Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

कार्यात्मक रूपांकनों और उनके बंधन पार्टनर्स के पेप्टाइड आधारित पहचान

Published: June 30, 2013 doi: 10.3791/50362
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology, Biochemistry, & Immunology, Morehouse School of Medicine, 2Institute for Systems Biology, 3Advanced Medical & Dental Institute, Universiti Sains Malaysia

Summary

Exosomes में एचआईवी -1 Nef का स्राव अंतर्निहित तंत्र को काटना तकनीक वर्णित हैं. Nef और प्रोटीन अभिकर्मक से व्युत्पन्न विशिष्ट कम पेप्टाइड्स संरचना, समारोह, और Nef के स्राव संशोधन क्षेत्र के बंधन भागीदारों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे थे. इन प्रक्रियाओं के कई यंत्रवत अध्ययनों में सामान्य प्रासंगिकता है.

Abstract

हमारे मामले एचआईवी -1 Nef में, पूर्ण लंबाई प्रोटीन में पाए रूपांकनों से व्युत्पन्न विशिष्ट कम पेप्टाइड्स, उनके जैविक समारोह बनाए रखने के लिए, लेकिन यह भी प्रतिस्पर्धात्मक रूप से पूर्ण लंबाई प्रोटीन के कार्य को बाधित कर सकते हैं न केवल. 20 Nef स्कैनिंग पेप्टाइड्स, प्रत्येक अपने पड़ोसी देश के 10 अमीनो एसिड अतिव्यापी के साथ लंबाई में 20 अमीनो एसिड, का एक सेट apoptosis की इसके शामिल होने के लिए जिम्मेदार Nef में रूपांकनों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया. इन apoptotic रूपांकनों युक्त पेप्टाइड्स पूर्ण लंबाई Nef प्रोटीन को बराबर के स्तर पर apoptosis प्रेरित. Nef का स्राव संशोधन क्षेत्र (SMR) से प्राप्त एक दूसरे पेप्टाइड, exosomes में Nef के स्राव (exNef) में शामिल सेलुलर प्रोटीन के साथ बातचीत करने की क्षमता को बनाए रखा. इस SMRwt पेप्टाइड Nef के SMR मूल भाव को विशेष रूप से बाँध कि सेलुलर प्रोटीन को अलग करने के लिए सह immunoprecipitation प्रयोगों में "चारा" प्रोटीन के रूप में इस्तेमाल किया गया था. प्रोटीन अभिकर्मक और एंटीबॉडी निषेध शारीरिक रूप से बातचीत की शर्त को बाधित करने के लिए इस्तेमाल किया गया थासमझना Nef और mortalin, पृथक SMR बाध्यकारी प्रोटीन में से एक, और प्रभाव एक फ्लोरोसेंट आधारित exNef स्राव परख के साथ मापा गया था. SMR मूल भाव है कि बाँध सेलुलर प्रोटीन के लिए पूर्ण लंबाई Nef outcompete करने SMRwt पेप्टाइड की क्षमता, यह exNef स्राव के पहले अवरोध बना. इस प्रकार, पूर्ण लंबाई प्रोटीन में पाए रूपांकनों से व्युत्पन्न विशिष्ट कम पेप्टाइड्स के अद्वितीय गुणों का उपयोग जो यहाँ वर्णित तकनीक, रोजगार से, एक प्रोटीन में कार्यात्मक रूपांकनों की पहचान और रोगजनक कार्यों की पेप्टाइड आधारित अवरोधकों का विकास तेज हो सकती है.

Introduction

एंटी रेट्रोवायरल थेरेपी के आगमन के साथ, पश्चिमी दुनिया में एड्स महामारी धीमा है, लेकिन कटौती नहीं, और एचआईवी के प्रसार को दुनिया भर में एक प्रमुख स्वास्थ्य बोझ होना जारी कर दिया गया है. मामूली प्रभावी RV144 थाई परीक्षण के अपवाद के साथ, एचआईवी टीके अब तक संक्रमण से बचाने के लिए विफलता से पता चला है. इस प्रकार, अतिरिक्त, संभावित चिकित्सीय लक्ष्य में अनुसंधान अभी भी warranted है.

सीडी 4 टी सेल रिक्तीकरण के साथ साथ, लगातार सामान्यीकृत प्रतिरक्षा सक्रियण एचआईवी संक्रमण की एक बानगी है. इस पुरानी प्रतिरक्षा सक्रियण (सीआईए) सेल कारोबार, सक्रिय और भेदभाव लिम्फोसाईटिक subpopulations, सेलुलर थकावट और बुढ़ापा, और सक्रियण प्रेरित कोशिका मृत्यु (AICD) 1,2,3 के माध्यम से टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं की हत्या में बढ़ जाती है की ओर जाता है, और यह अच्छी तरह से रोग प्रगति 4,5,6,7,8,9,10,11,12 की मजबूत predictors में से एक के रूप में स्थापित है. हालांकि, तंत्र सीआईए और सीडी 4 अंतर्निहितएचआईवी संक्रमण में कमी टी सेल पूरी तरह से स्पष्ट किया जा रह है.

हमारी प्रयोगशाला और दूसरों से साक्ष्य एचआईवी प्रोटीन Nef (नकारात्मक नियामक फैक्टर) एचआईवी -1 से संक्रमित कोशिकाओं 13,14 से exosomes में अपने स्राव को प्रेरित करता है जिसमें रोग प्रगति के लिए एक मॉडल (चित्रा 1) के लिए हमें का नेतृत्व किया. ये Nef युक्त exosomes (exNef) असंक्रमित सीडी 4 टी कोशिकाओं 15,16 सहित सेल प्रजातियों की संख्या में apoptosis प्रेरित. वैकल्पिक रूप से, monocytes में / मैक्रोफेज exNef बदल जीन अभिव्यक्ति पैटर्न, जैसे साइटोकाइन अभिव्यक्ति, और अनिर्धारित प्रतिरक्षा सक्रियण के एक राज्य को उत्पन्न करने के लिए प्रकट होता है. सबूत के इस शरीर सीआईए और सीडी 4 टी सेल रिक्तीकरण में exNef के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का पता चलता है.

Exosomal तस्करी मार्ग exNef स्राव के इंजीनियरिंग उपन्यास inhibitors में उपयोगी होगा हेरफेर करने Nef की क्षमता अंतर्निहित तंत्र को समझना. ExNef स्राव का निषेध सीडी 4 टी सेल रिक्तीकरण कम हो जाना चाहिएऔर सीआईए ड्राइव एचआईवी / एड्स के रोगजनन कि.

एचआईवी / एड्स रोग प्रगति और इस मॉडल पर बनाया गया है कि बाद के डेटा के लिए हमारे मॉडल के लिए नेतृत्व किया है कि सबूत इकट्ठा करने के लिए, हम हमारे exNef स्राव की आनुवंशिकी का विश्लेषण करने की अनुमति दी है कि उपन्यास अभिकर्मकों और तरीकों की एक संख्या विकसित की है, और यह निर्धारित करने के लिए शुरू सेलुलर प्रोटीन शामिल किया गया. प्रारंभिक काम में, हम Nef प्रोटीन दर्शक कोशिकाओं में apoptosis लाती और Nef ट्रांसफ़ेक्ट और एचआईवी संक्रमित कोशिकाओं से extracellularly 15 जारी किया गया है कि पाया. एसडीएफ 1α (वैकल्पिक splicing अल्फा के साथ फैक्टर -1 व्युत्पन्न stromal सेल,) से प्राप्त पेप्टाइड्स पहले से ज्यादा पूरी लंबाई अणु 17 के बंधन और संकेत गतिविधि का बनाए रखने के लिए दिखाया गया था. हम Nef के पेप्टाइड्स पूर्ण प्रोटीन की apoptotic गतिविधि के कुछ, और इन पेप्टाइड्स जरूरी Nef apoptotic डोमेन (ओं) होंगे कि बनाए रखने के लिए हो सकता है कि अनुमान लगाया. इन पेप्टाइड्स की पहचान है, और फलस्वरूप Nef लिएapoptotic डोमेन (ओं), हम एनआईएच एड्स अनुसंधान और संदर्भ अभिकर्मक कार्यक्रम से 20 एचआईवी -1 Nef स्कैनिंग पेप्टाइड का एक सेट प्राप्त की. इन 20 आ पेप्टाइड्स, अपने पड़ोसी देश के 10 अमीनो एसिड अतिव्यापी प्रत्येक उनके पिछले अमीनो एसिड, यानी N20 फैला Nef अमीनो एसिड 1-20, N30 फैला Nef अमीनो एसिड 11-30, आदि 16 की संख्या से नाम हैं. हम इन कोशिकाओं में पूर्ण लंबाई Nef प्रोटीन प्रेरित apoptosis में दो अलग 10 आ डोमेन अतिव्यापी विशिष्ट पेप्टाइड्स extracellularly टी कोशिकाओं को उजागर पाया. इन Nef व्युत्पन्न apoptotic पेप्टाइड्स के बाद के विश्लेषण के शारीरिक रूप से इन पेप्टाइड्स प्रतिस्पर्धात्मक रूप CXCR4 और अपनी प्राकृतिक ligand के एसडीएफ 1α के बीच बंधन को बाधित करने की अनुमति दी है कि बाध्यकारी कैनेटीक्स के साथ टी कोशिकाओं की सतह पर केमोकाइन रिसेप्टर CXCR4, के साथ बातचीत करने की क्षमता का पता चला. अंत में, CXCR4 के साथ Nef व्युत्पन्न apoptotic पेप्टाइड 'बातचीत apoptosis के लिए अग्रणी इन टी कोशिकाओं में एक तनाव प्रतिक्रिया प्रेरित पाया गया था. यह सबूत हमारे पास quic अनुमतिkly नक्शा Nef के कार्यात्मक डोमेन, ऐसे alanine स्कैनिंग mutagenesis के रूप में मानक डीएनए mutagenic तकनीकों का प्रयोग बहुत लंबे समय लिया होगा कि एक ऐसी प्रक्रिया है. यह भी इन छोटी Nef व्युत्पन्न पेप्टाइड्स पूर्ण लंबाई प्रोटीन में apoptotic डोमेन की जैविक समारोह को बनाए रखा है कि पता चला है.

बाह्य Nef के लिए एक भूमिका की पहचान करने के बाद, टी कोशिकाओं की यानी apoptosis, हम Nef कोशिकाओं से स्रावित था कि कैसे एक बेहतर समझ की मांग की. उत्परिवर्तित Nef निर्माणों की एक श्रृंखला का उपयोग करना, हम एचआईवी Nef दोनों के एन टर्मिनल क्षेत्रों में अत्यधिक संरक्षित Nef प्रोटीन रूपांकनों मैप किया है, और exNef स्राव 13 के लिए महत्वपूर्ण हैं कि अपने रीसस मकाक बराबर SIV के मैक (बंदर इम्यूनो वायरस) NEF,. इन रूपांकनों की एक, स्राव संशोधन क्षेत्र (SMR, 66VGFPV70) ने अपने पांच अमीनो एसिड के किसी भी या तो बहुत exNef स्राव को कम या समाप्त कर दिया की alanine स्थानापन्न के रूप में, विशेष रूप से महत्वपूर्ण था. सक्रिय आकृति के सी के माध्यम से कोशिकाओं को दिया जबhariot प्रोटीन डिलिवरी अभिकर्मक, एक झंडा पेप्टाइड अनुक्रम (SMRwt) से जुड़ी SMR युक्त पेप्टाइड 18 कोशिकाओं Nef ट्रांसफ़ेक्ट और एचआईवी संक्रमित दोनों से exNef स्राव बाधित पाया गया था. पेप्टाइड्स के साथ हमारे पिछले अनुभव के आधार पर, हम अणु और exNef स्राव में Nef SMR की भूमिका अंतर्निहित तंत्र को स्पष्ट करने के लिए इस पेप्टाइड का उपयोग करने का फैसला किया.

हमारे "चारा प्रोटीन के रूप में" SMRwt पेप्टाइड का उपयोग करना, हम असंक्रमित टी सेल lysates 18 से SMR के सेलुलर बाध्यकारी भागीदारों सह immunoprecipitated. झंडा पेप्टाइड अनुक्रम विरोधी झंडा आत्मीयता राल का उपयोग कर SMRwt पेप्टाइड पर कब्जा करने के लिए एक सुविधाजनक संभाल प्रदान की. SMRwt पेप्टाइड में उत्परिवर्तन alanine के लिए एक एकल वेलिन exNef स्राव के अपने अवरोध को खत्म करने के लिए पर्याप्त था कि हमारे पिछले निष्कर्ष हम SMR के लिए विशिष्ट नहीं सह immunoprecipitated प्रोटीन बाहर शासन करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक सुविधाजनक, अति विशिष्ट नियंत्रण पेप्टाइड (SMRmut) की पहचान की. एस के साथ एक पेप्टाइड का उपयोगबल्कि पूर्ण लंबाई प्रोटीन से ब्याज की pecific डोमेन हमें Nef 19 में अन्य डोमेन के लिए बाध्य है कि सेलुलर कारकों के दर्जनों की स्क्रीनिंग को बायपास करने की अनुमति दी.

एक बार जब हम एक तार्किक अगले कदम पहचान सेलुलर बाध्यकारी भागीदारों जैविक समारोह 18 के लिए महत्वपूर्ण हैं कि दिखाने के लिए था, SMR बाध्यकारी भागीदारों की पहचान की. यह पूरा करने के लिए मानक प्रक्रिया जैविक समारोह पर लक्ष्य प्रोटीन विशिष्ट miRNA या siRNA में, और बाद में परख प्रभाव का उपयोग कर पछाड़ना प्रोटीन का स्तर है. हम इस मामले में एक SMR बाध्यकारी प्रोटीन में, कि लक्ष्य के उत्पादन को कम करने, लक्ष्य mRNA के अनुवाद को रोकता है जो miRNA के पछाड़ना, प्रदर्शन किया. लक्ष्य प्रोटीन की यह कमी एक अप्रत्यक्ष प्रभाव है, और संभवतः लक्षित प्रोटीन नतीजतन अंदर एक भूमिका निभाता जैविक समारोह पर एक देरी प्रभाव पड़ता है, हम भी सीधे की गतिविधि में खलल न डालें, तो यह निर्धारित करने के लिए कम आम एंटीबॉडी निषेध तकनीक कार्यरतलक्ष्य प्रोटीन जैविक समारोह कम कर देता है या समाप्त. इस प्रक्रिया में, एंटीबॉडी लक्षित प्रोटीन के खिलाफ उठाया रथ अभिकर्मक का उपयोग कर सेल में ट्रांसफ़ेक्ट, और लक्ष्य प्रोटीन या तो समारोह की अपनी साइट से sequestering यह, या अपने प्रासंगिक बाध्यकारी डोमेन रोकने के साथ सीधे बातचीत कर रहे हैं. इस प्रक्रिया के माध्यम से लक्ष्य प्रोटीन का निषेध सीधे अपने कार्य बाधित है, और आगे जैविक समारोह के लिए लक्ष्य प्रोटीन के महत्व की पुष्टि के द्वारा आरएनए पछाड़ना प्रक्रियाओं के पूरक कर सकते हैं.

रथ अभिकर्मक कोशिकाओं में पेप्टाइड्स और प्रोटीन पहुंचाने में कारगर है, इस प्रक्रिया में समय लगता है और प्रयोगों के प्रकार की सीमा जैसे लंबे समय तक या दोहराया जोखिम और इन विवो जानवरों के अध्ययन में किया जा सकता है. नतीजतन, हम निष्क्रिय कोशिकाओं द्वारा उठाया जा सकता है कि एक पेप्टाइड उत्पन्न करने SMRwt पेप्टाइड (SMRwt-सीपीपी) 18 के लिए एक सेल मर्मज्ञ पेप्टाइड (सीपीपी) अनुक्रम जोड़ासंस्कृति मीडिया से. इस संस्करण में बाधा exNef स्राव में पूर्व के रूप में प्रभावी था.

इन प्रकाशित प्रयोगों से साक्ष्य प्रतिस्पर्धी निषेध के माध्यम से पूर्ण लंबाई प्रोटीन के समारोह के विरोध करने के लिए, और इन रूपांकनों कि बाँध प्रोटीन को अलग करने के लिए विशिष्ट कार्यात्मक रूपांकनों युक्त छोटे पेप्टाइड की क्षमता को दर्शाता है. इनमें से एक तकनीक कई प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में उपयोगी होना चाहिए कि उम्मीद करेंगे. उन्होंने यह भी कई सेलुलर प्रक्रियाओं के इंजीनियरिंग उपन्यास पेप्टाइड inhibitors में प्रभावी होना चाहिए, सीपीपी दृश्यों के लिए कड़ी से आगे बढ़ाया जा सकता है कि एक समारोह.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

मैं जैविक विश्लेषण में लघु पेप्टाइड्स का प्रयोग करें

I.1. पेप्टाइड्स का प्रयोग मानचित्रण जैविक कार्यात्मक रूपांकनों

  1. Nef स्कैनिंग पेप्टाइड्स के साथ कोशिकाओं का इलाज
    1. ब्याज के क्षेत्र स्कैनिंग पेप्टाइड्स के एक सेट की खरीद. हमारे प्रयोगों, 20mer पेप्टाइड्स, 10 एमिनो एसिड ओवरलैप के साथ, पूरे एचआईवी -1 Nef प्रोटीन (205 एए) फैले लिए एड्स अभिकर्मक कार्यक्रम से प्राप्त किया गया. निम्नानुसार पेप्टाइड्स व्यक्तिगत assayed हैं:
    2. 10 एनजी / सेल संस्कृति के माध्यम से पेप्टाइड की मिलीलीटर जोड़ें.
    3. सेल संस्कृतियों Jurkat को प्रति प्लेट संस्कृति के माध्यम से 10 मिलीलीटर जोड़ें.
    4. 37 में 24 घंटे के लिए संस्कृतियों सेते डिग्री सेल्सियस
  2. Apoptosis के टर्मिनल deoxynucleotidyltransferase की मध्यस्थता dUTP बायोटिन निक अंत लेबल (TUNEL के) परख
    1. 1X पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें, और 1X पीबीएस, पीएच 7.4 में 4% paraformaldehyde के साथ कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए तय कर लो.
    2. 10 के लिए 1X पीबीएस के साथ धोएं, और 0.1% के साथ permeabilize ट्राइटन X-100कमरे के तापमान पर मि.
    3. 1X पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार कुल्ला.
    4. एक कंप्यूटर नियंत्रित माइक्रोस्कोपी प्रणाली पर epifluorescence के द्वारा दाग कोशिकाओं की गणना.

I.2. पेप्टाइड्स का उपयोग कर प्रतियोगी निषेध विश्लेषण

  1. रथ प्रोटीन डिलिवरी अभिकर्मक किट का उपयोग कर पेप्टाइड्स के सह अभिकर्मक
    1. अभिकर्मक प्रतिक्रिया मिश्रण प्रति, के साथ 100 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए, wtNef-GFP प्लाज्मिड डीएनए की 1 ग्राम और wildtype SMR डोमेन से व्युत्पन्न पेप्टाइड्स, या SMR आकृति में व्यक्तिगत अमीनो एसिड की alanine बदलने युक्त पेप्टाइड्स दोनों में से 100 एनजी पतला 1X पीबीएस.
    2. बाँझ पानी के साथ 100 μl के अंतिम मात्रा को रथ अभिकर्मक का 1/10 के कमजोर पड़ने के 6 μl पतला, पतला और डीएनए पेप्टाइड मिश्रण के साथ गठबंधन.
    3. रथ / डीएनए पेप्टाइड परिसर के गठन की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
    4. 5 मिनट के लिए 600 XG पर centrifugation द्वारा गोली 3 एक्स 10 5 Jurkat कोशिकाओं.
    5. 1X पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं, और रथ / डीएनए पेप्टाइड परिसर में resuspend.
    6. निलंबन के लिए सीरम मुक्त 1640 RPMI मध्यम के 400 μl जोड़ें और 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति प्लेटों में कोशिकाओं को सेते हैं.
    7. प्रत्येक थाली से 10% FBS युक्त ताजा RPMI 1640 के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 37 पर 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते डिग्री सेल्सियस
    8. हार्वेस्ट कोशिकाओं और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा अभिकर्मक दक्षता का निर्धारण.
  2. पेप्टाइड निषेध की nef-GFP के स्राव फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर परख
    1. काटा कोशिकाओं से कोशिका मुक्त वातानुकूलित मीडिया लीजिए, और एक 96 अच्छी तरह से काला microtiter प्लेट की व्यक्तिगत कुओं को 100 μl हस्तांतरण.
    2. उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 485 एनएम और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाइयों में 515 एनएम के साथ एक Tecan GENEios fluorimeter पर मीडिया में उपाय GFP प्रतिदीप्ति.
    3. नियंत्रण में GFP प्रतिदीप्ति का स्तर (कोशिकाओं से मीडिया Nef-GFP के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट और एक पेप्टाइड तले सेट) 100% पर.
    4. कोशिकाओं से मीडिया Nef-GFP के स्राव में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए विभिन्न SMR पेप्टाइड्स के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट में GFP प्रतिदीप्ति के स्तर के लिए इस की तुलना करें.

I.3. चारा के रूप में पेप्टाइड्स का प्रयोग आकृति बंधन पार्टनर्स अलग

  1. SMR पेप्टाइड्स के साथ सह immunoprecipitation
    1. 37 में 10% FBS युक्त 1640 RPMI मध्यम में Jurkat कोशिकाओं ग्रो एक टी -75 टिशू कल्चर फ्लास्क में डिग्री सेल्सियस, और 4 बजे 20 मिनट के लिए 1000 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस अभिकर्मक दक्षता का निर्धारण करते हैं, एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे थाली रखकर, छवियों पर कब्जा है, और बाद में कुल और लेबल की कोशिकाओं गिनती और प्रतिशत लेबल कोशिकाओं का निर्धारण.
    2. 1 मिलीलीटर 1X पीबीएस में सेल गोली Resuspend, और एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब को हस्तांतरण. 1 मिनट के लिए 1000 XG पर microcentrifuge. कोमल pipetting द्वारा 1 मिलीलीटर α-झंडा lysis बफर में गोली Resuspend. Lysis बफर: मिक्स 50 मिमी Tris • एचसीएल 7.4 पीएच, 150 मिमी सोडियम सीएचएलoride [NaCl], 1 मिमी phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड स्तनधारी सेल और ऊतक के अर्क के साथ प्रयोग के लिए [PMSF], और 10 मिलीग्राम / μl protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल के साथ 1 मिमी EDTA, और 1% ट्राइटन X-100, [तस्वीर, सिग्मा]. उपयोग करने से पहले तुरंत करें.
    3. विभिन्न 5 मिनट के लिए 2,000 XG पर microcentrifuge निलंबन, और गोली से 10 मिनट सेल मलबे और डीएनए, क्रमशः के लिए 13,000 XG पर. तैरनेवाला (इसके बाद "lysate" के रूप में) ले लीजिए.
    4. Lysate प्रोटीन की 1 मिलीग्राम और SMRwt या SMRmut पेप्टाइड विरोधी झंडा M2 आत्मीयता जेल (, सिग्मा इसके बाद "राल" कहा जाता है) का 20 μl के लिए या तो 1 ग्राम जोड़ें. यहां इस्तेमाल SMRwt और SMRmut दोनों पेप्टाइड्स में एम्बेडेड एक झंडा टैग अनुक्रम है कि नोट. सह आईपी बफर में 1 मिलीलीटर (α-झंडा lysis बफर ऋण PMSF और पीआईसी) की एक अंतिम मात्रा करने के मिश्रण ले आओ. अंत ओवर के अंत रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर मिश्रण सेते हैं. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, या तो पेप्टाइड के अभाव में राल के साथ lysate सेते हैं.
    5. पेलेटी 5000 में microcentrifugation द्वारा राल - 30 सेकंड के लिए 8000 XG. राल नमूना संभालने से पहले 2 मिनट के लिए व्यवस्थित और फिर सतह पर तैरनेवाला aspirate करने की अनुमति दें. किसी भी राल हस्तांतरण करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, एक संकीर्ण अंत पिपेट टिप, या एक हैमिल्टन सिरिंज के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें. संकीर्ण अंत विंदुक युक्तियाँ यह आंशिक रूप से बंद कर दिया है जब तक एक प्लास्टिक विंदुक टिप के उद्घाटन चुटकी संदंश का उपयोग किया जा सकता है. 500 धोने बफर के μl (50 मिमी Tris • एचसीएल 7.4 पीएच, और 150 मिमी NaCl). साथ राल चार बार धोएं धोने बफर के 50 μl में 3X झंडा पेप्टाइड की 15 ग्राम (सिग्मा) के साथ समयबद्ध सेलुलर प्रोटीन Elute और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए घुमाव / हिलनेवाला पर सेते हैं.
    6. Laemmli नमूना बफर (जैव रेड) में उबलते द्वारा पीछा एसीटोन, वर्षा से eluates ध्यान लगाओ. एक 4-20% Tris-एचसीएल मानदंड मिल में बना हुआ जेल (जैव रेड) पर एसडीएस पृष्ठ से प्रोटीन को अलग करें. Coomassie खूब ब्लू आर 250 (जैव रेड) के साथ जेल दाग. नोट: मास स्पेक्ट्रोमेट्री पहचान प्रयोगों के लिए (
  2. Nef-GFP प्रोटीन के साथ सह immunoprecipitation
    1. 0.02% बीच 20 (पीबीएस-टी) के साथ 1X पीबीएस के 1 मिलीलीटर में विरोधी GFP murine मोनोक्लोनल की 2 ग्राम के साथ Dynabeads प्रोटीन जी चुंबकीय मोती (Invitrogen) के 50 μl मिलाएं. 4 में 1 घंटे के लिए एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब में अंत से अधिक अंत रोटेशन के साथ मिश्रण सेते डिग्री सेल्सियस
    2. चुंबकीय लटकती तैरनेवाला को हटाने के बाद की अनुमति एक 1.5 मिलीलीटर MagnaSphere प्रौद्योगिकी चुंबकीय पृथक्करण स्टैंड (Promega कॉर्प, मैडिसन, WI) पर ट्यूब रखकर बफर से मोती अलग करें. कोमल pipetting उपयोग कर पीबीएस आयकर के 1 मिलीलीटर के साथ विरोधी GFP लेपित मोती धो लें.
    3. एम 15 के लिए 1 एक्स RIPA के 1 मिलीलीटर + बफर कोमल pipetting और ऊष्मायन से साथ Nef-GFP ट्रांसफ़ेक्ट Jurkat कोशिकाओं lyseबर्फ पर. RIPA + बफर: 10X RIPA lysis बफर, 7.4 पीएच [Millipore, बेडफोर्ड, एमए] बाँझ पानी में पतला 1:10, 0.02% सोडियम azide [सिग्मा], और 0.1% सोडियम dodecyl सल्फेट [एसडीएस], 1 मिमी PMSF और 10 μl के साथ / एमएल तस्वीर का उपयोग करने से पहले तुरंत जोड़ा.
    4. गोली 10 मिनट के लिए 2,000 XG पर microcentrifugation द्वारा सेल मलबे. तैरनेवाला (इसके बाद "lysate" के रूप में) ले लीजिए.
    5. विरोधी GFP लिपटे मोतियों को lysate प्रोटीन की 1 मिलीग्राम जोड़ें, 1X RIPA + बफर के साथ 1 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए अंत से अधिक अंत रोटेशन के साथ मिश्रण सेते नोट: पेप्टाइड प्रतियोगिता पढ़ाई के लिए, Lysate प्रोटीन के 1 मिलीग्राम से पहले विरोधी GFP लिपटे मोतियों के लिए जोड़ा जा रहा है 1X RIPA + बफर के 1 मिलीलीटर में SMRwt या SMRmut पेप्टाइड की 2 ग्राम के साथ पहले से incubated किया जा सकता है.
    6. धोने बफर के 1 मिलीलीटर में मेजबान के माध्यम से मोती धो (50 मिमी Tris • एचसीएल 7.4 पीएच, 150 मिमी NaCl, और 0.1% के बीच 20). 4 पर 5 मिनट डिग्री सेल्सियस के अंत से अधिक अंत रोटेशन के साथ सेते मोती च अलग करेंरॉम चुंबकीय पृथक्करण स्टैंड का उपयोग कर धोने. क्रमश: 250 मिमी और 300 मिमी NaCl, जिसमें धोने buffers के साथ मोती एक दूसरी और तीसरी बार धोएं.
    7. पीबीएस के 200 μl में मोती Resuspend, एक स्वच्छ ट्यूब मिश्रण हस्तांतरण, और चुंबकीय स्टैंड पर धोने से मोती अलग. 95 डिग्री सेल्सियस पर Laemmli नमूना बफर 5 मिनट के 50 μl में मोती उबाल लें, मिश्रण कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए शांत करने के लिए अनुमति देते हैं, और फिर अलग होने के लिए चुंबकीय स्टैंड पर मिश्रण जगह है, और supernatants ("eluates") इकट्ठा .
    8. एक 8-16% Tris-एचसीएल मानदंड मिल में बना हुआ जेल पर एसडीएस पृष्ठ से eluate के प्रोटीन को अलग करें.
  3. मास स्पेक्ट्रोमेट्री
    1. आबकारी Coomassie से सना हुआ जैल से ब्याज की प्रोटीन बैंड.
    2. 37 पर 45 मिनट के लिए 10 मिमी 1,4 dithiothreitol (डीटीटी) में नमूनों को कम डिग्री सेल्सियस
    3. 25 पर 45 मिनट डिग्री सेल्सियस के लिए 55 मिमी iodoacetamide में नमूने केलेट
    4. ग्रेड कोशिश अनुक्रमण के साथ रात भर नमूने डाइजेस्ट37 में psin (Promega) डिग्री सेल्सियस
    5. सी -18 ZipTip (Millipore) के साथ नमूना पेप्टाइड्स फीका बनाना. अल्फा सीएचसी मैट्रिक्स (टेक्नोलॉजीज, सांता क्लारा, CA) के साथ नमूना पेप्टाइड्स मिक्स, और एक एमटीपी लक्ष्य फ्रेम तृतीय (Bruker Daltonics इंक, Billerica, एमए) पर उन्हें जगह.
    6. एक Bruker Daltonics Ultraflex तृतीय TOF / TOF का उपयोग कर (MALDI-TOF/TOF) मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण की उड़ान मिलकर मैट्रिक्स की मदद से desorption लेजर / आयनीकरण समय प्रदर्शन.
    7. एमएस / एमएस डेटा शुभंकर एल्गोरिथ्म (उपयोग कर NCBI गैर अनावश्यक और स्विस प्रोट डेटाबेस से तुलना www.matrixscience.com ).
  4. Immunoblot विश्लेषण
    1. 4-20% या 8-16% Tris-एचसीएल मानदंड मिल में बना हुआ जैल (जैव रेड) पर एसडीएस पृष्ठ से प्रोटीन के नमूने अलग करें. एक nitrocellulose झिल्ली को electrophoretically बैंड स्थानांतरण.
    2. 5 मिनट के लिए, Tris में झिल्ली धो (जैव रेड टीबीएस) खारा buffered. 0.1% बीच 2 के साथ (TTBS में 5% नोनफेट दूध के साथ टीबीएस ब्लॉक0) कमरे के तापमान पर झटकों से 1 घंटे के लिए.
    3. 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर झटकों के साथ 5% नोनफेट दूध में एक विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग कर immunoblotting के लिए झिल्ली की प्रक्रिया. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 5% नोनफेट दूध में एक माध्यमिक एचआरपी संयुग्मित आईजीजी (एच + एल) एंटीबॉडी द्वारा पीछा किया 20 मिनट के लिए TTBS में धो लें. 30-60 मिनट के लिए TTBS में धो लें.
    4. पश्चिमी सोख्ता Luminol अभिकर्मक (सांताक्रूज जैव प्रौद्योगिकी, Inc, सांताक्रूज, सीए) द्वारा प्रोटीन बैंड का पता लगाने. फोटो फिल्म के लिए फिल्टर का खुलासा. नोट: कुछ प्रयोगों में, एक अलग करना अभिकर्मक एक अलग प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ बाद संकरण के साथ झिल्ली (पियर्स, रॉकफोर्ड, आईएल) पट्टी करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
    5. एडोब फोटोशॉप 5.0.2 में एक्स - रे फिल्मों स्कैन करें. ImageJ सॉफ्टवेयर (राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, बेथेस्डा, एमडी) का उपयोग densitometry विश्लेषण प्रदर्शन.

द्वितीय. कार्यात्मक विश्लेषण में एंटीबॉडी निषेध का प्रयोग करें

II.1. Antibod के सह अभिकर्मकएँ रथ प्रोटीन डिलिवरी अभिकर्मक किट का उपयोग

  1. अभिकर्मक प्रतिक्रिया मिश्रण प्रति, 1X पीबीएस के साथ 100 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए, wtNef-GFP प्लाज्मिड डीएनए की 1 ग्राम और विरोधी mortalin एंटीबॉडी या विरोधी α-ट्यूबिलिन एंटीबॉडी या तो 1 ग्राम पतला. नोट: यह पहले से विरोधी α-ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के सह अभिकर्मक exNef स्राव पर कोई detectable प्रभाव पड़ता है, और इस प्रकार, यह इन प्रयोगों में एक प्रभावी नकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य करता है कि पाया गया था.
  2. बाँझ पानी के साथ 100 μl के अंतिम मात्रा के लिए undiluted रथ अभिकर्मक के 6 μl पतला, पतला और डीएनए एंटीबॉडी के मिश्रण के साथ गठबंधन.
  3. रथ / डीएनए एंटीबॉडी परिसर के गठन की अनुमति देने के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
  4. 5 मिनट के लिए 600 XG पर centrifugation द्वारा गोली 3 एक्स 10 5 Jurkat कोशिकाओं.
  5. 1X पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं, और रथ / डीएनए एंटीबॉडी परिसर में resuspend.
  6. निलंबन के लिए सीरम मुक्त 1640 RPMI मध्यम के 400 μl जोड़ें और सी सेते37 में संस्कृति प्लेटों में Ells ° 2 घंटे के लिए सी.
  7. प्रत्येक थाली से 10% FBS युक्त ताजा RPMI 1640 के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 37 पर 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को सेते डिग्री सेल्सियस

II.2. एंटीबॉडी निषेध की nef-GFP के स्राव फ्लोरोसेंट प्लेट रीडर परख

  1. काटा कोशिकाओं से कोशिका मुक्त वातानुकूलित मीडिया लीजिए, और एक 96 अच्छी तरह से काला microtiter प्लेट की व्यक्तिगत कुओं को 100 μl हस्तांतरण.
  2. उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 485 एनएम और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य रिश्तेदार फ्लोरोसेंट इकाइयों में 515 एनएम के साथ एक Tecan GENEios fluorimeter पर मीडिया में उपाय GFP प्रतिदीप्ति.
  3. नियंत्रण में GFP प्रतिदीप्ति का स्तर (कोशिकाओं से मीडिया Nef-GFP और विरोधी α-ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट) 100% पर सेट करें.
  4. कोशिकाओं से मीडिया Nef-GFP के स्राव में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए विरोधी mortalin एंटीबॉडी के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट में GFP प्रतिदीप्ति के स्तर के लिए इस की तुलना करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

पेप्टाइड्स का उपयोग कर जैविक कार्यात्मक रूपांकनों का मिलान. दो क्षेत्रों apoptosis प्रेरित कि Nef प्रोटीन पर पहचान की गई. पेप्टाइड संचालित apoptosis के N60 (aa40-60) और N70 (aa50-70) पर पहुंचा, और पेप्टाइड N100 (aa80-100) में पृष्ठभूमि के स्तर को ह्रासमान, पेप्टाइड N50 (aa30-50) के साथ (चित्रा 2) के शुरुआत में मनाया गया. aa50-60 पर केंद्रित प्रमुख आकृति 1 (एम 1) शिखर, पूर्ण लंबाई Nef प्रोटीन की apoptotic स्तरों के> 80% लाती है. एक दूसरा, छोटे apoptotic शिखर पेप्टाइड्स N180 (aa160-180) और N190 (aa170-190) फैले मनाया गया. Aa170-180 पर केन्द्रित इस छोटी सी आकृति 2 (M2) के शिखर, पूर्ण लंबाई Nef प्रोटीन 16 के apoptotic स्तर की ~ 30% लाती है.

प्रतियोगी निषेध विश्लेषण पेप्टाइड्स का उपयोग कर. चित्रा 3 में, एक अक्षुण्ण SMR युक्त पेप्टाइड्स काफी exNef स्राव हिचकते. आकृति एन टर्मिनस (Wildty पर स्थित था कि क्या यह सच थापे -1) या पेप्टाइड के बीच (wildtype -2), या पेप्टाइड (wildtype -3) में दोहराया गया था. वैकल्पिक रूप से, चाहे पेप्टाइड में आकृति की स्थिति या संख्या के मूल भाव के किसी भी अमीनो एसिड, के alanine-प्रतिस्थापन, पेप्टाइड का समारोह 18 निराकृत. एक 11 एमिनो एसिड Nef के apoptotic आकृति 1 (SM1) के संस्करण के तले, पहले 14 में वर्णित और सिग्मा Genosys से प्राप्त की, एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था और exNef स्राव पर कोई प्रभाव नहीं पड़ा. पेप्टाइड दृश्यों की एक सूची के लिए 1 टेबल देखें.

चारा के रूप में पेप्टाइड्स का प्रयोग आकृति बंधन पार्टनर्स अलग. चित्रा -4 ए SMRwt पेप्टाइड (60, 65, 75, और 250 केडीए) द्वारा चार प्रोटीन की सह immunoprecipitation दर्शाता है. नकारात्मक नियंत्रण SMRmut पेप्टाइड इन प्रोटीन पर कब्जा नहीं किया था, और ये प्रोटीन गैर विशेष रूप से पेप्टाइड के अभाव में आत्मीयता राल के साथ संपर्क नहीं किया है, सह immunoprecipitated प्रोटीन बातचीत कर रहे थे कि सुझावविशेष रूप से SMRwt पेप्टाइड का SMR रूपांकनों के साथ. ये प्रोटीन बाद में MALDI-TOF अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एक प्रतिनिधि नमूने लिए 4B चित्रा देखें) द्वारा की पहचान की है, और immunoblot विश्लेषण 18 से सत्यापित किया गया.

कार्यात्मक विश्लेषण में एंटीबॉडी निषेध का प्रयोग करें. विरोधी mortalin एंटीबॉडी पूरी तरह से समाप्त कर दिया exNef स्राव (चित्रा 5) के साथ निषेध. यह एक अक्षुण्ण Nef / mortalin बातचीत exNef स्राव के लिए आवश्यक है कि पुष्टि की. इसके अलावा, यह दृढ़ता से SMRwt पेप्टाइड exNef स्राव को रोकता व्यवस्था है जिसके द्वारा mortalin 18 के लिए सीधी प्रतिस्पर्धा ने इस बातचीत के विघटन के माध्यम से पता चलता है कि.

तालिका 1
तालिका 1. SMR पेप्टाइड्स के पैनल Nef प्रेरित exNef स्राव पर उनके प्रभाव के लिए विकसित किया है और परीक्षण किया गया. यह टैबले मूल शेल्टन एट अल., JVI, 2012 18 में प्रकाशित हुआ था. पिछले अध्ययनों में, SMR आकृति के एकल एमिनो एसिड की alanine बदलने में काफी कम है, या, NEF प्रेरित स्राव 18 को समाप्त कर दिया. एक लंबे समय तक nonprogressor से अलग वायरस एक V66 के स्थान पर एक isoleucine साथ Nef के संस्करण व्यक्त;. उच्च संरक्षित SMR आकृति 20 में कुछ सूचना दी रूपों में से एक बड़ा टेबल देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रमुख प्रतिरक्षा प्रकार की कोशिकाओं पर Nef exosomes के प्रभाव. इस मॉडल संक्रमित कोशिकाओं से जारी exNef प्रदर्शित करता है, और यह एड्स के लिए नेतृत्व करेंगे कि monocytic कोशिकाओं और लिम्फोसाईटिक कोशिकाओं पर प्रभाव की भविष्यवाणी की हैरोगजनन. AICD, सक्रियण प्रेरित कोशिका मृत्यु. मैं संक्रमित कोशिका विज्ञप्ति वायरस, सामान्य exosomes, और exNef. exNef unactivated, असंक्रमित monocytes (बी) को सक्रिय करता है. monocytes के सक्रियण भड़काऊ राज्य और सीडी 4 की सक्रियता और थकावट के परिणाम में वृद्धि करने के लिए अग्रणी जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन में (सी) परिणाम + और ​​सीडी 8 + टी कोशिकाओं. द्वितीय. संक्रमित कोशिका विज्ञप्ति वायरस, सामान्य exosomes, और exNef. exNef unactivated, असंक्रमित लिम्फोसाइटों (डी) सक्रिय. सक्रिय लिम्फोसाइटों (ई) के परिणाम में एक apoptotic सेल (एफ) में जिसके परिणामस्वरूप AICD कि जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन से गुजरना. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. Peptidई apoptotic आकृति (ओं) के लिए एचआईवी -1 Nef प्रोटीन का विश्लेषण स्कैनिंग. KNFS Nef प्रोटीन की 205 अमीनो एसिड फैले 20mer पेप्टाइड्स, 10 एमिनो एसिड ओवरलैप के साथ प्रत्येक का एक सेट एड्स अभिकर्मक कार्यक्रम से प्राप्त की है और इस्तेमाल किया गया था Nef apoptotic डोमेन मानचित्रण में. यह आंकड़ा मूल हुआंग एट अल में प्रकाशित किया गया था., JVI, 2004 13. शाफ़्ट TUNEL के चिह्नित कर रहे हैं कि कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाता है, और एक्स अक्ष उपचार हालत को दर्शाता है. पूर्ण Nef प्रोटीन [Nef], अनुपचारित कोशिकाओं [यूटी], या AA1-20 [N20] के साथ शुरू, और aa190-205 के साथ समाप्त पेप्टाइड [N205]. त्रुटि सलाखों माप की मानक त्रुटि निरूपित, और परिणाम कम से कम 3 स्वतंत्र प्रयोगों का एक संकलन है. apoptosis की चोटियों आकृति 1 और आकृति 2 से चिह्नित हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3. SMRwt पेप्टाइड exNef रोकता. युक्त पेप्टाइड्सइस क्षेत्र के किसी भी Animo एसिड की alanine बदलने की बहुत पेप्टाइड के प्रभाव को कम कर दिया है, जबकि एक या एक से अधिक wildtype Nef SMR अनुक्रम बेरी, exNef का स्राव हिचकते. यह आंकड़ा मूल शेल्टन एट अल., JVI, 2012 15 में प्रकाशित हुआ था. Jurkat टी कोशिकाओं, एक Nef-GFP क्लोन और विभिन्न SMR पेप्टाइड्स के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट, से संस्कृति मीडिया exNef स्राव के लिए assayed थे. मापा GFP प्रतिदीप्ति की राशि बाह्य मीडिया में exNef-GFP की राशि के बराबर है. सांख्यिकीय महत्व टी परीक्षण एक unpaired का उपयोग कर निर्धारित किया गया था. विभिन्न पेप्टाइड्स के exNef स्राव पर प्रभाव की तुलना में किया गया था एक बेतरतीब ढंग से पेप्टाइड नियंत्रण तले (SM1, * पी मूल्य 0.05 <; ** पी मूल्य 0.01 <; *** पी मूल्य <0.001).

चित्रा 4
4 चित्रा. SMRwt पेप्टाइड मोर सहित मेजबान सेल प्रोटीन के साथ विशेष रूप से सूचना का आदान प्रदान Talin. (ए) Jurkat टी कोशिकाओं से प्रोटीन विरोधी झंडा M2 के एंटीबॉडी मिलकर आत्मीयता राल का उपयोग कर SMRwt या SMRmut पेप्टाइड्स के साथ या तो सह immunoprecipitated गया. यहां इस्तेमाल SMRwt और SMRmut दोनों पेप्टाइड्स में एम्बेडेड एक झंडा टैग अनुक्रम है कि नोट. यह आंकड़ा मूल शेल्टन एट अल., JVI, 201215 में प्रकाशित किया गया था. यह प्रक्रिया आत्मीयता राल के साथ गैर विशिष्ट बातचीत के लिए एक नियंत्रण के रूप में या तो पेप्टाइड के अभाव में दोहराया गया था. चित्र Coomassie ब्लू दाग जेल आणविक 60 का वजन, 65, 75, और SMRmut पेप्टाइड द्वारा या कोई पेप्टाइड के साथ नीचे खींच लिया नहीं गया कि SMRwt से नीचे खींच लिया 250 केडीए (तीर) के साथ प्रोटीन प्रदर्शित करता है. (बी) 75 केडीए बैंड जेल से निकाल दिया गया था, trypsin से पचता है, और MALDI-TOF अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया. एमएस / एमएस आयन खोज mortalin के रूप में 75 केडीए की पहचान की. तीर मिलान पेप्टाइड्स के दृश्यों को निरूपित.large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5. Mortalin एंटीबॉडी निषेध ब्लॉक exosome स्राव. Jurkat कोशिकाओं से कोशिकी संस्कृति मीडिया, mortalin या α-ट्यूबिलिन या तो के खिलाफ एक Nef-GFP क्लोन और एंटीबॉडी के साथ सह ट्रांसफ़ेक्ट, exNef स्राव के लिए assayed थे. ExNef स्राव (α-ट्यूबिलिन), अपने एंटीबॉडी द्वारा mortalin की गतिविधि का विघटन exNef स्राव के पूर्ण उन्मूलन के परिणामस्वरूप में शामिल नहीं एक प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी के प्रभाव की तुलना में. सांख्यिकीय महत्व द्वारा निर्धारित किया गया था अयुगल α-ट्यूबिलिन एंटीबॉडी (*** पी मूल्य <0.001) बनाम mortalin एंटीबॉडी की उपस्थिति में exNef स्राव की तुलना टी परीक्षण. यह आंकड़ा मूल शेल्टन एट अल., JVI, 2012 18 में प्रकाशित हुआ था.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Exosomal तस्करी मार्ग exNef स्राव के इंजीनियरिंग उपन्यास inhibitors में उपयोगी होगा हेरफेर करने Nef की क्षमता अंतर्निहित तंत्र को समझना. ExNef स्राव का निषेध सीडी 4 टी सेल रिक्तीकरण और सीआईए ड्राइव कि एचआईवी / एड्स के रोगजनन कम हो जाना चाहिए. इस लक्ष्य की दिशा में, हम हमारे exNef स्राव की आनुवंशिकी का विश्लेषण, और इसमें शामिल सेलुलर प्रोटीन का निर्धारण करने के लिए शुरू करने की अनुमति दी है कि उपन्यास अभिकर्मकों और तरीकों की एक संख्या विकसित की है. यह दृष्टिकोण भी सीधे exNef स्राव, SMRwt पेप्टाइड लक्षित करने के लिए पहली बार अवरोध के विकास के लिए नेतृत्व किया.

हमारे काम का एक महत्वपूर्ण खोज हमारे मामले में पूर्ण लंबाई प्रोटीन में पाए रूपांकनों से निकाली गई है कि विशिष्ट कम पेप्टाइड्स, एचआईवी -1 NEF, उनके जैविक समारोह बनाए रखने के लिए ही नहीं है, लेकिन यह भी प्रतिस्पर्धात्मक रूप से पूर्ण लंबाई प्रोटीन के कार्य को बाधित कर सकते हैं. इन पेप्टाइड्स उनके जैविक समारोह बनाए रखने के लिए, क्योंकि वे कार्यात्मक डोमेन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैपूर्ण लंबाई प्रोटीन में. दो बातें आवश्यक हैं: ब्याज की प्रोटीन, अपनी पूरी लंबाई या तो या प्रोटीन के एक क्षेत्र को स्कैन कि पेप्टाइड्स की पीढ़ी कार्यात्मक डोमेन शामिल करने के लिए सोचा था, और प्रश्न में जैविक समारोह के परीक्षण के लिए एक परख. हम हमें Nef के विशिष्ट क्षेत्रों के लिए एक apoptosis उत्प्रेरण रूपांकनों के लिए हमारी खोज को संकीर्ण अनुमति होगी कि जानकारी का अभाव है के बाद से, हम अपनी पूरी लंबाई स्कैनिंग पेप्टाइड्स के एक सेट का इस्तेमाल किया. इस प्रक्रिया Nef के अपेक्षाकृत छोटे आकार के द्वारा सरल बना दिया था, हम भी बड़ा (> 75 केडीए) प्रोटीन के लिए इस दृष्टिकोण को लागू किया है. मापने apoptosis (TUNEL के) के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित की परख इस मामले, सीडी 4 टी कोशिकाओं की Nef प्रेरित apoptosis में, ब्याज की जैविक समारोह को बनाए रखना है पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए नियोजित किया गया था. दिलचस्प है, मूल कागज में बाद के विश्लेषण पहचान apoptotic पेप्टाइड्स पूर्ण लंबाई Nef प्रोटीन की जैविक गतिविधि के> 80% बनाए रखा है कि पता चला है, और competitively CXCR4 के बंधन हिचकतेअपनी प्राकृतिक ligand की एसडीएफ 1α.

इसी प्रकार, NEF की SMR आकृति युक्त एक छोटी पेप्टाइड exNef स्राव में शामिल सेलुलर प्रोटीन के साथ बातचीत करने के लिए अपने जैविक क्षमता को बनाए रखा. हालांकि, गतिविधि के इस उदाहरण के प्रतिधारण के रूप में apoptosis को शामिल करने के साथ मामला था, लेकिन निषेध करने के बजाय नेतृत्व में, एक Nef समारोह का अनुकरण करने के लिए नेतृत्व नहीं किया था. SMRwt पेप्टाइड प्रभावी ढंग से इन सेलुलर प्रोटीन की SMR बाध्यकारी साइटों बाध्य है, क्योंकि यह Nef के साथ उनकी बातचीत बाधित, और फलस्वरूप, exosomes में Nef के स्राव को रोका. ब्याज की Nef मूल भाव पिछले आनुवंशिक मानचित्रण अध्ययन से जाना जाता था, के रूप में, हम SMR की विविधताओं को पेप्टाइड विकास को सीमित करने में सक्षम थे. इसके बजाय उपन्यास कार्यात्मक रूपांकनों की पहचान की है, हम exNef स्राव में SMR की भूमिका में अपनी विशिष्ट प्राथमिक अनुक्रम को सीधे जुड़ा हुआ था कि प्रदर्शन करने के लिए, exNef स्राव को मापने के लिए इन पेप्टाइड्स, और एक पहले से विकसित प्रतिदीप्ति आधारित परख इस्तेमाल किया.

एचआईवी -1, मानव प्रोटीन सहभागिता डाटाबेस Nef के साथ सीधे बातचीत और संभवतः के रूप में कई के रूप में 200 प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से 19 कि बातचीत में 60 से अधिक सेलुलर प्रोटीन सूचीबद्ध करता है. ब्याज के मूल भाव को हमारे चारा प्रोटीन के अनुक्रम सीमित करके, हम पूर्ण लंबाई Nef प्रोटीन द्वारा सह immunoprecipitated गया होता है कि प्रोटीन के दर्जनों के माध्यम से हल करने के लिए होने से बचा. इन प्रोटीनों के बहुमत, NEF के लिए विशिष्ट जबकि, NEF के SMR के लिए बाध्यकारी भागीदारों नहीं होगा, और इस प्रकार पृष्ठभूमि / शोर का गठन होगा. एक रूढ़िवादी गणना हम 15x (60/4) द्वारा शोर को कम करता है. संक्षेप में, हमारे दृष्टिकोण को प्रभावी ढंग से परोक्ष की वजह पृष्ठभूमि से कम से कम संकेत करने वाली शोर अनुपात में वृद्धि हुई है, या हमारे मामले में बंद आकृति बंधन, हमारे लिए आईडीई की अनुमतिविशेष रूप से SMR कि बाँध प्रोटीन ntify. हालांकि, यह इस पद्धति का उपयोग करके, हम या विशेष रूप से सभी SMR बाध्यकारी सेलुलर प्रोटीन SMR, और Nef बाध्य करने के लिए एक दूसरे के मूल भाव दोनों के साथ बातचीत की आवश्यकता है कि उन लोगों को, या जिसका बाध्यकारी माध्यमिक पर निर्भर है उन पर कब्जा करने में विफल रहा है, संभव है कि तृतीयक संरचना.

Mortalin, एक सेलुलर प्रोटीन SMRwt पेप्टाइड द्वारा सह immunoprecipitated, miRNA मारकर गिरा दिया और एंटीबॉडी निषेध द्वारा exNef स्राव के लिए आवश्यक होना दिखाया गया था. पूर्व लक्षित प्रोटीन की अभिव्यक्ति को कम कर देता है या समाप्त कि एक अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है. इसके विपरीत, एंटीबॉडी निषेध प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर को प्रभावित नहीं करता, लेकिन बजाय शारीरिक रूप से अन्य प्रोटीन के साथ लक्षित प्रोटीन की बातचीत को रोकता है. हम exNef स्राव के लिए Nef-mortalin बातचीत के महत्व को प्रदर्शित करने के लिए यह दूसरी विधि का इस्तेमाल किया. एंटीबॉडी निषेध एंटीबॉडी शुरू करने के लिए एक विधि की आवश्यकता है कि एक सीधे आगे की प्रक्रिया हैसवाल में जैविक समारोह पर इसके प्रभाव का परीक्षण करने के लिए सेल और एक परख में. हम सेल, और exNef स्राव में परिवर्तन को मापने के लिए ऊपर उल्लिखित प्रतिदीप्ति आधारित परख में शटल विरोधी mortalin एंटीबॉडी के लिए रथ प्रोटीन डिलिवरी अभिकर्मक इस्तेमाल किया. सबसे एंटीबॉडी आधारित प्रक्रियाओं की तरह, एंटीबॉडी निषेध के प्रभाव को लक्षित प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी की आत्मीयता और विशिष्टता के द्वारा सीमित है.

एचआईवी अनुसंधान का एक प्रमुख लक्ष्य उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के विकास और उपचार के लिए संभावित ठिकानों की पहचान है. प्रक्रियाओं यहां उनके जैविक समारोह को बनाए रखने और competitively पूर्ण लंबाई प्रोटीन के कार्य को बाधित कर सकते हैं, इस प्रक्रिया को तेज करने के लिए जो लाभ उठाने के विशिष्ट कम पेप्टाइड्स, का वर्णन किया. वर्णित प्रयोगों के एक प्रमुख एचआईवी समारोह को समझने में निर्देशित कर रहे थे, नियोजित तकनीक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन और पेप्टाइड आधारित के विकास के लिए लागू किया जाना चाहिएकई क्षेत्रों में अवरोधकों.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम एनआईएच / NIGMS / MBRS (अनुदान 58268), एनआईएच / NCRR / RCMI (अनुदान G12-RR03034), जॉर्जिया रिसर्च एलायंस के वित्त पोषण अनुदान GRA.VAC08.W, एनआईएच / NIAID / एनआरएसए अनुदान F31AI091484, एमोरी CFAR अनुदान P30 द्वारा समर्थित किया गया A1050409. इस जांच एनआईएच / NCRR से अनुसंधान सुविधाएं सुधार अनुदान # C06 RR18386 से समर्थन के साथ निर्माण एक सुविधा में आयोजित किया गया. Jurkat कोशिकाओं, 20 के सेट एचआईवी -1 Nef पेप्टाइड्स, साथ ही खरगोश विरोधी एचआईवी -1 Nef सीरमरोधी एनआईएच एड्स अनुसंधान और संदर्भ अभिकर्मक कार्यक्रम, (रॉकविल, एमडी) से प्राप्त किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20mer peptide set with 10 amino acid overlap NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 4641
TUNEL Assay Roche 11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent Active Motif 30100
Tecan GENEios fluorimeter (Tecan Group, Switzerland)
96-well black microtiter plate Corning 3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
Dynabeads Protein G magnetic beads Invitrogen 100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) Promega Corp., Madison, WI Z5332
C-18 ZipTip Millipore ZTC18S096 C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution
MALDI TOF/TOF Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen? Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
  2. Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
  3. Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).
  4. Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).
  5. Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).
  6. Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).
  7. Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).
  8. Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).
  9. Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).
  10. Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).
  11. Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
  12. Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).
  13. Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).
  14. Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).
  15. James, C. O., Huang, M. -B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).
  16. Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).
  17. Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).
  18. Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).
  19. Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).
  20. Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).

Tags

विषाणु विज्ञान अंक 76 जैव रसायन इम्यूनोलॉजी संक्रमण संक्रामक रोगों आण्विक जीव विज्ञान चिकित्सा जेनेटिक्स माइक्रोबायोलॉजी जीनोमिक्स प्रोटीन exosomes एचआईवी पेप्टाइड्स एक्सोसाइटोसिस प्रोटीन की तस्करी स्राव एचआईवी -1 NEF स्राव संशोधन क्षेत्र SMR पेप्टाइड एड्स परख
कार्यात्मक रूपांकनों और उनके बंधन पार्टनर्स के पेप्टाइड आधारित पहचान
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali,… More

Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S., Johnson, K., Roth, W., Powell, M., Bond, V. Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners. J. Vis. Exp. (76), e50362, doi:10.3791/50362 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter