Etablering Fungal Entomopathogens som Endofytter: Mod Endophytic Biologisk Kontrol

Summary

Denne protokol viser to inokulering metoder til at indføre den fungale entomopathogen

Abstract

Beauveria bassiana er en fungal entomopathogen med evnen til at kolonisere planter endophytically. Som en endofyt, B. bassiana kan spille en rolle i at beskytte planter fra herbivory og sygdom. Denne protokol viser to inokulering metoder til at etablere B. bassiana endophytically i den fælles bønne (Phaseolus vulgaris), som forberedelse til de efterfølgende evalueringer af endophytic biologisk bekæmpelse. Planter er vokset fra overflade-steriliserede frø i to uger før modtagelsen af en B. bassiana behandling af 10 ⁸ konidier / ml (eller vand) påføres enten som en bladspray eller en jord drench. To uger senere er planterne høstet og deres blade, stilke og rødder udtages at evaluere endophytic svampekolonisering. Til dette prøver individuelt overfladesteriliseret, skåret i flere sektioner, og inkuberet i kartoffeldextroseagar medier i 20 dage. Medierne inspiceres hver 2-3 dage for at observere svampevækst sombundet med dele af anlægget og registrere forekomsten af B. bassiana at estimere omfanget af dens endophytic kolonisering. Analyser af inokulering succes sammenligne forekomsten af B. bassiana inden for en given plante del (dvs. blade, stængler eller rødder) på tværs af behandlinger og kontroller. Ud over den podningsmetode kan det specifikke resultat af forsøget afhænger af mål-afgrødeart eller sort, de fungale entomopathogen arter stamme eller isolat anvendes, og plantens vækstbetingelser.

Introduction

Fungal entomopathogens er vigtige regulatorer af insektpopulationer med betydeligt potentiale som mycopesticides ^1. Først for nylig har imidlertid fungale entomopathogens vist sig at forekomme som endofytter, både naturligt og som respons på forskellige inokulering metoder ^2. Den økologiske funktion endophytic svampe entomopathogens stadig stort set ukendt, men nogle undersøgelser har impliceret dem i plantevækst ^3,4, planteæder modstand ^5-8, og sygdomsresistens ^9,10. Det overordnede formål med de metoder, der præsenteres her, er at indføre en svampeinfektion entomopathogen som en endofyt som forberedelse til de efterfølgende evalueringer af endophytic biologisk bekæmpelse.

Beauveria bassiana (Balsamo) Vullemin (Ascomycota: Hypocreales) er den bedst undersøgte endophytic fungal entomopathogen ^5-9,11-19, og det er tilgængeligt som en kommerciel mycopesticide. Inokulering metoder testes for at fastslå 14,17, frø belægninger ¹⁸ og immersions ^14, kimroden dressinger ^13,15, rødder og jordstængler immersions ^11,16,18, stængel injektioner ^17, bladspraypræparater ^14,17,20 og blomster sprays ^19. Under anvendelse af disse fremgangsmåder har forskere indført B. bassiana i banan ^11, bønne ^7, cacao ^13, kaffe ^17, majs ^7, bomuld ^7, dato palm ^12, jute ^21, opiumvalmuer ^20, græskar ^7, radiata pine ^18, sorghum ^14, tomat ⁷ og hvede ^7. De seneste oplysninger tyder på, at endophytic B. bassiana har potentiale til at beskytte planter ikke blot leddyrsskadedyr ^5-7,22-27, men også fra nogle plantepatogener ^9.

Den fælles bønne (Phaseolus vulgaris) rangerer blandt de afgrøder mest sårbare over for skadedyrog sygdomme. Det kan påvirkes af mere end 400 skadedyr og 200 patogener, hvis angreb menes at være den mest begrænsende bean produktionsfaktor i regionerne ^28. Følgelig kan det fælles bønne være en fremragende model afgrøde at undersøge det fulde spektrum af endophytic biologisk bekæmpelse af B. bassiana. Som et første skridt i denne retning, beskriver denne artikel bladspraypræparater og jord makrodoser som inokulering metoder til at introducere B.bassiana som en endofyt i den fælles bønne.

Protocol

1. Planter

1. Overflade-sterilisere frø af johannesbrød (cv. Calima) ved at neddyppe dem i to minutter i 0,5% natriumhypochlorit og to minutter i 70% ethanol. Skyl frøene tre gange i sterilt destilleret vand.
2. Vurdere succes for din sterilisation ved udpladning 100 pi den sidste skyllevand på kartofler dextroxe agar (PDA) medier, og inkubering af pladen i 10 dage ved 25 ° C. Afslutte og genstarte eksperimentet eller ingen vækst ses på pladen.
3. Plante frøene i grupper på tre i potter indeholdende en steril blanding af jord og sand i forholdet 2:1. Overfør potter i et klimakammer ved 25 ° C, ca. 50% RH og 12 timer fotoperiode. En uge efter spiring, fjerne de to mindst livskraftige planter. Vand hver 2-3 dage med sterilt destilleret vand og befrugte 10 og 20 dage efter plantning med en 6 g / L vandig opløsning af NPK 15-15-15 gødning.

2. Svamp

1. Anskaf et kommercieltsielle formulering af Beauveria bassiana stammen GHA (Mycotrol SE, Laverlam, Cali, Colombia).
2. For at generere en enkelt spore stamkultur, suspendere ca. en podning løkke fuld af konidier i 1 ml af en 0,1% vandig opløsning af Triton-X 100 og vortex for 10 sec. Derefter plade 100 pi af suspensionen på 2,5% Noble agar og inkuberes i 24 timer ved 25 ° C. Overfør en enkelt spiring conidium ind i en 100 mm plade indeholdende PDA og vokse indtil den dækker hele pladen (ca. 3-4 uger).
3. Under sterile betingelser, skrabe svampevækst fra overfladen af ​​mediet og suspenderes i 10 ml sterilt 0,1% Triton-X 100. Vortex i et minut. Derefter filtreres suspensionen gennem et sterilt osteklæde til fjernelse af hyfer og opnå råmassesuspensionen.
4. Brug et hæmocytometer at estimere conidial koncentration af råmassesuspensionen. For at lette conidial tæller, forberede en 10.000-fold seriefortynding af bestanden, hver gang overføre 100 gl of konidiesuspension i 900 ul 0,1% Triton-X 100, og vortexbehandling i 10 sekunder før næste fortynding.
5. For at generere inoculum, justere råmassesuspensionen til en slutkoncentration på 10 ⁸ konidier / ml ved anvendelse af formlen:
   
6. At vurdere conidial levedygtighed, pladen 100 fil af 10.000 gange fortynding på 2,5% Noble agar og inkuberes i 24 timer ved 25 ° C. Derefter inspicere tre tilfældige grupper på 100 konidier at estimere procent spiring. Overvej en spiret conidium når en synlig kim røret længere end halvdelen af ​​diameteren af ​​de conidium rager ud fra den. Brug kun suspensionen, når den gennemsnitlige procent spiring overstiger 90%.

3. Inokulation

1. Indpodes planter, når de når deres første bladstadium (ca. 14 dage efter plantning). Vandplanter til jord kapacitet med steril destillereed vand 24 timer før vaccinationer.
2. For bladsprøjtning metoden ved hjælp af en manuel forstøver at anvende konidiesuspension (behandling) eller 0,1% Triton-X 100 (kontrol) til adaxial (øverste) overflade af bladene indtil de når mætning. Dæk toppen af ​​puljen med aluminiumsfolie for at undgå conidial afstrømning til jorden. Efter sprøjtning, dække planterne med en plasticpose i 24 timer for at opretholde et højt niveau af fugtighed letter fungal invasion.
3. For jordbunden drench metoden ved hjælp af en målecylinder at anvende 10 ml konidiesuspension (behandling) eller 0,1% Triton-X 100 (kontrol) til overfladen af ​​jorden ved bunden af ​​planten.
4. Efter inokulationer, returnerer planter til vækstkamre arrangere dem i et randomiseret komplet blokdesign. Ikke mindre end fire yderligere eksperimentelle blokke skal installeres, så evalueringer af plantevækst, ud over evalueringer af endophytic kolonisering, i det samme eksperiment.

4. Evaluations

1. Evaluere eksperimentet én blok ad gangen, vælge de blokke i tilfældig rækkefølge. Dette er især vigtigt for store eksperimenter, kan ikke evalueres på en enkelt dag.
2. Før behandling af en plante, måle og registrere sin højde fra bunden til det apikale meristem. Derefter rive forsigtigt og vaskes grundigt med rindende ledningsvand.
3. Fra hver plante, prøve to foldere, to stykker af rod og to stykker af stængel. Vælg brochure prøver tilfældigt fra den første sande blad af planten. Derefter opnå to stamceller prøver, 3 cm lang hver, fra midten af ​​anlægget og fra nær jordoverfladen. Endelig får to pælerod prøver, også 3 cm lange hver, fra midten af ​​roden og fra 1 cm bag rodspids. Anbring prøverne på tre separate papirposer og etiket korrekt.
4. Efter vask og prøvetagning alle planter i en blok, begynder ved behandling af bladene, så rødder, og endelig stilke.
5. Surface sterilisere tspørgsmål i en steril laminar flow hætte som i 1,1, ovenfor. Skyl hver prøve tre gange ved nedsænkning i sterilt destilleret vand og lad det tørre i sterilt håndklæde papir. Derefter dissekere og kassere de ydre kanter, hvor endofytter kan være blevet fjernet på grund af kontakt med desinficerende midler.
6. Skær det trimmede prøve i seks sektioner, med et gennemsnit 6x6 mm for blade og 6 mm lange for stængler og rødder. Pladen de seks sektioner på en 60 mm petriskål med PDA-medium suppleret med antibiotika tetracyclin, streptomycin og penicillin ved 2 mg / l hver. Tætne pladen med parafilm og inkuberes i mørke ved 25 ° C. Hver plante giver seks plader, to pr plante del.
7. Ændre skyllevandet efter behandling hver blok af et givet plantedel. Før bortkastning af brugte skyllevand, plade en 100 gl prøve på PDA medie og inkuberes i 10 dage ved 25 ° C for at vurdere sterilisering succes. Hvis svampevækst ensues, ikke anser de tilsvarende prøver til analyse.
8. Efterse pladerne hver 2-3 dag i 20 dage for at observere og registrere svampevækst. Skattestyrelsen og overførsel plante sektioner udviser tilstedeværelse af fungale endofytter til plader, der indeholder frisk PDA. Dette vil undgå forurening af tilstødende dele af anlægget i den oprindelige plade.
9. Optag B. bassiana vækst fra dele af anlægget. Beauveria bassiana kan identificeres ved karakteristiske hvide tætte mycelier bliver creme til bleggul ved kanten. Når du er i tvivl, skal du montere en prøve i en dråbe vand og inspicere under et mikroskop, søger kugleformet sporer og zigzag-formede konidioforer, karakteristisk for arten.
10. Brug yderligere eksperimentelle blokke for at evaluere virkningen af ​​behandlingerne på plantebiomasse. Først måler deres højde fra bunden til toppen af ​​det apikale meristem. Derefter forsigtigt rive og vask planter i ledningsvand og lad dem tørre ved 45 ° C i tre dage for at bestemme deres tørvægt.

Representative Results

B. bassiana var i stand til endophytically-kolonisere P. vulgaris som reaktion på den påviste inokulering behandlinger (figur 1). Både bladsprøjtning og jord makrodoser resulterede i endophytic kolonisering af B. bassiana i over 80% af de behandlede planter (Figur 2). Imidlertid er omfanget af kolonisering afhang af planten evalueret del og podning anvendte metode. Blade reagerede bedst spray inokulationer. Rødder, på den anden side reagerede kun gennembløde inokulationer. Endelig stammer reagerede på lignende måde som begge inokulering metoder. B. bassiana blev ikke påvist i nogen af de kontrol-plante sektioner.

Uafhængigt af de behandlingsmuligheder, endofytter andre end B. bassiana voksede fra 15% af de evaluerede plante sektioner, men de blev dissekeret ud fra medier plader, før de kunne invadere omkringliggende sektioner og påvirke resultaterne.

Behandling og kontrol planterne var synligt uskelnelige to uger efter vaccination. Ingen forskelle blev påvist i deres tørvægt og deres højde.

Figur 1. Repræsentative resultater af inokulering behandlinger på endophytic kolonisering af bønneplanter (Phaseolus vulgaris cv Calima.) Ved Beauveria bassiana øverst til venstre:. Kontrol plader med ingen vækst. Øverst til højre: Fungal endofyt fra en plante sektion forurener hele pladen. Nederst til venstre: B. bassiana vokser fra to dele af anlægget. Nederst til højre: Endophytic B. bassiana konidier og konidioforer som ses under et mikroskop.

Figur 2. Effekt af podning behandlinger på endophytic kolonisering af bean planter (Phaseolus vulgaris cv. Calima) fra Beauveria bassiana, to uger efter inokulationer med stammen GHA. Procent kolonisering repræsenterer antallet af koloniserede plante sektioner divideret med antallet af dyrkede sektioner.

Discussion

Mange faktorer kan påvirke den specifikke resultat af et eksperiment at etablere en svampeinfektion entomopathogen som en endofyt. Vore resultater viser podningsmetode er en af ​​dem. Biologiske faktorer at eksperimentere med bl.a. afgrøden arter eller kultivar valgt og svampe entomopathogen arter stamme eller isolere brugt. Andre faktorer til at overveje at manipulere omfatter koncentrationen af ​​inoculum alder af anlægget i løbet af vaccinationer, og anlæggets vækstbetingelser.

Det ville være ideelt for en podningsmetode at resultere i systemisk plante kolonisering af en fungal entomopathogen ^14,17,18,21. I stedet fremgår det, at inokulation fremgangsmåder tendens til at favorisere en bestemt mønster af lokale kolonisering. I kaffe, for eksempel bladspraypræparater favoriserer blad kolonisering henviser jord drenches favoriserer rodkolonisering ^17. Vi fandt samme mønster i den fælles bønne. I sidste ende bør valget af podningsmetode værestyret af den påtænkte placering af endofyt i en plante, formentlig matcher niche af målet planteæder eller plantepatogen.

Skønt den almindeligvis anvendes, endofyt påvisning og kvantificering baseret på mediekulturer kan være dyrt, besværligt og risiko for fejl. For eksempel var i alt 10.800 plante sektioner (udpladet på 1800 petriskåle) evalueres i et forsøg på at optimere B. Bassiana vaccinationer på banan ^16. Ud af disse blev 4.496 sektioner koloniseret af en formodet B. bassiana, som fastlægges primært af kolonimorfologi. Det er klart, ville en mikroskopisk kontrol af de arter, for hver koloni have været en ønskelig, men ubetalelig skridt. På den anden side, blev 1176 dele koloniseret af andre svampe og blev kasseret, og behandlet som manglende data ^16. Sandsynligheden eksisterer imidlertid, at B. bassiana var en fattig konkurrent eller langsommere til at vokse, og kunne have tiden kommet fra disse sektioner, hvis enllowed tilstrækkelig tid. Derfor endofyt detektionsmetoder baseret på mediekulturer er underlagt falske positiver og falske negativer. Følgelig udvikling af mere pålidelig påvisning og kvantificering, for eksempel dem baseret på polymerasekædereaktion (PCR) assays ^20,21,24, er velbegrundet.

Det ultimative mål for inokulering eksperimenter bør være at udvikle en effektiv behandling, der giver holdbar systemisk modstand mod herbivory og / eller sygdom. En plausibel, men hidtil uafprøvede, hypotese er, at omfanget af endophytic kolonisering bør korrelere positivt med graden af ​​endofyt-medieret resistens. Et naturligt næste skridt efter raffinering podningen metoder, kunne derfor være at undersøge denne sammenhæng. Flere video-protokoller kan hjælpe forskerne designe en passende modstand analyse for et målparasitten eller patogen ^29-31. I sidste ende, er det denne analyse, hvad der vil afgøre succes inokulation metode, og den dermed forbundne potentiale for endophytic biologisk bekæmpelse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number
Mycotrol SE	Laverlam	4167
Noble agar	Sigma	A5431-250G
Penicillin G sodium salt	Sigma	P3032-25MU
Petri dish (100 x 15 mm)	Fisher	08-757-12
Petri dish (60 x 15 mm)	Fisher	08-757-13A
Potato dextrose agar	Difco	213400
Regular bleach (NaOCl)	CLOROX	N/A
Streptomycin sulfate salt	Sigma	S6501-25G
Tetracycline	Sigma	T3258-25G
Triple quince (NPK)	ABOCOL	N/A
Triton X-100	Sigma	X-100
EQUIPMENT
Biological safety cabinet	NuAire	NU-425-600
Hemocytometer	Fisher	02-671-10
Leica DM LB microscope	Leica	N/A