Summary
在鼠标发展研究的胚胎在妊娠期间的交通不便阻碍了。为了促进长期培养的胚胎心脏在妊娠后期，我们开发了一种半固体，稀基底膜培养协议，其中切除心脏。
Abstract
在鼠标发展研究的胚胎在妊娠期间的交通不便阻碍了。因此，协议隔离，，培养个别器官还提供一种方法，都可视化的发展变化，并允许新的治疗策略是必不可少的。为了促进长期培养的胚胎心脏在妊娠后期，我们开发了一种半固体，稀基底膜培养协议，其中切除心脏。这基板提供了足够的支持，以维持三维结构，但有足够的灵活性允许继续收缩。简单地说，心从胚胎中切下，并冷基质胶的混合物放置在1:1稀释的生长培养基中。稀释的基质胶固化后，加入生长培养基的培养皿中。四天后解剖切除的晚期胚胎16.5天心是可行的。冠状动脉丛分析表明，该方法不扰乱冠状动脉血管发育。因此，我们提出了一种新的方法长期培养胚胎的心。
Introduction
近年来，已经成为了主要的转基因小鼠模型系统的研究开发心脏缺损。然而，其他的模型有机体，如斑马鱼，已被证明具有显着优于鼠标。三大优点的斑马鱼的外部铺设的鸡蛋，易于获得胚胎的胚胎的光学透明性，它可以轻松地可视化心脏发育;和便于应用小分子治疗调节胚胎的发育1。因此，文化技术的发展，使子宫外生长的胚胎器官将绕过，至少部分，目前研究转基因小鼠的发育过程中所经历的限制。
体外心脏培养系统已经开发了小鸡和小鼠胚胎中，使治疗用小分子，并分析如何不同心脏ferent地区沟通2-6。对于整个小鼠心脏培养，心取自胚胎的胚胎（E）12.5岁可以放置在培养基中有或无摆动2,3,5。使用这种技术，胚胎的心已被成功地培养的E13.5适合，只要3天（E10.5）3保持用摆动心培养。但是，没有研究已经报道了从旧的胚胎培养成功的心。同样，救援实验一直局限于，应用治疗剂的培养基2的全局。
切除心中，嵌入式和使用一个vibratome切片，一片文化体系，也被用于两个年轻的心，如E12.5小鼠心脏和汉堡 - 汉密尔顿36期（约在鼠标E16）小鸡心2,4,6，和老的心，如产后和成年小鼠H电子艺术和成人人心7,8。虽然胚胎分析通常使用150微米厚的部分2,4，截面厚度可以是一个伟大的为500微米，没有证据表明缺氧8。这些切片文化一直保持，只要培养两个月，与大多数片保持收缩整个这个期间9。在孤立的心肌细胞的研究相比，这些切片培养允许与它们相邻的类型的细胞的心肌细胞的共培养物，并提供一种有用的方法，用于体外分析。然而，这些文化需要更精细的设置不是简单地放置一个心培养液中（ 例如，一个vibratome切片嵌入活的心），显然是有限的，任何人分析的段内的部分的心。
鉴于上述限制，培养小鼠胚胎的心和丰富的转基因小鼠AVA研究ilable，我们开发了体外小鼠心脏文化系统类似韦弗开发体外肺癌文化的系统， 等。10我们的文化系统允许在整个胚胎小鼠心脏重塑冠状动脉循环的长期培养和可视化。此外，基质胶的使用允许心脏的地方附近的内举行的有孔玻璃珠，从而提供了一种局部治疗与治疗剂。在这些实验中，可以执行在不同发育时间点上的过程中，如冠状动脉形成比较一个给定的治疗效果。因为小分子可以通过基底膜扩散，该培养系统也可以用于培养解剖区域的心彼此靠近，以确定是否特定的细胞 - 细胞接触所必需的某些发育过程中，还是旁分泌信号从一个地区到另一个是必要的。
这种文化系统是相对简单的，和不同的切片培养系统，利用基本培养试剂和设置在大多数实验室都是现成的。总之，切除胚胎的心培养稀基底膜，它提供了一种半固体的支持。这种支持是足以维持心脏的三维形态，同时也使心脏收缩。使用这个系统，整个的心从旧的小鼠胚胎（E14.5-E16.5）可以维持在文化，长达四天。整个冠状动脉丛维持，不像切片文化，所以，任何信令发生的线索，来自不同地区的心脏仍然存在。此外，活细胞荧光染料可以渗透到基质胶允许可视化现场的心，和蛋白结合珠可以放在心脏附近，提供本地化的信号源。总之，这些优点使这种技术的理想方法研究发育过程中的胎IC小鼠心脏。
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Protocol
1。切除胚胎心
- 安乐死定时孕鼠在使用经批准的安乐死技术所需的胚胎一天。所有的实验都是在北卡罗莱纳大学教堂山分校的机构动物护理和使用委员会批准。
- 涂抹适量的喷女性解剖前，用70％乙醇。打开女性的腹腔检索和切除子宫角。
- 子宫角放置在培养皿中含有冷的1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）漂洗根据需要。剖开子宫角，通过中线暴露所附的胚胎囊。
- 剖开胚囊和检索胚胎。将胚胎在第二个培养皿用冷PBS。返回培养皿子宫角冰。
- 杀头胚胎提高访问胸壁。如果基因分型是必要的，删除和保存的尾巴在Eppendorf管置于冰上。
- 与胚胎在它的后面，切开胸壁心脏和肺的可视化。根据在舞台上，胸壁可能是透明的。
- 使用镊子小心地抬起心脏和削减以下的船只。然后，切成以上的大血管，释放心。如果有必要，去除多余的组织。
- 将心的24孔板中，充满冷PBS上的菜放在冰。
- 重复上述步骤，直到心中所有的胚胎已被切除。
2。文化集
- 在层流罩中，冷的基底膜，然后选择所需的培养基中（ 如 10％胎牛血清（FBS）的Dulbecco改进的Eagle培养基（DMEM））按1:1的比例相结合。不要预暖的培养基。
- 保持稀的基底膜上的冰，移液器500-1000微升的稀释液入井的24孔培养皿中，也保持在冰上。
- 在引擎盖，仔细挑选，并把切除心脏在一个良好的含基质胶的培养皿中，培养皿中，同时保持在冰上。
- 如果嵌入的心的取向是至关重要的：在倒置显微镜和周围的空间，用70％乙醇适量的喷。在引擎盖，放置在一个良好的含基底膜培养板切除的心脏，同时仍然在冰上。然后，将板在显微镜和快速定位切除心脏的基底膜开始凝固。
- 培养皿放置在潮湿的37℃培养箱（5％CO 2），并允许基质胶固化约30分钟。
- 加入1 ml预热的培养基以及包含心。
- 心中可以留在培养至少四天。建议改变培养基中每两天。
3。固定和可视化
- 如果需要，添加了荧光活细胞染料（ 如祥发-16）的可视化实时心脏。摄影会仅限于对心脏的一侧，基于嵌入的位置，在该位置上是可见的。
- 如果将进行培养后分析（ 如整装成像或切片），去掉培养基更换用冷的4％的甲醛。烹调放置在冰上30分钟。
- 寒冷的甲醛和冰促进基底膜的溶解后，更换新鲜的甲醛固定液（基底膜）和修复心中一夜之间在4°C。
- 洗心中的缓冲液（ 如 PBS或Tris），并存储在4°C，直到进一步的分析。
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Representative Results
使用这种技术，心脏维持其三维形态，并且仍然是可行的，如持续收缩（ 电影1）。这些始终突出在心房心室收缩。文化，心中可以固定，无论是免疫组化或组织学检查特异性标志物的表达或结构处理。 图1A显示基地，培养24小时，固定的小鼠胚胎的心脏心室和大动脉转位，并处理免疫组化标记血管内皮细胞。这些共焦的显微照片表明，冠状动脉血管切除同等岁的胚胎在子宫内 （ 图1B），保持一个心脏出现类似。然而，在培养体外心脏冠状血管出现小于保持在子宫内的心脏。在这两个心中，日ê顶点心室被拆除，以便更好地组织的抗体。
E16.5和体外培养4天的心中切除苏木精伊红（H＆E）的分析表明，整体形态，包括大动脉壁（ 图2A）和心室，室间隔心肌（ 图2B）心脏完好无损。尽管缺乏流通，冠状动脉开口明显（ 图2A）。然而，DNA片段，与H＆E染色（ 图2A，2B）和DAPI（数据未示出）的观察，可知在紧凑型心肌和大血管周围。此外，心肌从E18.5胚胎在子宫内（ 图2C，2D），即使体外培养心脏还在跳动与心脏相比密度较小。因此，是有局限性的长度在这些心的时间，或该阶段可维持。
也可以用此培养技术，荧光标记，而在培养的心。在这种情况下，心培养48小时后，与内皮细胞特异性荧光染料孵育。在这种情况下，可视化是有限的基于取向的心脏组织的不透明度（ 图3A，3B）。然而，随后通过心室心肌组织切片确认该荧光分子可以穿透外标记子心外膜心室（ 图3C，3D）的血管内的细胞层，用异外源凝集素（ 图3D），该荧光染料共定位。
图1。在体外条件下出现的正常发展。 G>（A）培养24小时后，E14.5胚胎体外心脏固定的，标有内皮标志（绿），清除，并用共聚焦显微镜成像。示肺动脉（PA），主动脉（敖），心脏的基础上，（B），切除心从E15.5胚胎在子宫内开发类似的处理。比例尺，100微米。
图2。形态被严重维持在体外培养（A，B）从E16.5胚胎体外培养4天的心被切除。心，然后切片，染色与苏木精伊红（H＆E）（A）对齐（AO）的主动脉和肺动脉（PA）的横截面。冠状动脉开口（箭头）是可见的。心肌河畔舍入主动脉密度小于对照组（C）中，也存在一些核碎裂（箭头所示）是（B）的紧凑型心肌心室和室间隔（IVS）的整体形态显示正常，但心肌密度小于控制（D），IVS的一些核碎裂（箭头）是显而易见的。 （C，D）比较，正面H＆E-染色切片从E18.5心所示。（C）观察冠状动脉口毗邻敖（箭头）。（D），室间隔定义。比例尺，70微米。
图3。 体外的心可以被荧光标记的 体外培养48小时后， 在培养过程中（A，B）心中E16.5胚胎祥发16（绿色）孵育1小时，直到48小时孵育后，可以观察到荧光（C，D），保持该荧光通过冰冻切片中可观察到心外膜下上皮细胞心室肌细胞内。在D中，部分心室肌细胞内的合作与异凝集素（红色）标记。异凝集素的共同标签的绿色祥发16阳性细胞（箭头）和标签心肌内血管，不沾祥发16。 AB，4倍放大倍率; CD比例尺，120微米。
动画1。 体外培养30小时后，从E14.5胚胎的心脏切除，显示一致的收缩力和起搏心房和心室之间。 点击这里观看电影 。
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Discussion
目前的培养体系带来了显着优势，为胚胎小鼠心脏研究。这种文化系统保留心肌收缩和冠状动脉丛，坏死的迹象有限，即使经过4天的文化。此外，半固体基质提供了足够的支持，以维持发展的心脏三维形态，同时允许灵活性，以合同，也培养期间举行涂珠。尽管这种支持，这个矩阵是可渗透的荧光染料，如祥发16，使荧光分析的活的心。
切片培养的方法将心部分中，包含其部分冠状动脉丛，在气-液界面的多孔膜，维持氧合通过毛细作用7。相比之下，以前的整个心脏文化摇摆和限制的研究方法依赖于一个功能冠脉vasculat的胚龄前URE是必需2,3,5。然而，使用目前的技术，心可以很容易地进行培养后冠状动脉丛形成的气 - 液界面没有额外的复杂性。
尽管我们关注的问题，胚胎发育后期的心（ 如 E16.5）将成为坏死后，很长一段时间在文化，只有有限的坏死观察培养四天后（ 即相当于一个产后第1天心脏）。原来的协议，使用胚胎肺芽，无坏死，但也利用从早期上演胚胎肺10日报道。因此，坏死可避免通过限制研究早期胚胎的时间点。
这种体外培养系统也有局限性。培养两天后，心外膜开始扩散到基体，在四天之内，心外膜附着到培养皿中。由于外膜产物母鹿然而，不影响可视化，这个问题可能是主要心外膜研究的重要性。本文在分析阶段（E14.5-E16.5），心外膜早已包含心脏11发展丛12提供的信号，因此，其产物不会出现有负面影响冠状动脉丛。此外在文化，心中似乎，停止像他们在子宫内的同行越来越大。另一个限制是，在小鼠胚胎心脏是不是像斑马鱼的胚胎透明。任何现场的可视化，从而限制什么可以观察心脏外层。但是，活的内皮标记可以充分渗透到心脏冠状动脉丛把某些在文化上是可见的。
尽管有这些限制，我们预计这种体外培养的方法将是有益的多种应用。转基因小鼠中的各种各样的线，汽车RY荧光标记的细胞类型可以很容易地用于评估不同方面的发展，使用时间推移成像。此外，治疗小分子化合物的体外胚胎的心，无论是小说或已经在临床上使用，将是很容易做到，，模仿药物疗法是如何应用在人类身上。
总之，我们已经适应了小鼠胚胎心脏体外培养的方法。这种技术将允许方便地访问，否则无法进入的器官，如肝脏或肾脏，在开发过程中，将允许操作和现场分析这些器官。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
我们想感谢Andrea波尔特布里的批判性阅读的手稿和美国国立卫生研究院（授＃R01HL061656）的资金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Timed-pregnant mice | To be dissected at the embryonic stage of interest | ||
| PBS (1x) | |||
| DMEM | Cellgro | ||
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Growth factor-reduced Matrigel | BD Bioscience | 356231 | |
| Syto-16 | Invitrogen | S7578 | Used as directed in 13 |
| 24-well culture plate | Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| EQUIPMENT | |||
| Stereoscopic microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Cell culture incubator | Thermo | 3110 | |
References
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