Etablera Svamp Entomopathogens som entofyter: Mot Endophytic biologisk kontroll

Summary

Detta protokoll visar två ympning metoder för att införa svampens entomopathogen

Abstract

Beauveria bassiana är en svamp entomopathogen med förmågan att kolonisera växter endophytically. Som en entofyt, B. Bassiana kan spela en roll för att skydda växter från herbivori och sjukdom. Detta protokoll visar två ympning metoder för att upprätta B. Bassiana endophytically i den gemensamma bönan (Phaseolus vulgaris), som förberedelse för efterföljande utvärderingar av endophytic biologisk kontroll. Växter odlas från ytsteriliserades-frön för två veckor innan de får ett B. Bassiana behandling av 10 ⁸ konidier / ml (eller vatten) appliceras antingen som en bladspray eller en jord indränkning. Två veckor senare är plantorna skördas och deras blad, stjälkar och rötter samplas för att utvärdera endophytic svamp kolonisering. För detta tas prover individuellt ytsteriliserades, skars i flera sektioner och inkuberas i agar potatisdextrosagar media under 20 dagar. Medierna inspekteras varje 2-3 dagar att observera svamptillväxt somförknippade med anläggningsdelar och registrera förekomsten av B. Bassiana att uppskatta omfattningen av dess endophytic kolonisering. Analyser av ympning framgång jämföra förekomsten av B. Bassiana inom en given växtdel (dvs. blad, stjälkar eller rötter) över behandlingar och kontroller. Förutom den inokuleringsmetod, kan den specifika resultatet av experimentet beror på målarter gröda eller sort, de svamp entomopathogen arter stam eller isolera används och anläggningens odlingsförhållanden.

Introduction

Svamp entomopathogens är viktiga regulatorer av insektspopulationer med stor potential som mycopesticides ^1. Först nyligen har emellertid svamp entomopathogens visats förekomma som entofyter, både naturligt och som svar på olika inokulering metoder ^2. Den ekologiska funktion endophytic svamp entomopathogens fortfarande till stor del okänd, men vissa studier har inblandade dem i växtligheten ^3,4, växtätare motstånd ^5-8, och sjukdomsresistens ^9,10. Det övergripande målet för de metoder som presenteras här är att införa en svamp entomopathogen som entofyt, som förberedelse för efterföljande utvärderingar av endophytic biologisk kontroll.

Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Sporsäcksvampar: Hypocreales) är den mest studerade endophytic svamp entomopathogen ^5-9,11-19, och det finns som en kommersiell mycopesticide. Inokulering metoder testats för att fastställa 14,17, beläggningar utsäde ¹⁸ och nedsänkningar ^14, rotanlaget dressingar ^13,15, rot och rhizom nedsänkningar ^11,16,18, stam injektioner ^17, bladsprayer ^14,17,20 och blomma sprayer ^19. Med användning av dessa metoder har forskare infört B. Bassiana i banan ^{11, 7} böna, kakao ^13, kaffe ^17, majs ^{7, 7} bomull, dadelpalm ^12, jute ^21, vallmo ^20, pumpa ^7, radiata tall ^18, sorghum ^14, tomat ⁷ och vete ^7. Nya rön tyder på att endophytic B. Bassiana har potential att skydda växter inte bara från artropoda skadedjur ^5-7,22-27, men också från vissa växtpatogener ^9.

Den gemensamma böna (Phaseolus vulgaris) rankas bland grödorna mest utsatta för skadedjuroch sjukdomar. Det kan påverkas av mer än 400 skadedjur och 200 patogener, vars angrepp tros vara den mest begränsande bönor produktionsfaktor i olika regioner ^28. Således kan den gemensamma bönan vara en utmärkt modell gröda för att undersöka hela spektrumet av endophytic biologisk kontroll av B. Bassiana. Som ett första steg i denna riktning, beskriver denna artikel bladsprayer och indränkningar jord som ympning metoder för att införa B.bassiana som entofyt i den gemensamma bönan.

Protocol

1. Växter

1. Yt-sterilisera frön från johannesbröd (ev. Calima) genom nedsänkning dem i två minuter i 0,5% natriumhypoklorit och två minuter i 70% etanol. Skölj fröna tre gånger i sterilt destillerat vatten.
2. Utvärdera framgången för din sterilisering genom att stryka 100 ul av den sista sköljvattnet på agar potatis dextroxe (PDA) media och inkubera plattan i 10 dagar vid 25 ° C. Avsluta och starta om experimentet om någon tillväxt ses på plattan.
3. Plantera frön i grupper om tre i krukor innehållande en steril blandning av jord och sand vid ett 2:1 förhållande. Överför krukor till en tillväxtkammare vid 25 ° C, ca. 50% RH och 12 h fotoperiod. En vecka efter groning, eliminera två minst kraftfulla plantor. Vatten var 2-3 dagar med sterilt destillerat vatten och gödsla 10 och 20 dagar efter plantering med en 6 g / L vattenlösning av NPK 15-15-15 gödningsmedel.

2. Svamp

1. Skaffa en kommersiellfinansiella utformningen av Beauveria bassiana stam GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colombia).
2. För att generera en enda spor stamkultur, tillfälligt ca. en inokulering slinga full av konidier i 1 ml av en 0,1% vattenlösning av Triton-X 100 och vortexblanda i 10 sek. Därefter, plattan 100 | il av suspensionen på 2,5% Noble-agar och inkubera i 24 timmar vid 25 ° C. Överför enstaka gro konidium i en 100 mm platta med PDA och växa tills den täcker hela plattan (ca. 3-4 veckor).
3. Under sterila betingelser, skrapa svamptillväxt från ytan av mediet och suspendera den i 10 ml steril 0,1% Triton-X 100. Vortex under en minut. Sedan filtreras suspensionen genom ett sterilt ostduk för att avlägsna hyfer och erhålla mäldsuspensionen.
4. Använd en hemocytometer att uppskatta konidiala koncentrationen av mälden. För att underlätta konidiala räknas, förbereda en 10.000-faldig serieutspädning av beståndet, varje gång överföra 100 ^ of konidiesuspension i 900 pl 0,1% Triton-X 100, och virvling i 10 sek innan nästa utspädning.
5. För att generera inokulum, justera mäldsuspensionen till en slutlig koncentration av 10 ⁸ konidia / ml, med användning av formeln:
   
6. För att bedöma konidial lönsamhet, platta 100 pl av 10.000-faldig utspädning på 2,5% Noble agar och inkubera under 24 timmar vid 25 ° C. Sedan inspektera tre slumpmässiga grupper av 100 konidier att uppskatta procent groning. Tänk dig en konidium grodde när en synlig grodd rör längre än halva diametern på konidium projekt från den. Använd endast suspensionen om den genomsnittliga procent grobarhet än 90%.

3. Inokulering

1. Inokulera växter när de når sin första riktiga bladstadiet (ca. 14 dagar efter plantering). Vattenväxter mot marken kapacitet med steril destilleraed vatten 24 timmar före vaccinationer.
2. För bladsprutning metoden, använd en manuell finfördelare att tillämpa konidiesuspension (behandling) eller 0,1% Triton-X 100 (kontroll) till adaxial (övre) ytan av blad tills de når mättnad. Täck toppen av potten med aluminiumfolie för att undvika konidial avrinning till jorden. Efter sprutning täcker plantorna med en plastpåse under 24 timmar för att upprätthålla en hög nivå av luftfuktighet underlättar svamp invasion.
3. För marken drench metoden, använd en graderad cylinder för att tillämpa 10 ml konidiesuspension (behandling) eller 0,1% Triton-X 100 (kontroll) till ytan av jorden vid basen av anläggningen.
4. Efter vaccinationer, återlämna växter till tillväxt kammare ordna dem i en randomiserad komplett block design. Inte mindre än fyra nya experimentella block ska installeras så att utvärderingar av växtligheten, förutom utvärderingar av endophytic kolonisering, i samma experiment.

4. Evaluations

1. Utvärdera experimentet ett block vid en tidpunkt, väljer blocken i slumpmässig ordning. Detta är särskilt viktigt för stora experiment som inte kan utvärderas på en enda dag.
2. Innan behandling av en växt, mäta och registrera dess höjd från basen till den apikala meristem. Sedan rycka försiktigt och tvätta noga i rinnande kranvatten.
3. Från varje anläggning, prov två broschyrer, två bitar av roten och två bitar av stammen. Välj bipacksedel prover slumpmässigt från den första sanna blad av växten. Därefter, erhålla två prover stamceller, 3 cm långa vardera, från mitten av anläggningen och från nära jordytan. Slutligen, erhålla två Taproot prover, också 3 cm långa vardera, från mitten av roten och från 1 cm bakom roten spets. Placera proverna på tre separata papperspåsar och etikett på lämpligt sätt.
4. Efter tvättning och provtagning alla växter i ett block, börja med att bearbeta bladen, då rötter och slutligen stammarna.
5. Ytan sterilisera tfrågor i en steril laminärt flöde huva som i 1,1, ovan. Skölj varje prov tre gånger genom nedsänkning i sterilt destillerat vatten och låt den torka i steril handduk papper. Därefter, dissekera och kassera sina yttre kanter, där entofyter kan ha eliminerats på grund av kontakt med desinfektionsmedel.
6. Skär trimmade provet i sex avsnitt i genomsnitt 6x6 mm för blad och 6 mm långa för stjälkar och rötter. Platta de sex avsnitten om en 60 mm petriskål med PDA media kompletterade med antibiotika tetracyklin, streptomycin och penicillin vid 2 mg / L vardera. Förslut plattan med parafilm och inkubera i mörker vid 25 ° C. Varje anläggning ger sex plattor, två per växtdel.
7. Ändra sköljvattnet efter bearbetning varje block av en viss växtdel. Innan du slänger använda sköljvattnet, tallrik en 100 ^ prov på PDA media och inkubera i 10 dagar vid 25 ° C för att bedöma sterilisering framgång. Om svamptillväxt följer, anser inte motsvarande prover för analys.
8. Inspektera plattorna var 2-3 dagar i 20 dagar för att observera och registrera svamptillväxt. Excise och överföring anläggningsdelar uppvisar förekomst av svamp entofyter till plattor innehållande färskt handdator. Detta kommer att undvika förorening av intilliggande anläggningsdelar i den ursprungliga plattan.
9. Rekord B. Bassiana tillväxt anläggningsdelar. Beauveria bassiana kan identifieras genom karakteristiska vita tät mycel blir grädde till blekgul vid kanten. När du är osäker montera provet i en vattendroppe och inspektera i mikroskop, letar efter klotformiga konidier och sicksack-formade konidioforer, karakteristisk för arten.
10. Använd ytterligare experimentella block för att utvärdera effekterna av de behandlingar på växtbiomassa. Först mäter deras höjd från basen till toppen av apikala meristem. Sedan försiktigt utrota och tvätta växter i kranvatten och låt dem torka vid 45 ° C under tre dagar för att bestämma deras torrvikt.

Representative Results

B. Bassiana kunde endophytically-kolonisera P. vulgaris i svar på de påvisade ympning behandlingar (Figur 1). Både bladsprayer och indränkningar jord resulterade i endophytic kolonisering av B. Bassiana i över 80% av de behandlade plantorna (fig 2). Emellertid berodde graden av kolonisering på den utvärderade växtdel och ympning som används. Bladen svarade bäst att spraya vaccinationer. Rötter, på den andra sidan, svarade endast att dränka ympningar. Slutligen, stammar reagerade liknande till båda inokulering metoder. B. Bassiana upptäcktes inte i något av avsnitten kontroll anläggningen.

Oberoende av behandlingen, entofyter än B. Bassiana ökade från 15% av de utvärderade anläggningsdelar, men de dissekerades ut från media plattor innan de kunde invadera närliggande sektioner och påverka resultaten.

Behandling och kontroll växter var synligt oskiljbara två veckor efter vaccination. Inga skillnader upptäcktes i deras torra vikt och i sin höjd.

Figur 1. Representativa resultat av ympning behandlingar på endophytic koloniseringen av bönplantor (Phaseolus vulgaris ev Calima.) Av Beauveria bassiana Överst till vänster:. Manövreringsplattorna utan tillväxt. Överst till höger: Svamp entofyt från en anläggning sektion förorenar hela plattan. Nederst till vänster: B. Bassiana ökat från två anläggningsdelar. Nederst till höger: Endophytic B. Bassiana konidier och konidioforer ses som under ett mikroskop.

Figur 2. Effekt av ympning behandlingar på endophytic koloniseringen av bean växter (Phaseolus vulgaris ev. Calima) från Beauveria bassiana, två veckor efter inokuleringar med stammen GHA. Procent kolonisering representerar antalet koloniserade anläggningsdelar dividerat med antalet odlade sektioner.

Discussion

Många faktorer kan påverka den specifika resultatet av ett experiment att upprätta en svamp entomopathogen som entofyt. Våra resultat visar att ympningen metoden är en av dem. Biologiska faktorer att experimentera med bland annat grödor eller sort valts och svamp entomopathogen arter stam eller isolat används. Andra faktorer att beakta manipulera inkluderar koncentrationen av inokulatet, åldern på anläggningen under vaccinationer och växtens odlingsförhållanden.

Det skulle vara perfekt för en inokuleringsmetod att resultera i systemisk växt kolonisering av en svamp entomopathogen ^14,17,18,21. Istället verkar det som ympning metoder tenderar att gynna ett specifikt mönster av lokala kolonisering. I kaffe, exempelvis bladsprayer gynnar blad kolonisering medan jord indränkningar gynnar rot kolonisering ^17. Vi fann samma mönster i den gemensamma bönan. Slutligen bör valet av inokuleringsmetod varavägledas av den avsedda placeringen av entofyt i en växt, förmodligen matchar nisch av målet växtätare eller växtpatogen.

Även vanliga, entofyt detektion och kvantifiering baserad på media kulturer kan vara kostsamt, svårt och felbenägen. Till exempel var totalt 10.800 växter sektioner (stryks ut på 1.800 Petriskålar) utvärderades i ett experiment för att optimera B. Bassiana inokulationer på banan ^16. Av dessa var 4.496 sektioner koloniserats av en förmodad B. bassiana, som identifieras huvudsakligen av kolonimorfologi. Uppenbarligen skulle en mikroskopisk kontroll av de arter för varje koloni ha varit en önskvärd men dyr steg. Å andra sidan var 1.176 sektioner koloniserades av andra svampar och kastades och behandlas som uppgifter som saknas ^16. Sannolikheten existerar dock att B. Bassiana var en dålig konkurrent eller långsammare att växa, och kunde så småningom fram ur de delar omllowed tillräcklig tid. Därför entofyt detektionsmetoder baserade på media kulturer är föremål för falska positiva och falska negativa. Följaktligen, de som baseras på polymeraskedjereaktion (PCR) analyser ^20,21,24, utveckling av mer tillförlitlig detektering och kvantifiering metoder, till exempel väl motiverat.

Det slutgiltiga målet för ympning experiment bör vara att utveckla en effektiv behandling som ger varaktig systemisk resistens mot herbivori och / eller sjukdom. En trolig, men ännu oprövat, är hypotesen att graden av endophytic kolonisering bör korrelera positivt med graden av entofyt-medierad resistens. Ett naturligt nästa steg efter raffinering inokulering metoder därför skulle kunna vara att undersöka detta samband. Flera video-protokoll kan hjälpa forskarna utforma en lämplig resistans analys för ett mål skadedjur eller patogen ^29-31. Ytterst är det denna analys vad kommer att avgöra framgången för inokulatning metod, och den tillhörande risken för endophytic biologisk kontroll.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number
Mycotrol SE	Laverlam	4167
Noble agar	Sigma	A5431-250G
Penicillin G sodium salt	Sigma	P3032-25MU
Petri dish (100 x 15 mm)	Fisher	08-757-12
Petri dish (60 x 15 mm)	Fisher	08-757-13A
Potato dextrose agar	Difco	213400
Regular bleach (NaOCl)	CLOROX	N/A
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S6501-25G
Tetracycline	Sigma	T3258-25G
Triple quince (NPK)	ABOCOL	N/A
Triton X-100	Sigma	X-100
EQUIPMENT
Biological safety cabinet	NuAire	NU-425-600
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Leica DM LB microscope	Leica	N/A