إنشاء Entomopathogens الفطرية وEndophytes: نحو المكافحة البيولوجية النابوت الداخلي

Summary

هذا البروتوكول يوضح أساليب التلقيح اثنين إلى تقديم entomopathogen الفطرية

Abstract

البوفيرية bassiana هو entomopathogen الفطرية، مع القدرة على استعمار النباتات endophytically. باعتبارها B.، نابوت داخلي قد bassiana تلعب دورا في حماية النباتات من الحيوانات العاشبة والمرض. هذا البروتوكول يوضح أساليب التلقيح سنتين إلى إنشاء B. bassiana endophytically في الفول المشتركة (فاصيلوس الشائع)، وذلك استعدادا لعمليات التقييم التي المكافحة البيولوجية النابوت الداخلي. وتزرع النباتات من البذور المعقمة سطح لمدة أسبوعين قبل الحصول على B. تطبيق bassiana علاج 10 ⁸ غبيرات / مل (أو الماء) إما رذاذ الأوراق أو تغمر التربة. وبعد أسبوعين، ويتم حصاد النباتات وأوراقها وعينات، السيقان والجذور لتقييم الاستعمار الفطرية النابوت الداخلي. لهذا، يتم بشكل فردي عينات سطح تعقيمها، مقطعة إلى مقاطع متعددة، وحضنت في وسائل الإعلام البطاطا أجار دكستروز لمدة 20 يوما. ويتم تفتيش وسائل الإعلام كل يوم 2-3 لمراقبة نمو الفطريات كماsociated مع أقسام المصنع وتسجيل وقوع B. bassiana لتقدير مدى استعمارها النابوت الداخلي. التحليلات للنجاح التلقيح مقارنة وقوع B. bassiana داخل جزء معين النبات (أوراق أي ينبع أو الجذور) عبر العلاجات والضوابط. بالإضافة إلى طريقة التلقيح، ونتائج محددة من التجربة قد تعتمد على أنواع المحاصيل المستهدفة أو متنوعة، والأنواع الفطرية entomopathogen سلالة أو عزل المستخدمة، وظروف المصنع المتنامية.

Introduction

entomopathogens الفطرية هي مهمة المنظمين للسكان الحشرات مع إمكانات كبيرة كما mycopesticides ^1. إلا في الآونة الأخيرة، ومع ذلك، وقد ثبت أن يحدث entomopathogens الفطرية وendophytes، سواء بشكل طبيعي واستجابة لأساليب التلقيح المختلفة ^2. وظيفة الإيكولوجية للentomopathogens الفطرية النابوت الداخلي ما زال مجهولا إلى حد كبير، ولكن بعض الدراسات تشير الى تورط لهم في نمو النبات ^3،4، ومقاومة النبات ^5-8، ومقاومة الأمراض ^9،10. ويتمثل الهدف العام من الأساليب المقدمة هنا هو لإدخال entomopathogen الفطرية باعتبارها نابوت داخلي، وذلك استعدادا لعمليات التقييم اللاحق للالمكافحة البيولوجية النابوت الداخلي.

البوفيرية bassiana (بالسامو) Vullemin (Ascomycota: المستلحمات) هو أفضل درس entomopathogen الفطرية النابوت الداخلي ^5-9،11-19، ومتاح للmycopesticide التجارية. اختبار طرق التلقيح لإنشاء 14،17، 18 و الطلاء البذور الغمر ^{14، 13،15} الضمادات الجذير الجنيني، وجذر ورهيزومي الغمر ^11،16،18، الجذعية حقن ^{17، 14،17،20} الرش والرش الورقي زهرة ^19. باستخدام هذه الأساليب، أدخلت الباحثين B. bassiana في الموز ^11، الفول ^7، الكاكاو ^13، القهوة ^17، الذرة ^7، القطن ^7، النخيل ^12، الجوت ^21، خشخاش الأفيون ^20، اليقطين ^7، رديتا الصنوبر ^18، الذرة ^{14، 7} و الطماطم القمح ^7. الأدلة الحديثة تشير إلى أن B. النابوت الداخلي bassiana لديه القدرة على حماية النباتات من الآفات ليس فقط المفصلية ^5-7،22-27، ولكن أيضا من بعض مسببات الأمراض النباتية ^9.

الحبة المشتركة عادية (فاصيلوس فولجاريس) تعد من بين أبرز المحاصيل عرضة للآفاتوالأمراض. يمكن أن تتأثر بها أكثر من 400 الآفات ومسببات الأمراض 200، التي هجوم يعتقد أنه إنتاج الفول معظم عاملا يحد عبر المناطق ^28. وفقا لذلك، قد يكون الفول المشتركة المحاصيل نموذجا ممتازا لدراسة الطيف الكامل من المكافحة البيولوجية النابوت الداخلي من قبل B. bassiana. كخطوة أولى في هذا الاتجاه، توضح هذه المقالة الرش الورقي والجرعات التربة وطرق التلقيح لإدخال B.bassiana باعتبارها نابوت داخلي في الفول المشتركة.

Protocol

1. النباتات

1. أرض تعقيم البذور الفول (cv. كاليما) بغمر لهم لمدة دقيقتين في هيبوكلوريت الصوديوم 0.5٪ ودقيقتين في الايثانول 70٪. شطف البذور ثلاث مرات في الماء المقطر المعقم.
2. تقييم مدى نجاح التعقيم الخاص بك عن طريق الطلاء 100 ميكرولتر من الماء على وسائل الإعلام الشطف مشاركة dextroxe البطاطا (PDA) أجار، واحتضان لوحة لمدة 10 يوما في 25 ° C. إنهاء وإعادة التجربة إذا رأيت أي نمو على اللوحة.
3. زرع البذور في مجموعات من ثلاثة في الأواني التي تحتوي على خليط من التربة المعقمة والرمل بنسبة 2:1. نقل الأواني إلى دائرة النمو عند 25 ° C، كاليفورنيا. 50٪ RH و 12 ساعة الضوئية. أسبوع واحد بعد الإنبات، والقضاء على اثنين من الشتلات الأقل قوية. الماء كل 2-3 أيام مع الماء المقطر المعقم وتخصيبها 10 و 20 يوما بعد زرع مع الحل 6 المياه ز / L من السماد NPK 15-15-15.

2. فطر

1. الحصول على تسويقيةاالجتماعية صياغة سلالة البوفيرية GHA bassiana (Mycotrol SE، Laverlam، كالي، كولومبيا).
2. لتوليد ثقافة الأسهم واحد بوغ أو تعليق كاليفورنيا. 1 بتلقيح حلقة كاملة من غبيرات في 1 مل من محلول 0.1٪ من المياه تريتون X-100 و دوامة لمدة 10 ثانية. ثم، لوحة 100 ميكرولتر من التعليق على أجار نوبل 2.5٪ واحتضان لمدة 24 ساعة عند 25 ° C. نقل غبيرة واحد الإنبات إلى PDA لوحة ملم تحتوي على 100 وتنمو حتى أنها تغطي لوحة بأكمله (حوالي 3-4 أسابيع).
3. تحت ظروف معقمة، تتخلص من نمو الفطريات من سطح المتوسطة وتعليقه في 10٪ مل العقيمة تريتون 0.1-X 100. دوامة لدقيقة واحدة. ثم، تصفية التعليق من خلال القماش القطني لإزالة خيوط معقمة والحصول على التعليق الأسهم.
4. استخدام عدادة الكريات لتقدير تركيز غبيري لتعليق الأوراق المالية. لتسهيل التهم غبيري، إعداد التخفيف 10،000 أضعاف المسلسل من الأسهم، في كل مرة تحويل 100 ميكرولتر Oو التعليق غبيري في 900 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون X-100، وvortexing لمدة 10 ثانية قبل التخفيف المقبل.
5. لتوليد اللقاح، وضبط التعليق الأسهم إلى تركيز النهائي من 10 ⁸ غبيرات / مل، وذلك باستخدام الصيغة:
   
6. لتقييم الجدوى غبيري، لوحة 100 ميكرولتر من التخفيف 10،000 أضعاف على أجار نوبل 2.5٪ واحتضان لمدة 24 ساعة عند 25 ° C. ثم، وفحص ثلاث مجموعات عشوائية من 100 غبيرات لتقدير الإنبات في المئة. النظر في غبيرة نبتت أنبوب الجرثومية مرئية أطول من القطر النصف من المشاريع غبيرة منه متى. فقط استخدام التعليق عندما يتجاوز متوسط ​​نسبة الإنبات 90٪.

3. تلقيح

1. تطعيم النباتات عندما تصل لأول مرة مرحلة أوراق صحيح (حوالي 14 يوما بعد الزراعة). محطات المياه لقدرة التربة المعقمة مع تقطيرإد المياه 24 ساعة قبل التلقيح.
2. للأسلوب الرش الورقي، واستخدام رذاذ دليل لتطبيق التعليق غبيري (العلاج) أو 0.1٪ تريتون X-100 (التحكم) إلى السطح (العلوي) متجه نحو المحور الأوراق حتى تصل التشبع. تغطية الجزء العلوي من وعاء مع رقائق الألومنيوم لتجنب جولة الاعادة غبيري إلى التربة. بعد الرش، وتغطي النباتات مع كيس من البلاستيك لمدة 24 ساعة للحفاظ على مستوى عال من الرطوبة تسهيل غزو الفطرية.
3. لتغمر التربة الأسلوب، استخدم اسطوانة تخرج لتطبيق 10 مل من التعليق غبيري (العلاج) أو 0.1٪ تريتون X-. 100 (التحكم) على سطح التربة في قاعدة النبات
4. بعد التطعيمات، والعودة إلى غرف النباتات النمو ترتيبها في تصميم القطاعات كاملة العشوائية. يجب تثبيت ما لا يقل عن أربع كتل التجريبية إضافية للسماح تقييم نمو النبات، بالإضافة إلى تقييم الاستعمار النابوت الداخلي، في التجربة نفسها.

4. يفالuations

1. تقييم التجربة كتلة واحدة في وقت واحد، واختيار القطع في ترتيب عشوائي. هذا مهم بشكل خاص للتجارب الكبيرة التي لا يمكن تقييمها في يوم واحد.
2. قبل معالجة النبات، وتسجيل قياس ارتفاعه من القاعدة إلى النسيج الإنشائي القمي. ثم، اقتلاع بعناية وغسل جيدا في مياه جارية الصنبور.
3. من كل عينة، مصنع نشرتين، قطعتين من الجذر وقطعتين من الجذعية. حدد عينات عشوائية من أوراق النشرة الحقيقية الأولى من المصنع. ثم، يجب الحصول على عينات الجذعية اثنين، 3 سم طويلة لكل منهما، في الفترة من منتصف المصنع وبالقرب من سطح التربة. وأخيرا، يجب الحصول على عينات أصل اثنين، كما 3 سم طويلة لكل منهما، في الفترة من منتصف الجذر و1 سم من وراء تلميح الجذر. وضع عينات على ثلاثة أكياس الورق وتسمية منفصلة بشكل مناسب.
4. بعد غسل وأخذ العينات جميع النباتات في كتلة، تبدأ من خلال تجهيز الأوراق، ثم الجذور والسيقان وأخيرا.
5. تعقيم السطح رقضايا في غطاء تدفق الصفحي معقمة كما في 1.1 أعلاه. شطف كل عينة ثلاث مرات عن طريق الغمر في الماء المقطر المعقم والسماح لها الجافة في ورقة منشفة معقمة. ثم، تشريح وتجاهل حواف الخارجي، حيث قد تم القضاء endophytes بسبب الاتصال مع المطهرات.
6. قطع العينة قلصت إلى ستة أقسام، حيث بلغ متوسطها 6X6 مم للأوراق و 6 ملم طويلة لالسيقان والجذور. لوحة من الأقسام الستة على طبق بتري 60 مم مع وسائل الإعلام PDA تستكمل مع المضادات الحيوية التتراسيكلين، الستربتوميسين والبنسلين في كل ملغ / L 2. ختم لوحة مع parafilm واحتضان في الظلام في 25 ° C. كل مصنع ينتج ستة صفائح، وهما جزء النبات الواحد.
7. تغيير ماء الشطف بعد معالجة كل كتلة لجزء النبات معين. قبل التخلص من المياه المستعملة الشطف، لوحة لعينة مؤلفة من 100 ميكرولتر على وسائل الإعلام PDA واحتضان لمدة 10 يوما عند درجة حرارة 25 C لتقييم نجاح التعقيم. إذا نمو الفطريات تستتبعه، لا تعتبر العينات المطابقة للتحليلات.
8. تفقد لوحات كل 2-3 أيام لمدة 20 يوما لمراقبة وتسجيل نمو الفطريات. أقسام المصنع المكوس ونقل واظهار وجود endophytes الفطرية التي تحتوي على لوحات جديدة PDA. هذا سوف تجنب تلوث أقسام المصنع المجاورة في لوحة الأصلي.
9. سجل B. ويمكن تحديد bassiana النمو من أقسام المصنع. البوفيرية bassiana من فطر مميزة كثيفة بيضاء تصبح كريم لأصفر باهت على حافة. عندما تكون في شك، تحميل العينة في قطرة ماء وتفتيش تحت المجهر، وتبحث عن غبيرات كروي الشكل وconidiophores متعرج الشكل، سمة من الأنواع.
10. استخدام كتل التجريبية إضافية لتقييم تأثير العلاج على الكتلة الحيوية النباتية. الأولى، وقياس طولهم من القاعدة إلى أعلى النسيج الإنشائي القمي. ثم، اقتلاع النباتات بعناية وغسل في ماء الصنبور والسماح لهم الجافة في C ° 45 لمدة ثلاثة أيام لتحديد وزنها الجاف.

Representative Results

كان B. bassiana قادرة على استعمار endophytically P. الشائع في الاستجابة للعلاجات التلقيح أظهرت (الشكل 1). أدى كل من الرش الورقي والتربة في الجرعات الاستعمار النابوت الداخلي من قبل B. bassiana في أكثر من 80٪ من النباتات المعاملة (الشكل 2). ومع ذلك، يتوقف مدى الاستعمار من جانب محطة تقييم وطريقة التلقيح المستخدمة. ورد الأوراق لأفضل التطعيمات الرذاذ. جذور، من ناحية أخرى، رد فقط لجرعة التطعيم. وأخيرا، ردت بالمثل ينبع إلى كل من أساليب التلقيح. B. لم يتم الكشف عن bassiana في أي من أقسام المصنع السيطرة.

مستقلة عن endophytes والعلاج غير B. نمت bassiana من 15٪ من تقييم أقسام المصنع، ولكن تم تشريح على الخروج من لوحات وسائل الإعلام قبل أن يتمكنوا من غزو الأقسام المجاورة وتؤثر على النتائج.

وعلاجها ومكافحتها النباتات تمييزه بوضوح بعد أسبوعين من التطعيم. تم الكشف عن عدم وجود فروق في وزنهم في الجافة وطولهم.

الشكل 1. ممثل نتائج العلاجات التلقيح على الاستعمار النابوت الداخلي للنباتات الفول (فاصيلوس الشائع السيرة الذاتية كاليما.) من bassiana البوفيرية الأعلى الأيسر: لوحات تحكم مع أي نمو. أعلى اليمين: نابوت داخلي الفطرية من قسم النبات تلويث وحة بأكمله. أسفل اليسار: B. bassiana متزايد من أقسام المصنع اثنين. أسفل اليمين: النابوت الداخلي B. bassiana غبيرات وconidiophores ينظر اليها على انها تحت المجهر.

الشكل 2. تأثير التلقيح من العلاجات على الاستعمار النابوت الداخلي من مكتب التحقيقات الفرنسىالنباتات غير عادية (فاصيلوس الشائع السيرة الذاتية. كاليما) من bassiana البوفيرية، بعد أسبوعين من التطعيم مع GHA التوتر. الاستعمار النسبة تمثل عدد من أقسام المصنع المستعمر مقسوما على عدد من الأبواب مثقف.

Discussion

ويمكن لعوامل كثيرة تؤثر على نتيجة محددة من تجربة لإنشاء entomopathogen الفطرية باعتبارها نابوت داخلي. نتائجنا تظهر طريقة التلقيح هو واحد منهم. العوامل البيولوجية في تجربة تشمل المحاصيل الأنواع أو الأصناف المختارة والفطرية سلالة الأنواع entomopathogen أو عزل المستخدمة. عوامل أخرى للنظر في التلاعب تشمل تركيز اللقاح، عمر النبات خلال التطعيمات، وظروف المصنع المتنامية.

سيكون من المثالي لأسلوب التلقيح أن يؤدي إلى الأجهزة عن طريق الاستعمار مصنع ^{14،17،18،21} على entomopathogen الفطرية. بدلا من ذلك، يبدو أن أساليب التلقيح تميل لصالح نمط محدد من الاستعمار المحلي. في القهوة، على سبيل المثال، وبخاخ الأوراق صالح الاستعمار ورقة بينما الجرعات التربة صالح الاستعمار الجذر ^17. وجدنا نفس النمط في الفول المشتركة. في نهاية المطاف، ينبغي أن اختيار طريقة التلقيح تكونمسترشدة في ذلك المكان المقصود للنابوت داخلي داخل مصنع، مطابقة يفترض أن مكانة من النبات أو الممرض الهدف النبات.

على الرغم من أن يمكن أن تستخدم عادة، والكشف النوعي والكمي نابوت داخلي يعتمد على وسائل الإعلام الثقافات يكون مكلفا وصعبا وعرضة للخطأ. على سبيل المثال، تم تقييم ما مجموعه أقسام المصنع 10800 (مطلي على أطباق بتري 1،800) في تجربة لتحسين B. التطعيمات bassiana على الموز ^16. للخروج من هذه، كانت مستعمرة من قبل أقسام 4496 B. المفترضة bassiana، على النحو المحدد أساسا عن طريق التشكل مستعمرة. بوضوح، كان يمكن أن يكون التحقق من الأنواع المجهرية لكل مستعمرة خطوة مرغوب فيه ولكن لا يمكن تحمله. من ناحية أخرى، كانت مستعمرة من قبل فطريات 1176 الأقسام الأخرى والتخلص منها ومعالجتها وعداد المفقودين البيانات ^16. احتمال وجود، مع ذلك، أن B. كان bassiana منافس الفقراء أو أبطأ في النمو، ويمكن في نهاية المطاف ظهرت في هذه الأقسام إذا كانالوقت الكافي llowed. ولذلك، طرق الكشف نابوت داخلي يعتمد على وسائل الإعلام الثقافات على مدى كاذبة ايجابيات وسلبيات كاذبة. وفقا لذلك، ووضع الكشف أكثر موثوقية وأساليب القياس الكمي، على سبيل المثال ما يبرره جيدا تلك القائمة على تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) المقايسات ^{20،21،24،.}

ينبغي أن يكون الهدف النهائي للتجارب التلقيح في تطوير علاج فعال النظامية التي توفر المقاومة ضد دائم / والحيوانات العاشبة أو المرض. A المعقول، ولكن حتى الآن لم تختبر، هو أن فرضية مدى الاستعمار النابوت الداخلي يجب أن ترتبط بشكل إيجابي مع مدى نابوت داخلي بوساطة المقاومة. الخطوة التالية الطبيعية بعد تحسين أساليب التلقيح، ويمكن بالتالي النظر في هذه العلاقة. يمكن الفيديو بروتوكولات عدة تساعد الباحثين تصميم فحص مقاومة مناسبة للآفة المستهدفة أو الممرض ^29-31. في نهاية المطاف، من هذا الاختبار ما سيحدد نجاح قائحطريقة نشوئها، ويرتبط به من احتمال المكافحة البيولوجية النابوت الداخلي.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number
Mycotrol SE	Laverlam	4167
Noble agar	Sigma	A5431-250G
Penicillin G sodium salt	Sigma	P3032-25MU
Petri dish (100 x 15 mm)	Fisher	08-757-12
Petri dish (60 x 15 mm)	Fisher	08-757-13A
Potato dextrose agar	Difco	213400
Regular bleach (NaOCl)	CLOROX	N/A
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S6501-25G
Tetracycline	Sigma	T3258-25G
Triple quince (NPK)	ABOCOL	N/A
Triton X-100	Sigma	X-100
EQUIPMENT
Biological safety cabinet	NuAire	NU-425-600
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Leica DM LB microscope	Leica	N/A