Summary
exosomes에있는 HIV-1 Nef의의 분비를 기본 메커니즘을 해부하는 방법이 설명되어 있습니다. 네프 단백질 형질 전환에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 구조, 기능 및 네프의 분비 수정 지역의 바인딩 파트너를 결정하는 데 악용되었다. 이러한 절차는 많은 역학적 연구에서 일반적으로 관련이 있습니다.
Abstract
우리의 경우 HIV-1 Nef의에, 전체 길이 단백질에서 발견 모티브에서 파생 된 특정 짧은 펩티드는 생물학적 기능을 유지뿐만 아니라, 경쟁의 전체 길이 단백질의 기능을 억제 할 수 있습니다뿐만 아니라. 20 네프 스캔 펩티드, 각 이웃의 10 아미노산 겹치는 길이 20 아미노산의 세트는 세포 사멸의 유도에 대한 책임 네프에서 모티브를 식별하는 데 사용되었다. 이러한 세포 사멸 주제를 포함하는 펩티드는 전체 길이 네프 단백질에 비해 수준에서 세포 사멸을 유도. 네프의 분비 수정 지역 (SMR)에서 파생 된 두 번째 펩티드, exosomes에있는 네프의 분비 (exNef)에 관련된 세포 단백질과 상호 작용하는 능력을 유지했다. 이 SMRwt 펩타이드는 네프의 SMR 주제에 구체적으로 바인딩 세포 단백질을 분리하기 위해 공동 immunoprecipitation의 실험에서 "미끼"단백질로 사용되었다. 단백질 형질 항체 억제는 물리적 상호 작용 내기를 중단하는 데 사용되었다싸우는 네프 및 mortalin, 고립 된 SMR-결합 단백질의 하나이며, 효과는 형광 기반의 exNef 분비 분석으로 측정 하였다. SMR 모티브를 결합 세포 단백질에 대한 전체 길이 네프을 outcompete하는 SMRwt 펩타이드의 능력은, 그것 exNef 분비의 첫 억제합니다. 따라서, 전체 길이 단백질에서 발견 모티브에서 파생 된 특정 짧은 펩티드의 고유 한 특성을 활용하여 여기에 설명 된 기술을 채용하여, 하나는 단백질의 기능 모티프의 식별 및 병원성 기능의 펩타이드 기반 억제제의 개발을 가속화 할 수 있습니다.
Introduction
항 레트로 바이러스 치료의 도래와 함께, 서구 세계에서 에이즈 전염병이 둔화하지만, 축소하지 않으며, HIV의 확산은 전 세계에 걸쳐 중요한 건강 부담을 계속하고있다. 변두리에 효과적인 RV144 태국 재판을 제외하고, HIV 백신은 지금까지 감염으로부터 보호하기 위해 실패를 보여 주었다. 따라서, 추가, 잠재적 인 치료 표적에 대한 연구는 여전히 보증합니다.
CD4 T 세포 고갈과 함께, 지속적인 일반화 된 면역 활성화는 HIV 감염의 특징이다. 이 만성 면역 활성화 (CIA)은 세포의 매출 활성화와 차별화 된 림프 모집단, 휴대 피로와 노화, 및 활성화 유도 세포 죽음 (AICD) 1,2,3을 통해 T 세포와 B 세포의 살해의 증가로 연결하고, 그것은 잘 질병의 진행 4,5,6,7,8,9,10,11,12의 가장 강력한 예측 인자 중 하나로 설정됩니다. 그러나 메커니즘은 CIA와 CD4의 기초HIV 감염의 고갈 T-세포가 완전히 밝혀 할 수 남아 있습니다.
우리 실험실과 다른 사람의 증거는 HIV 단백질 네프는 (네거티브 규제 요인) HIV-1에 감염된 세포 13,14에서 exosomes에있는 그것의 분비를 유도 상기 질병의 진행을위한 모델 (그림 1)로 우리를 이끌었다. 이러한 네프 함유 exosomes (exNef)는 감염되지 않은 CD4 T 세포 15,16 등의 세포 계통의 여러 세포 사멸을 유도. 또한, 단핵구에서 / 대 식세포 exNef 바꾼다 유전자 발현 패턴, 예를 들면 사이토 카인의 발현, 그리고 예약되지 않은 면역 활성화의 상태를 유도하기 위해 나타납니다. 증거의이 몸은 CIA와 CD4 T 세포 고갈 exNef에 중요한 역할을 제안합니다.
exosomal 인신 매매 통로 exNef 분비 엔지니어링 소설 억제제에 도움이 될 것입니다 조작은 NEF의 능력을 기본 메커니즘을 이해. exNef 분비의 억제는 CD4 T 세포 고갈을 감소한다그리고 CIA 드라이브 HIV / AIDS 발병합니다.
HIV / AIDS 질병의 진행이 모델에 내장 된 다음 데이터에 대한 우리의 모델을 주도 증거를 수집하기 위해, 우리는 우리가 exNef 분비의 유전자를 분석 할 수 소설 시약 및 방법론의 숫자를 개발하고,을 결정하기 시작 세포 단백질이있었습니다. 초기 연구에서, 우리는 네프 단백질 방관자 세포의 apoptosis를 유도하고 네프 형질 전환 및 HIV에 감염된 세포에서 extracellularly 15 릴리스되고있는 것으로 나타났습니다. SDF-1α (대안 접합 알파 계수-1 유래 기질 세포)에서 유래 펩타이드는 이전에 많은 전장 분자 (17)의 결합 및 신호 활동을 유지하기 위해 표시했다. 우리는 네프의 펩티드는 전체 단백질의 세포 사멸 활동의 일부, 이러한 펩티드 반드시 네프 세포 사멸 도메인 (들)을 포함하는 것을 유지할 수 있다는 추측. 이러한 펩티드를 확인하고 그 결과 네프하려면세포 사멸 도메인 (들), 우리는 NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램에서 20 HIV-1 Nef의 스캔 펩티드의 집합을 얻었다. 이 20-AA 펩티드는 이웃의 10 아미노산 중복 각각은, 그들의 마지막 아미노산 즉, N20 걸쳐 네프 아미노산 1-20 N30 걸쳐 네프 아미노산 11-30, 등 16의 숫자로 지정됩니다. 우리는이 세포의 전체 길이 네프 단백질 유도 세포 사멸의 두 가지 10-AA 도메인을 중복 특정 펩티드 extracellularly T-세포를 노출 것을 발견했다. 이러한 네프 파생 된 세포 사멸 펩티드의 후속 분석은 실제로 이러한 펩티드 경쟁력 CXCR4와 자연의 리간드 SDF-1α 사이의 바인딩을 억제 할 수 바인딩 속도론과 T 세포의 표면에 케모카인 수용체 CXCR4와 상호 작용하는 능력을 공개했다. 마지막으로, CXCR4와 네프에서 파생 된 세포 사멸 펩티드 '상호 작용은 세포 사멸에 이르는이 T-세포의 스트레스 반응을 유발하는 것으로되었다. 이 증거는 우리에게 QUIC 허용광년지도 네프의 기능 영역, 예 알라닌 스캔 돌연변이와 같은 표준 DNA 돌연변이 기술을 사용하여 더 이상 걸렸을 것입니다 프로세스입니다. 또한 이러한 짧은 네프 파생 펩티드는 전체 길이 단백질 세포 사멸 도메인의 생물학적 기능을 유지 것을 보여 주었다.
세포 네프의 역할을 확인하는 데, T-세포 즉, 세포 사멸, 우리는 네프는 세포에서 분비 된 방법의 더 나은 이해를 모색하고 있습니다. 변이 네프 구문의 시리즈를 사용하여, 우리는 HIV 네프 모두의 N-말단 지역에서 매우 보존 네프 단백질 모티프를 매핑하고, exNef 분비 13 중요한 그 붉은 털 원숭이 해당 SIV 맥 (유인원 면역 결핍 바이러스) 네프. 이러한 주제 중 하나 분비 수정 지역 (SMR, 66VGFPV70)는 자사의 다섯 가지 아미노산의 하나 크게 exNef 분비를 감소 또는 폐지의 알라닌 교체로, 특히 중요했습니다. 활동 주제의 C를 통해 세포에 전달 될 때hariot 단백질 배달 시약, FLAG 펩타이드 시퀀스 (SMRwt)에 부착 된 SMR을 포함하는 펩타이드는 18 세포 네프 - 형질 전환 및 HIV에 감염된 모두에서 exNef 분비를 억제하는 것으로되었다. 펩티드와 우리의 이전 경험을 바탕으로, 우리는 분자와 exNef 분비 네프 SMR의 역할을 기본 메커니즘을 해명이 펩티드를 사용하기로 결정했다.
우리의 "미끼 단백질"로 SMRwt 펩티드를 사용하여, 우리는 감염되지 않은 T 세포 용 해물 (18)로부터 SMR의 휴대 전화 바인딩 파트너를 공동 immunoprecipitated. FLAG 펩타이드 시퀀스는 안티-FLAG 친 화성 수지를 사용하여 SMRwt 펩타이드를 캡처하는 편리한 손잡이를 제공했다. SMRwt 펩타이드의 돌연변이 알라닌하는 단일 발린이 exNef 분비의 억제를 폐지하기에 충분했다 우리의 이전 연구 결과는 우리가 SMR에 대한 특정하지 공동 immunoprecipitated 단백질을 배제하는 데 편리하고, 매우 구체적인 제어 펩타이드 (SMRmut)를 확인했다. s의 펩티드를 사용하여오히려 전체 길이 단백질보다 관심 pecific 도메인은 우리가 네프 19 다른 도메인에 바인딩 세포의 여러 요소의 검사를 우회 할 수있었습니다.
일단 우리는 논리적 인 다음 단계는 확인 된 휴대 전화 바인딩 파트너 생물학적 기능 18 중요하다는 것을 보여주고 있었고, SMR 결합 파트너를 확인했다. 이 작업을 수행하는 표준 절차는 생물학적 기능을 표적 단백질의 특정 miRNA의 또는 siRNA를하고, 이후 분석 결과를 사용하여 최저 단백질 수준이다. 우리는이 경우 SMR-결합 단백질에 대상의 생산을 감소 목표의 mRNA의 번역을 억제 miRNA의 넉다운을 수행. 대상 단백질이 감소 간접 효과, 그리고 아마도 타겟 단백질이 결과적 인치 역할을하는 생물학적 기능에 대한 지연 효과를 가지고, 우리는 직접의 활동을 방해하는지 확인하기 위해 덜 일반적인 항체 억제 기술을 채택대상 단백질은 생물학적 기능을 줄이거 나 제거합니다. 이 절차에서는 항체 표적 단백질에 대해 제기는 전차 시약을 사용하여 세포로 형질 전환하고, 목적 단백질도 기능을 자사의 사이트에서 봉쇄를, 또는 관련 바인딩 도메인을 차단과 직접 상호 작용합니다. 이 절차를 통해 대상 단백질의 억제가 직접 그 기능을 방해하고, 또한 생물학적 기능에 목적 단백질의 중요성을 확인하여 RNA의 최저 절차를 보완 할 수 있습니다.
전차 시약은 세포로 펩티드와 단백질을 제공하는데 효과적이지만,이 과정은 시간이 많이 소요하고, 실험의 종류를 제한하는 등 장기간 또는 반복 노출과 생체 내 동물 연구에서 수행 할 수 있습니다. 따라서, 우리는 수동적으로 세포에 의해 수행 될 수있는 펩타이드를 생성하는 SMRwt 펩타이드 (SMRwt-CPP) 18 세포 관통 펩티드 (CPP) 시퀀스를 추가문화 미디어. 이 버전은 억제 exNef 분비에 이전만큼 효과적이었다.
이러한 게시 된 실험 증거는 경쟁 억제를 통해 전체 길이 단백질의 기능을 적대하고, 이러한 주제를 바인딩 단백질을 분리하기 위해 특정 기능을 모티프 포함하는 작은 펩티드의 능력을 보여줍니다. 하나는 이러한 기술은 많은 실험 프로토콜에 도움이 될 것을 기대합니다. 그들은 또한 많은 세포 과정의 엔지니어링 소설 펩티드 억제에 효과가한다 CPP 시퀀스 결합하여 성능을 더욱 향상시킬 수 있습니다 기능.
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Protocol
I.는 생물학적 분석에 짧은 펩티드의 사용
I.1. 펩티드를 사용하여 매핑 생물학적 기능 모티프
- 네프 스캔 펩티드와 세포 치료
- 관심 영역을 스캔 펩티드의 집합을 조달. 우리의 실험, 20mer 펩티드, 10 아미노산 중복와 함께, 전체 HIV-1 Nef의 단백질 (205 AA) 스패닝의 경우, 에이즈 시약 프로그램에서 하였다. 다음과 같은 펩티드는 개별적으로 assayed 있습니다 :
- 10 NG / 세포 배양 매체 펩타이드의 ML을 추가합니다.
- 세포 배양을 인 Jurkat가 접시 당 문화 매체의 10 ML을 추가합니다.
- 37 24 시간 동안 문화를 품어 ° C.
- 세포 사멸의 터미널 deoxynucleotidyltransferase - 중재 dUTP 비오틴 닉 엔드 라벨 (TUNEL) 분석
- 1X PBS로 세포를 씻어 1X PBS, pH를 7.4에서 4 % 파라 포름 알데히드로 실온에서 30 분간 고정한다.
- 10 1X PBS로 세척하고, 0.1 %로 permeabilize 트리톤 X-100실온에서 분.
- 1X PBS로 두 번 세포를 씻어.
- 컴퓨터 제어 현미경 시스템에 epifluorescence에 의해 스테인드 세포를 계산합니다.
I.2. 펩티드를 사용하여 경쟁 억제 분석
- 전차 단백질 배달 시약 키트를 사용하여 펩티드의 공동 형질 전환
- 형질 반응 혼합물 당 100 μL의 최종 볼륨, wtNef-GFP 플라스미드 DNA 1 μg과 야생형 SMR 도메인에서 파생 된 펩티드, 또는 SMR 모티프의 개별 아미노산 알라닌 - 교환을 포함하는 펩티드도 100 NG를 희석 1X PBS.
- 멸균 물 100 μL의 최종 볼륨에 전차 시약의 1 / 10 희석 6 μl를 희석하고 희석 DNA-펩타이드 혼합 결합합니다.
- 전차 / DNA-펩타이드 복합체의 형성을 할 수 있도록 30 분 동안 실온에서 알을 품다.
- 5 분 600 XG에서 원심 분리하여 펠렛 3 × 10 5 된 Jurkat 세포.
- 1X PBS로 두 번 세포를 씻으, 그리고 전차 / DNA-펩타이드 복합체에 resuspend을.
- 서스펜션에 혈청 RPMI 1640 배지 400 μl를 추가하고 2 시간 동안 37 ° C에서 배양 접시에 세포를 품어.
- 각 플레이트에 10 % FBS를 포함하는 신선한 RPMI 1640 배지 1 ㎖를 추가하고, 37에서 48 시간 동안 세포를 품어 ° C.
- 수확 세포와 형광 현미경으로 형질 전환 효율을 결정합니다.
- 펩티드 억제 NEF-GFP 분비 형광 플레이트 리더 분석
- 수확 된 세포에서 세포 무료 에어컨 미디어를 수집하고, 96 - 웰 블랙의 microtiter 플레이트의 각 웰에 100 μl를 전송합니다.
- 여기 파장 485 nm의 발광 파장 상대 형광 단위 515 m로 TECAN GENEios의 fluorimeter의 미디어 측정 GFP 형광.
- 컨트롤의 GFP 형광의 레벨 (세포 미디어 네프-GFP와 공동 형질과 펩타이드를 스크램블 설정) 100 %.
- 세포 미디어 네프-GFP 분비의 변화를 결정하기 위해 다양한 SMR 펩타이드와 공동 형질에서 GFP 형광의 수준이 비교할 수 있습니다.
I.3. 미끼로 펩티드를 사용하여 주제 바인딩 파트너를 분리
- SMR 펩타이드와 공동 immunoprecipitation의
- 37 10 % FBS가 포함 된 RPMI 1640 배지로 된 Jurkat 세포를 성장 T-75 조직 배양 플라스크에 ° C, 4시 20 분 1,000 XG에서 원심 분리하여 펠렛 세포 ° C. 형질 전환 효율을 결정, 형광 현미경으로 접시를 배치하여 이미지를 캡처하고, 이후 전체 및 라벨 세포를 세어 백분율 표시 셀을 결정합니다.
- 1 ML 1X PBS로 세포 펠렛을 resuspend을, 그리고 1.5 ML 에펜 도르프 튜브로 전송할 수 있습니다. 1 분 1,000 XG에서의 microcentrifuge. 부드러운 피펫 1 ML α-FLAG 용해 버퍼에 펠렛을 resuspend을. 용해 버퍼 : 혼합 50 MM 트리스 • 염산 산도 7.4, 150 MM의 나트륨 CHLoride [염화나트륨] 1 밀리미터 phenylmethylsulfonyl 불화 포유 동물 세포와 조직 추출물 사용 [PMSF], 10 ML / μL 프로테아제 억제제 칵테일 1 ㎜ EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 % 트리톤 X-100 [PIC, 시그마]. 사용하기 전에 즉시 확인합니다.
- 차동 5 분 2,000 XG에서의 microcentrifuge 현탁액을 펠렛 ~ 10 분 세포 파편과 DNA, 각각 13,000 XG에서. 상층 액 (이하 "해물"라한다)를 수집.
- 해물 단백질의 1 밀리그램 SMRwt 또는 SMRmut 펩타이드 안티-FLAG M2 선호도 젤 (; 시그마 이하 "수지"라고도 함)의 20 μL에 하나의 1 μg을 추가합니다. 여기에 사용 SMRwt 및 SMRmut 모두 펩티드에 포함 된 FLAG 태그 서열을 갖고 있음에주의해야한다. 공동 IP 버퍼 1 ML (α-FLAG 용해 버퍼를 뺀 PMSF 및 PIC)의 최종 볼륨 혼합물을 가져옵니다. 엔드 오버 엔드 회전 ° C 하룻밤에 혼합물을 품어. 음성 대조군으로, 두 펩티드의 부재 수지 해물을 배양한다.
- 펠레T 5,000 microcentrifugation에 의해 수지 - 30 초 8,000 XG. 수지 샘플을 처리하기 전에 2 분 동안 정착 한 후 상층 액을 대기음 할 수 있습니다. 어떤 수지를 전송하지 않도록주의하면서, 좁은 엔드 피펫 팁 또는 해밀턴 주사기 상층 액을 제거합니다. 좁은 엔드 피펫 팁이 부분적으로 닫힐 때까지 플라스틱 피펫 팁의 오프닝을 공략하기 위해 집게를 사용하여 만들 수 있습니다. 500 세척 버퍼의 μL (50 MM 트리스 • 염산 산도 7.4, 150 MM의 염화나트륨).와 수지를 네 번 씻으십시오 세척 버퍼 50 μL의 배 FLAG 펩타이드의 15 μg (시그마)에 바인딩 된 세포 단백질을 용출하고 실온에서 30 분 동안 로커 / 셰이커에 품어.
- Laemmli에 샘플 버퍼 (바이오 래드)에서 비등 다음에 아세톤 침전에 의해 용출액을 집중한다. 4-20% 트리스 - 염산 기준 프리 캐스트 젤 (바이오 래드)을 SDS-PAGE로 단백질을 분리합니다. 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 (바이오 래드)와 젤 얼룩. 참고 : 질량 분광법 식별 실험 (
- 네프-GFP 단백질과 공동 immunoprecipitation의
- 0.02 % 트윈 20 (PBS-T)와 1X PBS 1 ML에 방지 GFP 생쥐 단일 클론 2 μg에 Dynabeads 단백질 G 자석 구슬 (Invitrogen 사)의 50 μl를 섞는다. 4시에 1 시간 동안 1.5 ML Eppendorf의 튜브 엔드 오버 엔드 회전 혼합물을 품어 ° C.
- 자기 풀다운 메뉴가 뜨는을 제거 한 다음 허용하는 1.5 ML MagnaSphere 기술 마그네틱 분리 스탠드 (Promega 사 공사, 매디슨, WI)에 튜브를 삽입하여 버퍼에서 구슬을 분리합니다. 부드러운 피펫을 사용하여 PBS-T의 1 ml의 안티 GFP 코팅 구슬을 씻으십시오.
- M은 15 1X의 RIPA 1 ㎖ + 버퍼 부드러운 피펫 및 배양하여 함께 네프-GFP 형질 전환 된 Jurkat 세포를 용해얼음에있다. RIPA + 버퍼 : 10X RIPA 용해 버퍼, 산도 7.4 [밀리 포아, 베드포드, 매사추세츠】 멸균 물에 희석 1:10 0.02 % 나트륨 아 지드 [시그마] 0.1 % 나트륨 도데 실 황산 [SDS] 1 ㎜ PMSF 10 μL와 / ㎖ PIC는 사용 직전에 추가됩니다.
- 펠렛 10 분 2,000 XG에서 microcentrifugation하여 세포 파편. 상층 액 (이하 "해물"라한다)를 수집.
- 안티 GFP 코팅 비즈 해물 단백질 1 mg의 추가 1X RIPA + 버퍼 1 ML에 최종 볼륨을 가지고, 4 ℃에서 1 시간 동안 엔드 오버 엔드 회전 혼합물을 품어 참고 : 펩타이드 경쟁 연구를 위해, 해물 단백질 1 ㎎을 사전에 방지 GFP 코팅 구슬에 추가되는 1X에서의 RIPA + 버퍼 1 ML에 SMRwt 또는 SMRmut 펩타이드의 2 μg으로 미리 배양 할 수 있습니다.
- 세척 버퍼 1 ㎖에 부유 통해 구슬을 씻으십시오 (50 MM 트리스 • 염산 산도 7.4, 150 MM의 염화나트륨, 0.1 % 트윈 20). 4에서 5 분 ° C.에 대한 엔드 오버 엔드 회전을 품다 비즈 F를 분리ROM 자기 분리 스탠드를 사용하여 세척. 각각 250 mm와 300 mM의 NaCl을을 포함 세척 버퍼로 구슬 두 번째 및 세 번째 시간을 씻으십시오.
- PBS 200 μL에 구슬을 resuspend을, 깨끗한 튜브에 혼합물을 전송하고, 자기 스탠드에 세척에서 구슬을 분리합니다. 95 ° C에서 Laemmli에 샘플 버퍼 5 분 50 μL에 구슬을 삶아, 혼합물을 실온에서 10 분 동안 냉각 할 수 있도록하고 분리 마그네틱 스탠드에 혼합물을 배치하고 상층 액 (이하 "용출액")를 수집 .
- 8~16% 트리스 - 염산 기준 프리 캐스트 젤에 SDS-PAGE에 의해 용출액의 단백질을 분리합니다.
- 질량 분석
- 소비세 매시 묻은 젤의 관심의 단백질 밴드.
- 37 45 분 동안 10 mM의 1,4 - 디티 올 트레이 톨 (DTT)에서 샘플을 줄일 ° C.
- 25 45 분 ° C. 55 MM의 요오도 아세트 아미드에 샘플을 Alkylate
- 등급 시도 시퀀싱 하룻밤 샘플을 소화37 psin (Promega 사) ° C.
- C-18 ZipTip (밀리 포아)를 이용하여 시료의 펩티드를 탈염. 알파 CHC 매트릭스 (애질런트 테크놀로지스, 산타 클라라, CA)를 이용하여 시료의 펩타이드를 혼합 MTP 대상 프레임 III (브루 커 달 토닉 주식 회사, 빌리, MA)에 그들을 발견.
- 브루 커 달 토닉 ULTRAFLEX III TOF / TOF를 사용하여 (MALDI-TOF/TOF) 질량 분광법 분석의 비행 직렬 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간을 수행 할 수 있습니다.
- MS / MS 데이터 마스코트 알고리즘 (사용 NCBI 비 중복 및 스위스 보호 해주는 데이터베이스에 비교 www.matrixscience.com을 ).
- 면역 블롯 분석
- 4~20% 또는 8-16% 트리스 - 염산 기준 프리 캐스트 젤 (바이오 래드)을 SDS-PAGE로 단백질 샘플을 분리합니다. 니트로 셀룰로오스 막에 전기 영동 밴드를 전송합니다.
- 5 분, 트리스 막 씻어 (바이오 래드 TBS) 염분 버퍼. 0.1 % 트윈 2 (TTBS에 5 % 탈지 우유 TBS를 차단1) 실온에서 흔들어 1 시간.
- 4 ° C에서 하룻밤 진탕 5 % 탈지 우유에 특정 기본 항체를 사용하여 immunoblotting을위한 멤브레인을 처리합니다. 실온에서 1 시간 동안 5 % 탈지 우유 차 HRP 결합 된 IgG의 (H + L) 항체 다음 20 분 동안 TTBS로 세척 할 것. 30-60 분 동안 TTBS로 세척 할 것.
- 서양 더럽히는 루미놀 시약 (산타 크루즈 바이오 테크놀러지 주식, 산타 크루즈, 캘리포니아)에 의해 단백질 밴드를 감지합니다. 사진 필름에 필터를 노출합니다. 참고 : 일부 실험에서는, 스트립 시약이 다른 기본 및 보조 항체 후속 하이브리드와 멤브레인 (피어스, 록 퍼드, IL) 제거하는 데 사용되었다.
- 어도비 포토샵 5.0.2에 X-선 필름을 스캔합니다. ImageJ에 소프트웨어 (건강의 국립 연구소, 베데스다, MD)를 사용하여 농도계 분석을 수행합니다.
II. 기능 분석에 항체 억제의 사용
II.1. Antibod의 공동 형질 전환이거는 전차 단백질 배달 시약 키트를 사용
- 형질 반응 혼합물 당, 1X PBS 100 μL의 최종 볼륨, wtNef-GFP 플라스미드 DNA 1 μg 및 안티 mortalin 항체 또는 항-α-tubulin에 항체 하나의 1 μg을 희석. 참고 : 이전에 항-α-tubulin에 항체의 공동 형질이 exNef 분비에 아무런 감지 효과가없고, 따라서이 실험에서 효과가 대조군 역할을 한 것으로 나타났습니다.
- 멸균 물 100 μL의 최종 볼륨에 희석 전차 시약의 6 μl를 희석하고 희석 DNA 항체 혼합 결합합니다.
- 전차 / DNA 항체 복합체의 형성을 할 수 있도록 30 분 동안 실온에서 알을 품다.
- 5 분 600 XG에서 원심 분리하여 펠렛 3 × 10 5 된 Jurkat 세포.
- 1X PBS로 두 번 세포를 씻으, 그리고 전차 / DNA 항체 복합체에 resuspend을.
- 서스펜션에 혈청 RPMI 1640 배지 400 μl를 추가하고 C를 품어37 문화 접시에 ELL 학생 ℃에서 2 시간 동안 C.
- 각 플레이트에 10 % FBS를 포함하는 신선한 RPMI 1640 배지 1 ㎖를 추가하고, 37에서 48 시간 동안 세포를 품어 ° C.
II.2. 항체 억제의 NEF-GFP 분비 형광 플레이트 리더 분석
- 수확 된 세포에서 세포 무료 에어컨 미디어를 수집하고, 96 - 웰 블랙의 microtiter 플레이트의 각 웰에 100 μl를 전송합니다.
- 여기 파장 485 nm의 발광 파장 상대 형광 단위 515 m로 TECAN GENEios의 fluorimeter의 미디어 측정 GFP 형광.
- 컨트롤의 GFP 형광의 수준 (세포 미디어 네프-GFP 및 안티-α-tubulin에 항체와 공동 형질) 100 %로 설정합니다.
- 세포 미디어 네프-GFP 분비의 변화를 확인하기 위해 안티 - mortalin 항체와 공동 형질에서 GFP 형광의 수준이 비교할 수 있습니다.
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Representative Results
펩티드를 사용하여 생물학적 기능 모티프를 매핑. 두 개의 영역이 세포 사멸을 유도 네프 단백질에서 발견되었다. 펩타이드 기반의 세포 사멸은 N60 (aa40-60)과 N70 (AA50-70)에서 정점 및 펩타이드 N100 (aa80-100)에서 배경 수준으로 감소, 펩타이드 N50 (aa30-50)과 (그림 2) 처음 관찰되었다. AA50-60을 중심으로 주요 주제 1 (M1) 피크, 전체 길이 네프 단백질의 세포 사멸 수준의> 80 %를 유도합니다. 둘째, 작은 세포 사멸 피크 펩티드에게 N180 (aa160-180)과 N190을 (aa170-190)에 걸쳐 관찰되었다. aa170-180을 중심으로이 부 주제 2 (M2) 피크, 전체 길이 네프 단백질 16의 세포 사멸 레벨 ~ 30 %를 유도합니다.
경쟁 저해 분석 펩티드를 사용하여. 그림 3에서 그대로 SMR을 포함하는 펩타이드이 크게 exNef 분비를 억제. 주제는 N-말단 (Wildty에 위치한 있는지 여부는 사실PE-1) 또는 펩타이드의 중간 (야생형-2), 또는이 펩티드 (야생형-3)에서 중복되었습니다. 또는,에 관계없이 펩타이드 모티브의 위치 또는 숫자를 모티브의 아미노산의 알라닌 - 대체, 펩타이드의 기능 18 폐지. 11-아미노산은 네프의 세포 사멸 주제 1 (SM1)의 버전을 스크램블 이전 14 설명한 시그마 Genosys에서 얻은, 음성 대조군으로 사용되었다 exNef 분비에 영향을 미치지 않습니다. 펩타이드 서열의 목록은 표 1을 참조하십시오.
미끼로 펩티드를 사용하여 주제 바인딩 파트너를 분리. 그림 4A는 SMRwt 펩타이드 (60, 65, 75, 및 250 kDa의) 포 단백질의 공동 면역 침전을 보여줍니다. 대조군 SMRmut 펩타이드는이 단백질을 캡처하지 않았으며,이 단백질이 아닌 특정 펩타이드의 부재 선호도 수지와 상호 작용하지 않았다, 공동 immunoprecipitated 단백질 상호 작용 있다고 제안특히 SMRwt 펩타이드의 SMR 모티프로. 이 단백질은 이후 MALDI-TOF 탠덤 질량 분석법 (대표 샘플 그림 4B 참조)에 의해 식별 및 면역 블롯 분석 (18)에 의해 확인 하였다.
기능 분석의 항체 억제 사용합니다. 항 mortalin 항체를 완전히 폐지 exNef 분비 (그림 5)를 억제. 이것은 그대로 네프 / mortalin 상호 작용이 exNef 분비를 위해 필요하다는 것을 확인 하였다. 또한, 강하게 SMRwt 펩타이드가 exNef 분비를 억제하는 메커니즘이 mortalin 18 일에 대한 직접적인 경쟁이 상호 작용의 중단을 통해하는 것이 좋습니다.
표 1. SMR 펩티드의 패널 네프 유도 exNef 분비에 미치는 영향에 대한 개발 및 테스트.이 탭을르는 원래 셸턴 등., JVI 2012 년 18 년에 출판되었다. 이전의 연구에서 SMR 모티브 단일 아미노산 알라닌 - 교체가 크게 감소하거나, 네프에 의한 분비 18에게 폐지. 한 장기 nonprogressor에서 분리 바이러스 V66 대신 이소와 네프의 변형 표현;. 높은 보존 SMR 모티브 20 몇보고 변화 중 하나를 큰 테이블을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 1. 주요 면역 세포 유형에 대한 네프 exosomes의 영향.이 모델은 감염된 세포에서 방출 exNef를 표시하고 그것을 AIDS로 이어질 단핵 세포와 림프 세포에 미치는 영향을 예측이야병인. AICD, 활성화 유도 세포 죽음. I. 감염된 세포 출시 바이러스, 일반 exosomes 및 exNef. exNef가 활성화되지 않은 감염이 단핵 세포 (B)를 활성화합니다. 단핵구의 활성화는 염증 상태와 CD4의 활성화와 피로의 결과의 증가로 이어지는 유전자 발현의 변화 (C) 결과 +와 CD8 + T 세포. II. 감염된 세포 출시 바이러스, 일반 exosomes 및 exNef. exNef가 활성화되지 않은, 감염 임파구 (D)을 활성화합니다. 활성화 된 림프구 (E) 검색 결과에서 사멸 세포 (F)의 결과로한다 aicd하는 유전자 발현 변화를 겪는다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 펩타이드전자 사멸 주제 (들) HIV-1 Nef의 단백질 분석을 스캔. KNFS 네프 단백질의 205 아미노산에 걸쳐 20mer 펩티드, 10 아미노산 중복에 각각의 세트는 에이즈 시약 프로그램에서 얻은 사용되었다 네프 세포 사멸 도메인을 매핑합니다. 이 그림은 원래 황 등으로 출판되었다., JVI 2004 년 13. Y 축 TUNEL이 표시되어 세포의 비율을 보여주고, X 축은 처리 상태를 나타냅니다. 전체 네프 단백질 [네프] 치료 세포 [UT] 또는 AA1-20 [N20]로 시작하고, aa190-205로 끝나는 펩티드 [N205]. 오차 막대는 측정의 표준 오차를 나타낸다, 그 결과는 적어도 3 독립적 인 실험의 편집이다. 세포 사멸의 피크가 주제 1, 주제 2로 표시됩니다.
그림 3. SMRwt 펩타이드 exNef을 억제. 포함하는 펩티드이 지역의 모든 ANIMO 산의 알라닌 - 교체가 크게 펩타이드의 효과를 감소하는 동안 하나 이상의 야생형 네프 SMR 시퀀스 주제는 exNef의 분비를 억제. 이 그림은 원래 셸턴 등., JVI 2012 년 15 년에 출판되었다. 된 Jurkat T 세포 네프-GFP 복제 및 각종 SMR 펩티드와 공동 형질에서 문화 미디어 exNef 분비을 분석 하였다. 측정 GFP 형광의 양이 세포 미디어 exNef-GFP의 양에 해당합니다. 통계적 유의성은 t-test를 짝을 사용하여 측정 하였다. 다양한 펩티드의 exNef 분비에 미치는 영향은의에 비해 한 무작위 펩티드 컨트롤을 스크램블 (SM1, * p 값 <0.05, ** p 값 <0.01, *** p 값 <0.001).
그림 4. SMRwt 펩타이드는 MOR 포함, 숙주 세포 단백질과 특히 상호 작용 talin. (A) 인 Jurkat T 세포에서의 단백질은 안티-FLAG M2 항체 결합 친 화성 수지를 사용하여 SMRwt 또는 SMRmut 펩타이드 하나와 함께 공동 immunoprecipitated 하였다. 여기에 사용 SMRwt 및 SMRmut 모두 펩티드에 포함 된 FLAG 태그 서열을 갖고 있음에주의해야한다. 이 그림은 원래 셸턴 등., JVI, 201215 년에 출판되었다. 이 절차는 선호도 수지 비 특정 상호 작용을위한 컨트롤과 같은 두 펩타이드의 부재에서 반복되었다. 그림 쿠마시 블루 염색 젤 분자 60 무게, 65, 75, 및 SMRmut 펩타이드에 의해 또는 전혀 펩티드 내려 오게하지 않은 SMRwt에 의해 아래로 당겨 250 kDa의 (화살촉)와 단백질을 표시합니다. (B) 75-kDa의 밴드 젤에서 절제되었고, 트립신 - 소화 MALDI-TOF 탠덤 질량 분석법에 의해 분석 하였다. MS / MS 이온 검색 mortalin로 75 kDa의을 확인했다. 화살표는 일치하는 펩타이드의 시퀀스를 나타냅니다.large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오
그림 5. Mortalin 항체 억제 블록 exosome 분비. 인 Jurkat 세포에서 세포 외 문화 미디어, mortalin 또는 α-tubulin의 하나에 대한 네프-GFP 클론 항체와 공동 형질은 exNef 분비을 분석 하였다. exNef 분비 (α-tubulin의), 그 항체 mortalin의 활동 중단이 exNef 분비의 완전한 폐지의 결과에 참여하지 단백질에 대한 항체의 효과를 비교합니다. 통계적 유의성에 의해 결정되었다 짝 α-tubulin에 항체 (*** p 값 <0.001) 대 mortalin 항체의 존재 exNef 분비를 비교 t-test를. 이 그림은 원래 셸턴 등., JVI 2012 년 18 년에 출판되었다.
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Discussion
exosomal 인신 매매 통로 exNef 분비 엔지니어링 소설 억제제에 도움이 될 것입니다 조작은 NEF의 능력을 기본 메커니즘을 이해. exNef 분비의 억제는 CD4 T 세포 고갈과 CIA 해당 드라이브 HIV / AIDS 발병을 감소해야한다. 이 목표를 향해, 우리는 우리가 exNef 분비의 유전학을 분석하고, 관련된 세포 단백질을 결정하기 시작 허락 소설 시약 및 방법론의 숫자를 개발했습니다. 이 방법은 직접 exNef 분비, SMRwt 펩타이드를 대상으로하는 최초의 억제제 개발했다.
우리의 작업의 주요 발견은 우리의 경우 전체 길이 단백질에서 발견 모티브에서 파생 된 특정 짧은 펩티드, HIV-1 Nef의, 생물학적 기능을 유지뿐만 아니라, 또한 경쟁의 전체 길이 단백질의 기능을 억제 할 수 있습니다. 이 펩티드는 생물학적 기능을 유지하기 때문에,이 기능 영역을 식별하는 데 사용할 수 있습니다전체 길이 단백질합니다. 두 가지가 필요합니다 : 그 단백질의 전체 길이 하나 또는 단백질의 영역을 스캔 펩타이드의 생성은 기능 도메인 포함하는 것으로 생각하고, 문제의 생물학적 기능을 시험하기위한 분석을. 우리는 우리가 네프의 특정 지역에 apoptosis를 유도 주제에 대한 우리의 검색 범위를 좁힐 수있는 정보가 부족하기 때문에, 우리는 그것의 전체 길이를 스캔 펩티드의 집합을 사용했습니다. 이 과정은 네프의 상대적으로 작은 크기에 의해 간단하게 만들어진 동안, 우리는 또한 큰 (> 75 kDa의) 단백질에이 방법을 적용했습니다. 측정 고사 (TUNEL)에 대한 잘 확립 된 분석이 경우, CD4 T-세포의 네프에 의한 세포 사멸 관심의 생물학적 기능을 유지 펩티드를 식별하기 위해 사용되었다. 흥미롭게도, 원래의 논문에서 이후의 분석은 식별 고사 펩티드는 전체 길이 네프 단백질의 생물학적 활성의> 80 %를 유지 것을 보여 주었다, 그리고 경쟁력 CXCR4 바인딩 억제자연 리간드의 SDF-1α.
마찬가지로, 네프의 SMR 모티프를 포함하는 짧은 펩타이드 exNef 분비에 관여 세포 단백질과 상호 작용하는 생물학적 기능을 유지. 그러나 활동이 인스턴스 유지에서와 같은 세포 사멸 유도의 경우는했지만, 억제하는 대신 주도 네프 기능의 흉내로 연결되지 않았다. SMRwt 펩타이드가 효과적으로 세포 단백질의 SMR-결합 부위를 묶고 있기 때문에 네프와의 상호 작용을 방해하고, 결과적으로 exosomes에있는 네프의 분비를 막았다. 관심 네프 모티프가 이전의 유전자지도 연구에서 알려진대로, 우리는 SMR의 변화에 펩타이드 개발을 제한 할 수 있었다. 대신에 새로운 기능 모티프를 식별, 우리는 exNef 분비 SMR의 역할은 특정 기본 시퀀스에 직접 연결되었다는 것을 증명하기 위해 exNef 분비를 측정하기 위해 이러한 펩티드, 그리고 이전에 개발 된 형광 기반의 분석을 사용 하였다.
HIV-1, 인간 단백질 상호 작용 데이터베이스 네프와 직접 상호 작용 그리고 아마도 많은 200로 직접 또는 간접적으로 19 상호 작용하는 60 개 이상의 세포 단백질을 나열합니다. 관심 주제에 대한 우리의 미끼 단백질의 순서를 제한함으로써, 우리는 전체 길이 네프 단백질에 의해 공동 immunoprecipitated했을 단백질의 수십을 정렬하는 것을 피했다. 이러한 단백질의 대부분은, 네프 특정 동안 네프의 SMR에 대해 구속력을 파트너가되지 않을 것이며, 따라서 배경 / 잡음을 구성합니다. 보수적 인 계산은 우리가 15 배 (61 / 4)의에 의해 소음을 감소한다는 것입니다. 본질적으로, 우리의 접근 방식은 효율적으로 오프 사이트로 인해 배경을 최소화하여 신호 대 잡음 비율을 증가, 또는 우리의 경우 오프 주제 바인딩, 우리가에 IDE 허용특히 SMR 바인딩 단백질을 ntify. 그러나이 방법을 사용하여, 우리는 또는 특히 모든 SMR-결합 단백질이 세포, SMR 및 네프을 바인딩하는 두 번째 주제 모두와의 상호 작용을 필요로하는 사람들, 또는 그 결합 보조에 의존 사람들을 캡처하는 데 실패했습니다 가능성이 있습니다 차 구조.
Mortalin, 세포의 단백질 SMRwt 펩타이드에 의해 공동 immunoprecipitated는 miRNA의 넉다운 항체 억제에 의해 exNef 분비에 필요한 것으로 표시되었습니다. 전자는 대상 단백질의 발현을 감소 시키거나 제거하는 노포의 기술입니다. 반대로, 항체 억제 단백질 발현 수준에 영향을주지 않습니다, 대신에 물리적으로 다른 단백질과 표적 단백질의 상호 작용을 억제. 우리는 exNef 분비에 대한 네프 - mortalin 상호 작용의 중요성을 설명하기 위해 두 번째 방법을 사용. 항체 억제 항체를 도입하는 방법을 필요로하는 직선 - 앞으로 절차문제의 생물학적 기능에 미치는 영향을 테스트하기위한 세포 분석에. 우리는 셀과 exNef 분비의 변화를 측정하기 위해 앞서 언급 한 형광 기반의 분석에 셔틀 방지 mortalin 항체 전차 단백질 배달 시약을 사용 하였다. 대부분의 항체 기반의 절차와 마찬가지로 항체 억제 효과는 대상 단백질에 대한 항체의 친화력과 특이성에 의해 제한됩니다.
HIV 연구의 주요 목표는 새로운 치료제의 개발과 치료를위한 잠재적 표적의 식별이다. 절차는 여기에서 생물학적 기능을 유지하고 경쟁력있는 전체 길이 단백질의 기능을 억제 할 수,이 과정을 가속화하기 위해 활용 특정 짧은 펩티드를 설명했다. 설명 실험이 중요한 HIV 기능을 이해에 지시 동안, 고용 기술은 단백질 - 단백질 상호 작용의 연구와 펩타이드 기반의 개발에 적용해야한다여러 분야의 억제.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH / NIGMS / MBR에 (그랜트 58268), NIH / NCRR / RCMI (부여 G12-RR03034), 조지아 리서치 얼라이언스 자금을 부여 GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA 부여 F31AI091484, 모리 CFAR 교부금 P30에 의해 지원되었다 A1050409. 이 연구는 NIH / NCRR에서 연구 시설 개선 보조금 # C06 RR18386의 지원으로 건설 시설에서 실시되었다. 된 Jurkat 세포 20의 집합 HIV-1 Nef의 펩티드뿐만 아니라, 토끼 반대로 HIV-1 Nef의 항혈청은 NIH AIDS 연구 및 참조 시약 프로그램 (락빌, MD)에서 하였다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
References
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