tratamiento con pequeñas moléculas y análisis de cómo las diferentesrentes regiones del corazón comunican 2-6. Para el conjunto de la cultura corazón de ratón, corazones tomadas de embriones hasta embrionario (E) 12,5 de edad se puede colocar en medio de cultivo con o sin balanceo 2,3,5. Usando esta técnica, corazones embrionarias se han incubado con éxito a la equivalencia de E13.5, y corazones cultivadas con balanceo se han mantenido tanto tiempo como tres días (a partir de E10.5) 3. Sin embargo, no hay estudios han informado de la cultura éxito de los corazones de los embriones más viejos. Del mismo modo, los experimentos de rescate se han limitado a la aplicación del agente terapéutico a nivel mundial para el medio de cultivo 2.
Un sistema de cultivo de cortes, en el que se extirparon los corazones, incrustados, y se seccionaron utilizando un vibratomo, también se ha utilizado para ambos corazones más pequeños, tales como corazones de ratón E12.5 y Hamburger-Hamilton etapa 36 (aproximadamente E16 en el ratón) de pollo corazones 2,4,6, y más corazones, como postnatal y adulto del ratón hearts y corazones humanos adultos 7,8. Si bien los análisis embrionarias han utilizado típicamente secciones gruesas de 150 micras 2,4, espesor de corte puede ser un gran hasta 500 micras, sin evidencia de la falta de oxígeno 8. Estos cultivos de corte se han mantenido hasta dos meses en la cultura, con la mayoría de las rebanadas mantener la contractilidad durante todo este período 9. En comparación con estudios en cardiomiocitos aislados, estos cultivos de cortes permiten que el co-cultivo de cardiomiocitos con sus tipos de células vecinas y proporcionan un método útil para el análisis ex vivo. Sin embargo, estos cultivos requieren más elaborado configuración que simplemente colocar un corazón en el medio de cultivo (por ejemplo, incrustar el corazón vivo para seccionar en un vibratome), y cualquier análisis es, obviamente, limitado a la porción del corazón dentro de la sección.
Dadas las limitaciones descritas anteriormente para el cultivo de embriones de ratón de los corazones y la riqueza de los ratones transgénicos available para estudio, hemos desarrollado un ratón sistema de cultivo ex vivo de corazón similar a un sistema de cultivo ex vivo de pulmón desarrollado por Weaver, et al. 10 Nuestro sistema de cultivo permite cultivo a largo plazo y la visualización de la circulación coronaria remodelación dentro de corazones enteros embrionarias de ratón. Además, el uso de perlas de Matrigel permite que se mantienen en su lugar cerca del corazón, proporcionando de este modo un tratamiento localizado con agentes terapéuticos. Estos experimentos se pueden realizar en diferentes puntos de tiempo de desarrollo para comparar el efecto de un tratamiento dado en un proceso tal como la formación de la arteria coronaria. Debido a que las pequeñas moléculas pueden difundir a través de Matrigel, este sistema de cultivo también se puede utilizar para cultivo de regiones disecadas del corazón cerca unos de otros para determinar si los contactos célula-célula específicos son necesarios para ciertos procesos de desarrollo o si la señalización paracrina de una región a la otra es necesario.
Este sistema de cultivoes relativamente simple y, a diferencia del sistema de cultivo de cortes, hace uso de los reactivos de cultivo básicas y configuraciones que son fácilmente disponibles en la mayoría de los laboratorios. En breve, los corazones embrionarios extirpados se cultivan en Matrigel diluido, que proporciona un soporte semisólido. Este apoyo es suficiente para mantener la morfología tridimensional del corazón mientras que también permite la contracción del corazón. El uso de este sistema, corazones enteros de embriones de ratón E14.5 (mayores-E16.5) se pueden mantener en cultivo durante hasta cuatro días. El plexo coronaria entera se mantiene, a diferencia de los cultivos de cortes, por lo que cualquier señales de señalización que se producen a partir de diferentes regiones del corazón siguen presentes. Además, los tintes fluorescentes de células en vivo pueden permear el Matrigel para permitir la visualización del corazón vivo, y perlas de proteína-conjugados se pueden colocar cerca del corazón para proporcionar una fuente localizada de señalización. En conjunto, estas ventajas hacen de esta técnica un método ideal para el estudio de los procesos de desarrollo en el embriónic corazón de ratón.
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Protocol
1. Escisión los corazones embrionarias
- La eutanasia a un ratón de disolución-embarazada en el día embrionario deseado usando una técnica de eutanasia aprobada. Todos los experimentos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.
- Rocíe la hembra con etanol al 70% antes de la disección. Abra la cavidad abdominal de la hembra para recuperar y extirpar la trompa uterina.
- Coloque el cuerno uterino en una placa de Petri que contiene frío 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) y enjuague según sea necesario. Cortar el cuello uterino a través de la línea media para exponer los sacos embrionarios adjuntos.
- Cortar un saco embrionario y recuperar un embrión. Coloque el embrión en una segunda placa de Petri con PBS frío. Devuelva la placa de Petri con el cuerno uterino en hielo.
- Decapita el embrión para mejorar el acceso a la pared torácica. Si genotipado es necesario, retire y guarde la cola en un tubo Eppendorf se coloca en hielo.
- Con elembrión en su parte posterior, cortada abrir la pared torácica para visualizar el corazón y los pulmones. Dependiendo de la etapa, la pared torácica puede ser transparente.
- Levante con cuidado el corazón con las pinzas y cortar los vasos a continuación. Luego, corte por encima de los grandes vasos para liberar el corazón. Si es necesario, eliminar los tejidos extraños.
- Coloque el corazón en un pocillo de una placa de 24 pocillos llena con PBS frío y colocar el plato en hielo.
- Repita los pasos anteriores hasta que los corazones han sido extirpados de los embriones.
2. Cultura Set-up
- En una campana laminar, combinar Matrigel frío y el medio de cultivo deseado (por ejemplo, 10% de suero bovino fetal (FBS) en Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)) en una proporción de 1:1. No te pre-calentar el medio de cultivo.
- Mantener el Matrigel diluido en hielo, pipeta 500-1.000 l de la solución diluida en un pocillo de una placa de cultivo de 24 pocillos que también se mantiene en hielo.
- En la capilla, elige con cuidado y coloque la extirpadocorazón en un pocillo de la placa de cultivo que contiene Matrigel mientras se mantiene la placa de cultivo en hielo.
- Si la orientación del corazón incrustado es crucial: rociar generosamente un microscopio invertido y el espacio circundante con etanol al 70%. En la campana, colocar el corazón extirpado en un pocillo de la placa de cultivo que contiene Matrigel mientras que todavía en el hielo. Luego, coloque la placa en un microscopio y orientar rápidamente el corazón extirpado como Matrigel comienza a solidificarse.
- Coloque la placa de cultivo en un 37 ° C humidificado incubadora (5% CO 2) y permitir que el Matrigel se solidifique durante aproximadamente 30 min.
- Añadir 1 medio de cultivo pre-calentado ml a cada pocillo que contiene un corazón.
- Los corazones pueden mantenerse en cultivo durante al menos cuatro días. Se recomienda cambiar el medio de cultivo cada dos días.
3. La fijación y visualización
- Si lo desea, agregue un colorante fluorescente de células vivas (por ejemplo Syto-16) para visualizar el corazón vivo. Fotografía estarálimitado a la parte del corazón que es visible sobre la base de la posición en la que se ha incrustado.
- Si se realizaron análisis post-cultivo (por ejemplo, formación de imágenes de todo el montaje o seccionar), eliminar el medio de cultivo y reemplazar con formaldehído 4% frío. Coloque el plato en hielo durante 30 min.
- Después de que el formaldehído frío y el hielo promover la disolución de la Matrigel, reemplazar el fijador (Matrigel) con formaldehído fresco y fijar corazones durante la noche a 4 ° C.
- Lavar los corazones con tampón (por ejemplo, PBS o Tris) y se almacena a 4 ° C hasta su posterior análisis.
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Representative Results
Usando esta técnica, el corazón mantiene su morfología tridimensional y sigue siendo viable, como se indica por las contracciones continuas (Película 1). Estas contracciones son consistentemente más prominente en las aurículas que en los ventrículos. Después del cultivo, los corazones pueden ser fijadas y procesadas para la histología o inmunohistoquímica ya sea para examinar la expresión o estructuras marcador específico. Figura 1A muestra la base de los ventrículos y las grandes arterias de un corazón embrionario de ratón que se cultivó durante 24 horas, se fijaron, y se procesaron para inmunohistoquímica para etiquetar el endotelio. Estas micrografías confocal demuestran que la vasculatura coronaria parece similar a un corazón extirpado de un embrión de edad comparable que se mantuvo en el útero (Figura 1B). Sin embargo, los vasos coronarios en el corazón cultivadas ex vivo hacen aparecer más pequeño que en el corazón que se mantuvo en el útero. En ambos corazones, thSe eliminaron e ápices de los ventrículos para permitir un mejor acceso de los anticuerpos a los tejidos.
Hematoxilina y eosina (H & E) análisis de los corazones extirpados en E16.5 y cultivadas ex vivo durante 4 días demuestra que la morfología general, incluyendo las paredes de las grandes arterias (Figura 2A) y ventriculares y septal interventricular miocardio (Figura 2 B) del el corazón permanece intacto. A pesar de la falta de circulación, los orificios coronarios son evidentes (Figura 2A). Sin embargo, la fragmentación del ADN, observó tanto con H & E (figuras 2A, 2B) y DAPI (datos no mostrados), es aparente en el miocardio compacto y alrededor de los grandes vasos. Además, el miocardio es menos densa en comparación con un corazón de un embrión E18.5 que se desarrolló en el útero (figuras 2C, 2D), a pesar de que el cultivo ex vivo de corazón todavía latía. Por lo tanto, hay limitaciones a la longitudde tiempo o de la etapa en que se pueden mantener estos corazones.
Esta técnica de cultivo también se puede utilizar para etiquetar los corazones con fluorescencia mientras que en la cultura. En este caso, los corazones se cultivan durante 48 horas después de ser incubadas con un colorante fluorescente endotelial específico. En este caso, la visualización se limita sobre la base de la orientación del corazón y la opacidad del tejido (Figuras 3A, 3B). Sin embargo, las secciones histológicas subsiguientes a través del miocardio ventricular confirman que esta molécula fluorescente puede penetrar en las capas exteriores de células para etiquetar recipientes sub-epicárdicas dentro de los ventrículos (Figuras 3C, 3D), y este colorante fluorescente colocaliza con iso-lectina (Figura 3D).
Figura 1. Desarrollo parezca normal en condiciones ex vivo. (A) Después de 24 horas de la cultura, corazones ex vivo de E14.5 embriones fueron fijados, etiquetados con un marcador endotelial (verde), borran, y la imagen con la microscopía confocal. Se muestra la arteria pulmonar (AP), aorta (Ao), y la base del corazón. (B) los corazones extirpados de E15.5 embriones que se desarrollaron en el útero fueron procesadas de manera similar. Barra de escala, a 100 m.
Figura 2. Morfología se mantiene groseramente durante el cultivo ex vivo. (A, B) los corazones fueron extirpados de embriones E16.5 y cultivadas ex vivo durante 4 días. Los corazones fueron entonces seccionadas y teñidas con hematoxilina y eosina (H & E). (A) Una sección transversal que muestra la alineación de la aorta (Ao) y la arteria pulmonar (AP). Uno de los orificios coronarios (punta de flecha) es visible. El miocardio surredondeo de la aorta es menos denso que en el control (C), y algunos fragmentación nuclear (flecha) también está presente. (B) La morfología general del miocardio compacta de los ventrículos y el tabique interventricular (SIV) parece normal, pero el miocardio es menos denso que en el control (D), y algunos fragmentación nuclear (flecha) es aparente en el IVS. (C, D) Para la comparación, frontal H & E-manchado secciones de un corazón E18.5 se muestran. (C) Un ostium coronario se observa adyacente a la Ao (punta de flecha). (D) El septo interventricular está bien definido. Barra de escala, 70 micras.
Figura 3. Ex corazones in vivo pueden ser marcadas con fluorescencia durante el cultivo. (A, B) Después de 48 horas de la cultura, corazones ex vivo deE16.5 embriones se incubaron con Syto 16 (verde) durante 1 hora, y la fluorescencia se puede observar tan tarde como 48 horas después de la incubación. (C, D) Esta fluorescencia se mantiene a través de seccionado congelado y se pudo observar en las células epiteliales subepicárdica dentro del miocardio ventricular. En D, la sección dentro del miocardio ventricular se co-etiquetado con iso-lectina (rojo). Los compañeros de etiquetas iso-lectina las células verdes Syto 16-positivas (flechas) y también las etiquetas de los vasos dentro del miocardio que no se tiñeron con Syto 16. AB, magnificación 4x, barra de escala en CD, 120 m.
Movie 1. Tras el cultivo ex vivo durante 30 horas, un corazón extirpado de un embrión E14.5 muestra la contractilidad y el ritmo constante entre las aurículas y los ventrículos. Haga clic aquí para ver la película .
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Discussion
El sistema de cultivo actual plantea importantes ventajas para estudios cardíacos embrionarios de ratón. Este sistema de cultivo conserva la contractilidad miocárdica y el plexo coronaria, con signos de necrosis limitadas, incluso después de cuatro días en cultivo. Además, la matriz semisólida proporciona el apoyo suficiente para mantener la morfología tridimensional del corazón en desarrollo al tiempo que permite flexibilidad para contrato y también para mantener perlas recubiertas en su lugar durante el cultivo. A pesar de este apoyo, esta matriz es permeable a los colorantes fluorescentes tales como Syto 16, lo que permite el análisis fluorescente de la corazón vivo.
Métodos de cultivo de cortes de colocar la sección del corazón, que contiene su porción del plexo coronaria, sobre una membrana porosa en una interfase aire-líquido para mantener la oxigenación a través de la acción capilar 7. Por el contrario, los métodos de cultivo de todo corazón anteriores se basan en estudios de balanceo y se limita a las edades embrionarias antes de vasculat coronaria funcionalUre es necesario 2,3,5. Utilizando la técnica actual, sin embargo, los corazones pueden ser cultivadas fácilmente después del plexo coronaria se ha formado sin la complejidad adicional de una interfaz aire-líquido.
A pesar de nuestras preocupaciones de que finales de los corazones embrionarias (por ejemplo, E16.5) se convertirían en necrótico después de un período prolongado de tiempo en cultivo, sólo se observó necrosis limitada después de cuatro días de cultivo (es decir, el equivalente de un día postnatal 1 corazón). El protocolo original, tal como se realizó usando las yemas pulmonares embrionarias, 10 no informó necrosis, sino también los pulmones de los embriones utilizados por etapas anteriores. Por lo tanto, la necrosis puede ser evitado mediante la restricción de los estudios a los puntos de tiempo embrionarias antes.
Este sistema de cultivo ex vivo tiene sus limitaciones. Después de dos días en la cultura, el epicardio se inicia la difusión de la matriz, y dentro de cuatro días, el epicardio se une a la placa de cultivo. Porque la consecuencia epicárdica does no afecta a la visualización, sin embargo, este problema puede ser de gran importancia para los estudios epicárdicas. En las etapas analizadas en este documento (E14.5-E16.5), el epicardio hace tiempo que abarca el corazón 11 y proporciona señales a la del plexo desarrollo de 12, por lo que su extensión no parecen tener efectos negativos sobre el plexo coronaria. Además, el corazón de la cultura parecen dejar cada vez más grande al igual que su contraparte en el útero. Otra limitación es que el corazón embrionario del ratón no es transparente como el embrión de pez cebra. Cualquier visualización en vivo está por lo tanto limitada a lo que se observa en las capas externas del corazón. Sin embargo, un marcador endotelial vivo suficientemente pueden permear el corazón para etiquetar algunos de los plexo coronaria y es visible en la cultura.
A pesar de estas limitaciones, anticipamos que este método de cultivo ex vivo será útil para un número de aplicaciones. Líneas de la gran variedad de ratones transgénicos que cochery tipos de células marcadas con fluorescencia pueden ser fácilmente utilizados para evaluar diferentes aspectos del desarrollo utilizando time-lapse. Además, el tratamiento de los corazones de embriones ex vivo con compuestos moleculares pequeños, ya sea nueva o ya en uso clínico, serán fáciles de lograr y imita cómo se aplican los tratamientos farmacológicos en humanos.
En conclusión, hemos adaptado un método de cultivo ex vivo para el corazón de embriones de ratón. Esta técnica permite un fácil acceso a los órganos de otro modo inaccesibles, tales como el hígado o el riñón, durante el desarrollo y permitirá la manipulación y análisis en vivo de estos órganos.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Andrea Portbury para la lectura crítica del manuscrito y el NIH (subvención # R01HL061656) de apoyo financiero.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
References
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