Summary
इस प्रोटोकॉल टीका दो तरीकों कवक entomopathogen परिचय दर्शाता है
Abstract
Bassiana Beauveria पौधों endophytically उपनिवेश स्थापित करने की क्षमता के साथ एक कवक entomopathogen है. के रूप में एक एक पादप परजीवी जो अपने पोषद के शरीर के भीतर रहता है, अन्त: पादपी, बी. bassiana herbivory और रोग से पौधों की रक्षा करने में एक भूमिका निभा सकते हैं. इस प्रोटोकॉल टीका दो तरीकों बी स्थापित दर्शाता है bassiana आम (बाकला) बाद endophytic जैविक नियंत्रण के मूल्यांकन के लिए तैयारी में सेम, endophytically. पौधे सतह निष्फल बीज से दो सप्ताह के लिए एक बी प्राप्त करने से पहले बड़े हो रहे हैं 10 / conidia मिलीलीटर (या पानी) 8 के bassiana उपचार के रूप में या तो एक पत्ते स्प्रे या एक मिट्टी सराबोर लागू होता है. दो हफ्ते बाद, पौधों और खेती कर रहे हैं अपने पत्ते, तनों और जड़ों लिए endophytic कवक उपनिवेश की स्थापना का मूल्यांकन जांचा जाता है. इस के लिए, नमूने व्यक्तिगत रूप निष्फल रहे हैं सतह, कई वर्गों में कटौती, और 20 दिनों के लिए आलू dextrose अगर मीडिया में incubated. मीडिया हर 2-3 दिन का निरीक्षण किया जाता है के रूप में कवक विकास का निरीक्षणसंयंत्र वर्गों के साथ sociated और बी के घटना रिकॉर्ड bassiana अपने endophytic उपनिवेशण की हद तक का आकलन करने के लिए. टीका की सफलता का विश्लेषण बी की घटना की तुलना एक निश्चित भाग के भीतर संयंत्र उपचार और नियंत्रण में (यानी पत्तियों, तनों या जड़ों) bassiana. टीका विधि के अलावा प्रयोग की विशिष्ट परिणाम लक्ष्य फसल प्रजातियों या किस्म पर निर्भर हो सकता है, कवक entomopathogen प्रजातियों तनाव या इस्तेमाल किया को अलग, और संयंत्र बढ़ती शर्तों.
Introduction
फफूंद entomopathogens mycopesticides 1 के रूप में काफी क्षमता के साथ कीट आबादी के महत्वपूर्ण नियामकों हैं. हाल ही में, तथापि, कवक entomopathogens के endophytes, दोनों स्वाभाविक रूप से और विभिन्न टीका 2 तरीकों के लिए प्रतिक्रिया के रूप में होने के लिए दिखाया गया है. endophytic कवक entomopathogens की पारिस्थितिक कार्य काफी हद तक अनजान बनी हुई है, लेकिन कुछ अध्ययनों उन्हें संयंत्र 3,4 विकास, herbivore 5-8 प्रतिरोध, और रोग प्रतिरोध 9,10 में उलझा दिया है. यहाँ प्रस्तुत तरीकों के समग्र उद्देश्य के रूप में एक एक पादप परजीवी जो अपने पोषद के शरीर के भीतर रहता है, अन्त: पादपी बाद मूल्यांकन के लिए endophytic जैविक नियंत्रण की तैयारी में में एक कवक entomopathogen, परिचय है.
Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin है (Ascomycota: Hypocreales) सबसे अच्छा अध्ययन endophytic कवक 5-9,11-19 entomopathogen है, और यह एक वाणिज्यिक mycopesticide के रूप में उपलब्ध है. टीका तरीकों स्थापित करने के लिए परीक्षण किया
आम सेम (बाकला) कीट के लिए सबसे अधिक चपेट में फसलों के बीच रैंकोंबीमारियों और. यह 400 से अधिक कीट और 200 रोगज़नक़ों, हमले जिसका 28 क्षेत्रों में सबसे अधिक सीमित सेम उत्पादन कारक हो सोचा से प्रभावित किया जा सकता है. तदनुसार, आम सेम एक उत्कृष्ट मॉडल फसल बी द्वारा endophytic जैविक नियंत्रण की पूर्ण स्पेक्ट्रम की जांच कर सकते हैं bassiana. इस दिशा में पहले कदम के रूप में, इस लेख टीका के तरीके के रूप में पत्ते स्प्रे और मिट्टी भिगो का वर्णन एक आम फलियों में एक पादप परजीवी जो अपने पोषद के शरीर के भीतर रहता है, अन्त: पादपी के रूप B.bassiana परिचय.
Protocol
1. पौधे
- भूतल बाँझ बनाना 0.5% सोडियम हाइपोक्लोराइट और 70% इथेनॉल में दो मिनट में दो मिनट के लिए उन्हें डुबो सेम के बीज (cv. Calima). बाँझ आसुत जल में बीज तीन बार कुल्ला.
- आलू dextroxe अगर मीडिया (पीडीए) पर पिछले rinsing पानी की 100 μl चढ़ाना, और 25 में 10 दिनों के लिए थाली incubating द्वारा अपने नसबंदी की सफलता डिग्री सेल्सियस का मूल्यांकन बर्खास्त और प्रयोग पुनः आरंभ अगर किसी भी ग्रोथ प्लेट पर देखा जाता है.
- तीन के समूहों में एक 2:1 के अनुपात में मिट्टी और रेत की एक बाँझ मिश्रण युक्त बर्तन में बीज संयंत्र. 25 में एक विकास कक्ष ° सी, ca बर्तन स्थानांतरण. 50% आरएच और 12 घंटा photoperiod. अंकुरण के बाद एक सप्ताह कम से कम दो जोरदार seedlings को समाप्त करने के लिए. पानी बाँझ आसुत जल और एक 6 ग्राम / एल NPK 15-15-15 उर्वरक के पानी के घोल के साथ रोपण के बाद 10 और 20 दिनों की खाद डालना के साथ हर 2-3 दिन.
2. कवक
- एक वाणिज्यिक प्राप्तBeauveria bassiana तनाव GHA (Mycotrol एसई, Laverlam, कैली, कोलम्बिया) की cial निर्माण.
- एक एकल बीजाणु स्टॉक संस्कृति उत्पन्न, ca को स्थगित कर देते हैं. एक एक 0.1% ट्राइटन-X 100 पानी के घोल और भंवर के 1 मिलीलीटर में 10 सेकंड के लिए पूर्ण पाश की conidia inoculating. फिर 2.5% नोबल और 24 घंटे के लिए अगर सेते प्लेट 100 निलंबन के 25 ° μl सी. एक 100 मिमी प्लेट युक्त पीडीए में एक एकल germinating conidium स्थानांतरण और बढ़ने जब तक यह पूरी थाली (ca. 3-4 सप्ताह) को शामिल किया गया है.
- बाँझ शर्तों के तहत, मध्यम की सतह से कवक विकास परिमार्जन और यह 10 मिलीलीटर बाँझ 0.1% ट्राइटन-X 100 में निलंबित. एक मिनट के लिए भंवर. फिर, एक बाँझ जाली के माध्यम से निलंबन फिल्टर hyphae हटाने और शेयर निलंबन प्राप्त.
- एक hemocytometer का उपयोग करने के लिए शेयर निलंबन conidial एकाग्रता का अनुमान. को सुविधाजनक बनाने के conidial मायने रखता है, एक 10,000 गुना स्टॉक के धारावाहिक कमजोर पड़ने को तैयार करने के लिए हर समय 100 μl ओ स्थानांतरित करनेच 0.1% ट्राइटन-X 100 की 900 μl में conidial निलंबन, और अगले कमजोर पड़ने से पहले 10 सेकंड के लिए vortexing.
- Inoculum उत्पन्न, 10 / conidia मिलीलीटर 8 की एक अंतिम एकाग्रता स्टॉक निलंबन को समायोजित करने के लिए, इस सूत्र का उपयोग:
- में conidial व्यवहार्यता 10,000 गुना कमजोर पड़ने की थाली 100 μl का आकलन 2.5% नोबल और 24 घंटे के लिए अगर सेते पर 25 डिग्री सेल्सियस फिर, 100 conidia के तीन यादृच्छिक समूहों प्रतिशत अंकुरण अनुमान का निरीक्षण किया. एक अंकुरित conidium पर विचार एक दृश्य रोगाणु ट्यूब 1/2 इसे से conidium परियोजनाओं के व्यास की तुलना में अब जब. केवल निलंबन का उपयोग करें, जब औसत प्रतिशत अंकुरण 90% से अधिक है.
3. टीका
- जब वे अपने पहले सच पत्ती चरण (ca. में 14 दिनों के बोने के बाद) तक पहुँचने के लिए पौधों टीका लगाना. बाँझ के साथ जल मिट्टी क्षमता पौधों गढ़नेinoculations पहले एड पानी 24 घंटे.
- पत्ते स्प्रे विधि के लिए, एक मैनुअल atomizer का उपयोग करने के लिए (उपचार) conidial निलंबन या 0.1% ट्राइटन-X 100 (नियंत्रण) पत्तियों की मध्यतल की ओर सतह (ऊपरी) जब तक वे संतृप्ति तक पहुँचने के लागू. एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बर्तन के शीर्ष को कवर करने के लिए मिट्टी conidial अपवाह से बचने के लिए. छिड़काव के बाद 24 घंटे के लिए एक प्लास्टिक बैग के साथ पौधों को कवर करने के लिए नमी की एक उच्च स्तर कवक आक्रमण की सुविधा को बनाए रखने.
- मिट्टी सराबोर विधि के लिए, एक स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर का उपयोग करने के लिए conidial निलंबन (उपचार) के 10 मिलीग्राम या 0.1% Triton एक्स 100 (नियंत्रण) संयंत्र के आधार पर मिट्टी की सतह. लागू
- Inoculations के बाद, विकास उन्हें एक यादृच्छिक ब्लॉक डिजाइन में व्यवस्था कक्षों के लिए पौधों वापसी. संयंत्र विकास के मूल्यांकन की अनुमति के लिए कम से कम चार अतिरिक्त प्रयोगात्मक ब्लॉक करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए, मूल्यांकन करने के लिए endophytic औपनिवेशीकरण के अलावा एक ही प्रयोग में है.
4. Evaluations
- प्रयोग एक समय में एक ब्लॉक का मूल्यांकन, यादृच्छिक क्रम में ब्लॉक का चयन. यह बड़े प्रयोगों है कि एक ही दिन पर मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है.
- एक प्रसंस्करण संयंत्र से पहले उपाय है, और अपने बेस से शीर्षस्थ विभज्योतक ऊंचाई रिकॉर्ड. फिर, ध्यान से उखाड़ और नल के चलते हुए पानी में अच्छी तरह से धो लो.
- प्रत्येक नमूना, संयंत्र से दो पत्रक, जड़ और स्टेम के दो टुकड़े के दो टुकड़े. संयंत्र की पहली सच पत्ती से पत्रक नमूने बेतरतीब ढंग से चयन करें. फिर, दो स्टेम नमूने, 3 सेमी लंबे समय प्रत्येक संयंत्र के बीच से और मिट्टी की सतह के पास से प्राप्त करते हैं. अंत में, दो मुख्य जड़ के नमूने प्राप्त करने के लिए, रूट के बीच से और जड़ टिप पीछे 1 सेमी से भी 3 सेमी लंबे समय. तीन अलग - अलग पेपर बैग और लेबल पर नमूने उचित रखें.
- कपड़े धोने और नमूना के एक ब्लॉक में सभी पौधों के बाद, पत्ते प्रसंस्करण द्वारा शुरू, तो जड़ें, और अंत में उपजी.
- टी बाँझ बनाना सतहएक बाँझ लामिना का प्रवाह हुड में 1.1, ऊपर में मुद्दों. प्रत्येक नमूना बाँझ आसुत जल में विसर्जन से तीन बार कुल्ला और यह बाँझ तौलिया कागज में दो सूखी. फिर, टुकड़े करना, और इसकी बाहरी किनारों त्यागें, जहां endophytes disinfectants के साथ संपर्क के कारण समाप्त कर दिया गया हो सकता है.
- छह वर्गों में छंटनी नमूना कट, पत्तियों और तनों और जड़ों के लिए 6 मिमी लंबे 6x6 मिमी औसत. प्लेट पीडीए 2 मिलीग्राम / एल प्रत्येक में एंटीबायोटिक दवाओं टेट्रासाइक्लिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन और पेनिसिलिन के साथ पूरक मीडिया के साथ एक 60 मिमी पेट्री प्लेट पर छह वर्गों. Parafilm साथ थाली सील और 25 में अंधेरे में सेते हैं ° सी. प्रत्येक संयंत्र पैदावार छह प्लेटें, दो प्रति संयंत्र हिस्सा है.
- एक दिया संयंत्र भाग के प्रत्येक ब्लॉक के प्रसंस्करण के बाद पानी से कुल्ला बदलें. Discarding से पहले इस्तेमाल किया rinsing पानी थाली, 25 में 10 दिनों के लिए 100 पीडीए मीडिया और सेते पर μl नमूना ° सी नसबंदी सफलता का आकलन करने के लिए. यदि कवक विकास ensues, विश्लेषण के लिए इसी नमूने विचार नहीं है.
- 20 दिनों के लिए हर प्लेट 2-3 दिन का निरीक्षण करने के लिए निरीक्षण करने के लिए और कवक विकास रिकॉर्ड. उत्पाद शुल्क और हस्तांतरण संयंत्र वर्गों ताजा पीडीए युक्त प्लेटों को कवक endophytes की उपस्थिति का प्रदर्शन. यह मूल की थाली में पड़ोसी संयंत्र वर्गों के संक्रमण से बचने के.
- रिकार्ड बी. संयंत्र वर्गों से bassiana विकास Beauveria bassiana विशेषता सफेद घने mycelia किनारे पर पीला पीले क्रीम बनने से पहचाना जा सकता है. जब संदेह में, पानी की एक बूंद में नमूना माउंट और एक खुर्दबीन के तहत निरीक्षण, गोलाकार conidia और वक्र के आकार conidiophores, प्रजातियों की विशेषता के लिए तलाश.
- अतिरिक्त प्रयोगात्मक ब्लॉकों का उपयोग करने के लिए बायोमास संयंत्र पर उपचार के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए. पहले, उनके आधार से शीर्षस्थ विभज्योतक के शीर्ष ऊंचाई मापने. फिर, ध्यान से उखाड़ और नल के पानी में पौधों धोने और 45 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सूखी उनके सूखी वजन का निर्धारण करने के लिए तीन दिनों के लिए चलो.
Representative Results
बी bassiana पी. endophytically उपनिवेश स्थापित करने में सक्षम था का प्रदर्शन टीका उपचार (1 चित्रा) के जवाब में vulgaris. दोनों पत्ते स्प्रे और मिट्टी भिगो बी द्वारा endophytic उपनिवेश की स्थापना के परिणामस्वरूप इलाज पौधों की 80% से अधिक में bassiana (2 चित्रा). हालांकि, उपनिवेशवाद की हद तक संयंत्र मूल्यांकन हिस्सा और टीका विधि का इस्तेमाल किया पर निर्भर करता था. पत्तियां स्प्रे inoculations सबसे अच्छा जवाब दिया. जड़ें, दूसरे हाथ पर, केवल सराबोर inoculations जवाब. अंत में, तनों दोनों टीका तरीकों जवाब करने के लिए इसी तरह बी. bassiana नियंत्रण संयंत्र वर्गों में से किसी में नहीं पाया गया था.
उपचार, बी के अलावा अन्य endophytes के स्वतंत्र bassiana मूल्यांकन संयंत्र वर्गों के 15% से वृद्धि हुई है, लेकिन वे बाहर मीडिया प्लेटों से dissected थे इससे पहले कि वे पड़ोसी वर्गों आक्रमण और परिणाम को प्रभावित कर सकता है.
उपचार और नियंत्रण संयंत्र inoculations के बाद दो सप्ताह दिख अप्रभेद्य थे. कोई मतभेद उनके सूखी वजन में और उनकी ऊंचाई में पाया गया.
चित्रा 1. सेम पौधों की endophytic Beauveria bassiana द्वारा उपनिवेश की स्थापना (बाकला cv Calima) पर टीका उपचार के प्रतिनिधि परिणाम शीर्ष बाएँ: नियंत्रण कोई वृद्धि के साथ प्लेट. शीर्ष सही: एक संयंत्र पूरी थाली contaminating अनुभाग से फफूंद एक पादप परजीवी जो अपने पोषद के शरीर के भीतर रहता है, अन्त: पादपी. नीचे छोड़ दिया: बी. bassiana दो संयंत्र वर्गों से बढ़ रहा है. नीचे सही: Endophytic बी. bassiana conidia और conidiophores के रूप में एक खुर्दबीन के नीचे देखा.
चित्रा 2. टीका उपचार के BEA के endophytic उपनिवेशण पर प्रभावn Beauveria bassiana, दो सप्ताह (बाकला cv Calima.) तनाव GHA साथ inoculations के बाद पौधों प्रतिशत उपनिवेश की स्थापना उपनिवेश संयंत्र सुसंस्कृत वर्गों की संख्या से विभाजित वर्गों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है.
Discussion
कई कारकों के एक प्रयोग के रूप में एक एक पादप परजीवी जो अपने पोषद के शरीर के भीतर रहता है, अन्त: पादपी कवक entomopathogen स्थापित की विशिष्ट परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं. हमारे परिणाम दिखाना टीका विधि उनमें से एक है. के साथ प्रयोग करने के लिए जैविक कारकों फसल प्रजातियों या cultivar चयनित और कवक entomopathogen प्रजातियों तनाव शामिल है या किया जाता है को अलग. अन्य कारकों पर विचार करने के लिए जोड़ तोड़ inoculum की एकाग्रता, inoculations के दौरान संयंत्र की उम्र, और संयंत्र बढ़ती शर्तों में शामिल हैं.
यह एक कवक entomopathogen 14,17,18,21 प्रणालीगत संयंत्र उपनिवेश की स्थापना में परिणाम के लिए एक टीका विधि के लिए आदर्श होगा. इसके बजाय, यह प्रतीत होता है कि टीका तरीकों स्थानीय औपनिवेशीकरण के एक विशिष्ट पैटर्न एहसान करते हैं. कॉफी में, उदाहरण के लिए, पत्ते स्प्रे पत्ती उपनिवेश की स्थापना के पक्ष जबकि मिट्टी भिगो रूट 17 उपनिवेश की स्थापना के पक्ष. हम आम सेम में एक ही पैटर्न पाया. अंत में, टीका विधि का विकल्प होना चाहिएएक संयंत्र के भीतर एक पादप परजीवी जो अपने पोषद के शरीर के भीतर रहता है, अन्त: पादपी का इरादा स्थान द्वारा निर्देशित, संभाव्यतः लक्ष्य herbivore या संयंत्र रोगज़नक़ के आला मिलान.
हालांकि आमतौर पर इस्तेमाल किया, एक पादप परजीवी जो अपने पोषद के शरीर के भीतर रहता है, अन्त: पादपी पता लगाने और मीडिया संस्कृतियों के आधार पर मात्रा का ठहराव महंगा, कठिन और त्रुटि प्रवण हो सकता है. उदाहरण के लिए, 10,800 संयंत्र वर्गों (1800 पेट्री डिश पर चढ़ाया) के एक कुल एक प्रयोग में मूल्यांकन किया गया बी का अनुकूलन bassiana inoculations केले पर 16. इनमें से 4496 वर्गों एक ख्यात बी द्वारा colonized थे bassiana, के रूप में मुख्य रूप से कॉलोनी आकारिकी द्वारा की पहचान की. जाहिर है, प्रत्येक कॉलोनी के लिए प्रजातियों में से एक सूक्ष्म सत्यापन एक वांछनीय लेकिन unaffordable कदम हो गया होता. दूसरी ओर, 1176 वर्गों अन्य कवक द्वारा colonized थे और त्याग और 16 डेटा लापता के रूप में इलाज किया. संभावना मौजूद है, तथापि, कि बी. bassiana एक गरीब प्रतियोगी या विकसित करने के लिए धीमी गति से किया गया था, और अंततः उन वर्गों से उभरा सकता है अगर एकllowed पर्याप्त समय है. इसलिए, एक पादप परजीवी जो अपने पोषद के शरीर के भीतर रहता है, अन्त: पादपी पता लगाने मीडिया संस्कृतियों पर आधारित विधियों झूठी सकारात्मक और नकारात्मक झूठी अधीन हैं. तदनुसार, अधिक विश्वसनीय पहचान और मात्रा का ठहराव विधियों, उदाहरण के लिए के विकास पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) assays 20,21,24 के आधार पर उन लोगों के लिए, अच्छी तरह से जायज है.
टीका प्रयोगों के लिए अंतिम लक्ष्य के लिए एक कुशल इलाज है कि herbivory और / या रोग के के खिलाफ टिकाऊ प्रणालीगत प्रतिरोध प्रदान करता है विकसित करने के लिए होना चाहिए. एक प्रशंसनीय है, लेकिन अभी तक untested, परिकल्पना कि endophytic उपनिवेशण की हद तक सकारात्मक एक पादप परजीवी जो अपने पोषद के शरीर के भीतर रहता है, अन्त: पादपी की मध्यस्थता प्रतिरोध की सीमा के साथ सहसंबंधी चाहिए. टीका तरीकों को परिष्कृत करने के बाद एक प्राकृतिक अगले कदम है, इसलिए, इस संबंध की जांच करने के लिए हो सकता है. कई वीडियो प्रोटोकॉल की मदद कर सकते हैं, शोधकर्ताओं ने एक लक्ष्य कीट या 29-31 रोगज़नक़ के लिए एक उपयुक्त प्रतिरोध परख डिजाइन. अंततः, यह इस परख क्या inocula की सफलता का निर्धारण करेगाtion, विधि, और जुड़े संभावित endophytic जैविक नियंत्रण के लिए.
Disclosures
लेखक का घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है.
Acknowledgments
उत्पादन और प्रयोगात्मक कार्य यहाँ प्रस्तुत Reynaldo Pareja के प्रति समर्पित और उत्साही मदद को प्रतिबिंबित. कोलम्बिया विज्ञान के प्रशासनिक विभाग, प्रौद्योगिकी और अभिनव (Colciencias) और ग्रांड Explorations चुनौतियां पहल के माध्यम से बिल एंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | |
| Mycotrol SE | Laverlam | 4167 | |
| Noble agar | Sigma | A5431-250G | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-25MU | |
| Petri dish (100 x 15 mm) | Fisher | 08-757-12 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | Fisher | 08-757-13A | |
| Potato dextrose agar | Difco | 213400 | |
| Regular bleach (NaOCl) | CLOROX | N/A | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S6501-25G | |
| Tetracycline | Sigma | T3258-25G | |
| Triple quince (NPK) | ABOCOL | N/A | |
| Triton X-100 | Sigma | X-100 | |
| EQUIPMENT | |||
| Biological safety cabinet | NuAire | NU-425-600 | |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Leica DM LB microscope | Leica | N/A | |
References
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