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Immunology and Infection

Identificação baseada em peptídeo de motivos funcionais e seus parceiros de ligação

doi: 10.3791/50362 Published: June 30, 2013

Summary

Técnicas para dissecar os mecanismos subjacentes a secreção de HIV-1 Nef em exosomes são descritos. Pequenos peptídeos específicos derivados da proteína Nef e transfecção foram explorados para determinar a estrutura, função e parceiros de ligação da secreção Modificação Região de Nef. Estes procedimentos têm relevância geral em muitos estudos mecanicistas.

Abstract

Péptidos curtos derivados de motivos específicos encontrados em proteínas de comprimento total, no nosso caso, o HIV-1 Nef, não só mantêm a sua função biológica, mas também pode inibir competitivamente a função da proteína de comprimento completo. Um conjunto de 20 péptidos Nef de varrimento, de 20 aminoácidos de comprimento, com cada uma sobreposição de 10 aminoácidos do seu vizinho, foram utilizados para identificar motivos de Nef responsável pela sua indução de apoptose. Os péptidos que contêm estes motivos apoptóticos apoptose induzida em níveis comparáveis ​​aos da proteína Nef de comprimento completo. Um segundo péptido, derivado da região Modificação Secreção (SMR) da Nef, reteve a capacidade de interagir com as proteínas celulares envolvidas na secreção de Nef no exosomes (exNef). Este péptido SMRwt foi usado como o "isco" proteína em experiências de co-imunoprecipitação de isolar as proteínas celulares que se ligam especificamente ao motivo do SMR Nef. A transfecção e o anticorpo de inibição da proteína foi utilizado para destruir fisicamente a aposta interacçãoween Nef e mortalin, uma das proteínas de ligação ao SMR isolado, e o efeito foi medido com um ensaio de secreção exNef baseado fluorescente. A capacidade do peptídeo de SMRwt para superá Nef completo para proteínas celulares que se ligam o motivo SMR, torná-lo o primeiro inibidor da secreção exNef. Assim, empregando as técnicas aqui descritas, que utilizam as propriedades únicas de péptidos curtos derivados de motivos específicos encontrados em proteínas de comprimento completo, pode-se acelerar a identificação de motivos funcionais em proteínas e ao desenvolvimento de inibidores à base de péptidos de funções patogénicos.

Introduction

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Com o advento da terapia anti-retroviral, a epidemia de aids no mundo ocidental tem sido abrandado, mas não reduzido, ea propagação do HIV continua a ser um importante problema de saúde em todo o mundo. Com a excepção do marginalmente eficaz RV144 Thai ensaio, vacinas anti-HIV até agora mostraram falta de protecção contra a infecção. Assim, a investigação sobre potenciais alvos terapêuticos adicionais, ainda se justifica.

Junto com depleção de células T CD4, ativação imune generalizada persistente é uma característica da infecção pelo HIV. Esta ativação imune crônica (CIA) leva a um aumento no volume de células, subpopulações linfocitárias ativadas e diferenciadas, a exaustão celular e senescência, ea morte de células T e células B através da ativação morte celular induzida (AICD) 1,2,3, e está bem estabelecido como um dos mais fortes preditores de progressão da doença 4,5,6,7,8,9,10,11,12. No entanto, os mecanismos subjacentes a CIA e CD4Depleção na infecção por VIH de células T ainda de ser completamente elucidados.

Evidência do nosso laboratório e outros levaram-nos a um modelo para a progressão da doença (Figura 1) em que a proteína Nef do HIV (factor regulador negativo) induz a sua secreção no exosomes de células infectadas pelo HIV-1 13,14. Estes exosomes Nef contendo (exNef) induzir a apoptose em diversas linhagens de células não infectadas incluindo células CD4 células T 15,16. Alternativamente, em monócitos / macrófagos exNef altera os padrões de expressão de genes, por exemplo, expressão de citoquinas e parece induzir um estado de activação imunitária marcação. Esse corpo de evidências sugere um papel importante para exNef na CIA e depleção de células T CD4.

A compreensão dos mecanismos subjacentes à capacidade da Nef manipular o caminho de tráfico exosomal será útil em inibidores da secreção exNef novos engenharia. A inibição da secreção exNef deve diminuir a depleção de células T CD4e CIA que patogênese unidade HIV / AIDS.

Para reunir as provas que levaram ao nosso modelo para o HIV / AIDS a progressão da doença e os dados posteriores que construíram sobre este modelo, desenvolvemos uma série de novos reagentes e metodologias que nos permitiu analisar a genética da secreção exNef, e começar a determinar a proteínas celulares envolvidas. No trabalho inicial, descobrimos que a proteína Nef, induz a apoptose em células espectadoras e é libertado extracelularmente a partir de células transfectadas com e Nef do HIV-infected 15. Os péptidos derivados a partir de (célula estromal Derived Factor de-1, alfa com splicing alternativo) SDF-1α tinha sido previamente demonstrado para reter a maior parte da actividade de ligação e sinalização da molécula de comprimento completo 17. Especulou-se que os peptídeos de Nef pode reter uma parte da actividade apoptótica da proteína total, e que estes péptidos seriam necessariamente conter o domínio apoptótica Nef (s). Para identificar esses peptídeos, e, conseqüentemente, a Nefdomínio apoptótica (s), obteve-se um conjunto de 20 HIV-1 Nef peptídeos digitalização a partir do NIH Research AIDS e do Programa de reagente de referência. Estes péptidos de 20-aa, cada sobrepondo 10 aminoácidos do seu vizinho, são denominados pelo número do último aminoácido, isto é, N20 vãos Nef aminoácidos 1-20, N30 vãos Nef aminoácidos 11-30, 16, etc. Descobrimos que a exposição de células T a péptidos específicos extracelularmente sobrepostos dois domínios de 10-aa distintos na proteína Nef de comprimento completo a apoptose induzida nessas células. Análise subsequente destes péptidos apoptóticos Nef derivados revelou a sua capacidade para interagir fisicamente com o receptor de quimiocina CXCR4 na superfície das células T, com a cinética de ligação que permitem estes péptidos para inibir competitivamente a ligação entre o CXCR4 e o seu ligando natural, SDF-1α. Finalmente, a interação dos peptídeos apoptóticos Nef derivados com CXCR4 foi encontrado para induzir uma resposta de estresse nestas células T-levando a apoptose. Esta prova permitiu quicdomínios funcionais da kly mapa Nef, um processo que teria levado muito mais tempo usando técnicas de mutagênicos DNA padrão, tais como alanina mutagênese de varredura. Também mostrou que estes péptidos curtos derivados de Nef mantida a função biológica dos domínios apoptóticas na proteína de comprimento completo.

Tendo identificado um papel para Nef extracelular, ou seja, a apoptose das células T, procuramos uma melhor compreensão de como a Nef foi segregada a partir de células. Usando uma série de construções mutadas Nef, que mapeada altamente conservadas motivos de proteína Nef nas regiões N-terminais de ambas Nef do HIV, e sua equivalente Rhesus macaque mac SIV (vírus da imunodeficiência dos símios) Nef, que são críticos para a secreção exNef 13. Um destes motivos, a Região Modificação Secreção (SMR; 66VGFPV70), era particularmente crítico, como a substituição de alanina de qualquer dos seus cinco aminoácidos ou grandemente reduzida ou abolida secreção exNef. Quando entregue às células via C do Motif atividadeHariot Proteína Reagente de entrega, um peptídeo contendo o SMR ligado a uma sequência de péptido FLAG (SMRwt) foi encontrada para inibir a secreção de ambas exNef Nef transfectadas e células infectadas pelo HIV 18. Com base em nossa experiência anterior com peptídeos, decidimos usar esse peptídeo para elucidar as moléculas e os mecanismos subjacentes papel do Nef SMR na secreção exNef.

Utilizando o nosso péptido SMRwt como "proteína de isco", que co-imunoprecipitada parceiros de ligação celulares do SMR a partir de lisados ​​de células T-18 não infectadas. A sequência do péptido FLAG fornecida uma pega conveniente para capturar o péptido SMRwt usando resina de afinidade anti-FLAG. Nossa conclusão anterior de que um único valina para alanina mutação no peptídeo SMRwt foi suficiente para abolir a inibição da secreção de exNef identificado um peptídeo controle conveniente, altamente específico (SMRmut) que usamos para descartar proteínas co-imunoprecipitadas não específicos para a SMR. Utilização de um péptido com a sESPECÍFICAS domínio de interesse, em vez de a proteína de comprimento completo permitiu ultrapassar o rastreio de dezenas de factores celulares que se ligam a outros domínios Nef 19.

Uma vez identificados os parceiros de ligação de SMR, o próximo passo lógico foi mostrar que os parceiros de ligação celulares identificados são importantes para a função biológica 18. O procedimento padrão para realizar isto é a níveis de proteína de knockdown utilizando miRNA proteína-alvo específico ou siRNA, e subsequentemente ensaio o efeito sobre a função biológica. Realizou knockdown miRNA, que inibe a tradução do ARNm alvo, reduzindo a produção desse objectivo, neste caso, uma proteína de ligação ao SMR. Esta redução da proteína alvo é um efeito indirecto, e, possivelmente, tem um efeito de atraso sobre a função biológica da proteína alvo tem um papel cm consequência, também empregaram a técnica menos comum de inibição de anticorpos para determinar se perturbar directamente a actividadea proteína alvo reduz ou elimina a função biológica. Neste processo, os anticorpos criados contra a proteína alvo são transfectados para a célula usando Reagente Carruagem, e interagir directamente com a proteína alvo, quer sequestrando-do seu local de função, ou o seu domínio de ligação de bloqueio pertinentes. A inibição da proteína-alvo através deste procedimento interrompe directamente a sua função, e pode complementar os procedimentos de knockdown de ARN, confirmando ainda a importância da proteína alvo para a função biológica.

Enquanto Reagente Carruagem é eficaz no fornecimento de peptídeos e proteínas para as células, este processo é demorado e limita os tipos de experiências, por exemplo, a exposição repetida ou prolongada e em estudos em animais in vivo que podem ser executadas. Consequentemente, adicionou-se uma sequência de péptido de célula-penetrante (CPP) para o péptido SMRwt (SMRwt-CPP) 18 para gerar um péptido que pode ser absorvido pelas células passivamentea partir dos meios de cultura. Esta versão foi tão eficaz como o ex-exNef inibir a secreção.

A evidência a partir destas experiências publicadas demonstra a capacidade de péptidos pequenos contendo motivos funcionais específicos para antagonizar a função da proteína de comprimento completo através da inibição competitiva, e para isolar as proteínas que se ligam a estes motivos. Seria de esperar que estas técnicas pode ser útil em vários protocolos experimentais. Eles também devem ser eficazes em novos inibidores de muitos processos celulares peptídeo engenharia; uma função que pode ser reforçada pela ligação a seqüências CPP.

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Protocol

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I. Utilização de péptidos curtos, em análise biológica

I.1. Mapeamento Motivos Biologicamente funcional utilizando Peptídeos

  1. Tratar as células com os péptidos de digitalização Nef
    1. Obter um conjunto de peptídeos de varredura da região de interesse. Para as nossas experiências, os péptidos 20-mer, com 10 sobreposição de aminoácidos, que abrangem toda a proteína HIV-1 Nef (205 aa) foram obtidas a partir do Programa Reagente de SIDA. Os péptidos são ensaiados individualmente, como se segue:
    2. Adicionam-se 10 ng / ml de péptido no meio de cultura celular.
    3. Adicionar 10 ml de meio de cultura por placa de cultura de células Jurkat.
    4. Incubar as culturas durante 24 horas a 37 ° C.
  2. Terminal deoxynucleotidyltransferase mediada dUTP biotina Nick End Labeling (TUNEL) ensaio de apoptose
    1. Lavar as células com PBS 1X e fixar durante 30 min à temperatura ambiente com 4% de paraformaldeído em PBS 1X, pH 7,4.
    2. Lava-se com PBS 1X, e permeabilizar com 0,1% de Triton X-100 por 10min à temperatura ambiente.
    3. Lavar as células duas vezes com 1X PBS.
    4. Contagem de células coradas por epifluorescência num sistema de microscopia controlada por computador.

I.2. Análise da inibição competitiva usando Peptídeos

  1. Co-transfecção de peptídeos utilizando o Chariot Protein entrega kit de reagentes
    1. Por mistura de reacção a transfecção, dilua 1 ug de wtNef-GFP ADN plasmídico e 100 ng de ambos os péptidos de tipo selvagem derivadas do domínio SMR ou péptidos que contêm alanina, a substituição de aminoácidos individuais no motivo SMR, para um volume final de 100 ul com 1X PBS.
    2. Dilui-se 6 ul de uma diluição de Reagente Carruagem de 1/10 até um volume final de 100 uL com água estéril, e combinar-se com a mistura de ADN-péptido diluído.
    3. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min para permitir a formação da Carruagem / complexo DNA-péptido.
    4. Pellets de 3 x 10 5 células Jurkat por centrifugação a 600 xg durante 5 min.
    5. Lave as células duas vezes com 1X PBS, e ressuspender no complexo Carruagem / DNA-péptido.
    6. Adicionar 400 ul de soro de meio RPMI 1640 para a suspensão e incubar as células em placas de cultura a 37 ° C durante 2 horas.
    7. Adicionar 1 ml de meio RPMI 1640 fresco contendo 10% de FBS a cada placa e incubar as células durante 48 horas a 37 ° C.
    8. Células colheita e determinar a eficiência de transfecção por microscopia de fluorescência.
  2. Nef-GFP secreção fluorescente ensaio leitor de placas de inibição peptídeo
    1. Recolher os meios condicionados isentos de células a partir de células colhidas e transferir 100 ul às cavidades individuais de uma placa de microtitulação de 96 poços preta.
    2. Medida de fluorescência da GFP nos meios de comunicação em um GENEios fluorímetro Tecan com comprimento de onda de excitação de 485 nm e 515 nm de comprimento de onda de emissão em unidades fluorescentes relativos.
    3. Defina o nível de fluorescência da GFP no controle (mídia a partir de células co-transfectadas com Nef-GFP e um peptídeo mexidos) A 100%.
    4. Compare-se com o nível de fluorescência da GFP nos meios das células co-transfectadas com vários péptidos SMR para determinar as alterações na secreção de Nef-GFP.

I.3. Isolando Motivo Partners ligação usando Peptídeos como isca

  1. Co-imunoprecipitação com péptidos SMR
    1. Cultivar células de Jurkat em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS a 37 ° C num frasco de cultura de tecido T-75, e as células por centrifugação a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. Determinar a eficiência da transfecção, através da colocação da placa sob um microscópio de fluorescência, a captura de imagens, e subsequentemente contagem total de células e rotulado e determinar as células marcadas por cento.
    2. Ressuspender o sedimento de células em 1 ml de PBS 1X, e transferi-la para um tubo Eppendorf de 1,5 ml. Microcentrífuga a 1.000 xg durante 1 min. Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de lise α-FLAG por pipetagem suave. O tampão de lise: 50 mM Tris mistura • HCl pH 7,4, 150 mM de sódio chloride [NaCl], EDTA a 1 mM, e 1% de Triton X-100, com 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo [PMSF], e 10 ul / ml de cocktail de inibidores de protease para utilização com células de mamíferos e de extractos de tecido [PIC; Sigma]. Faça imediatamente antes de usar.
    3. Diferencialmente microcentrífuga as suspensões a 2.000 xg durante 5 min, e a 13.000 xg durante 10 min para sedimentar os detritos celulares e o ADN, respectivamente. Recolhe-se o sobrenadante (daqui em diante referido como o "ligado").
    4. Adicionar 1 mg de proteína de lisado e 1 ng de qualquer péptido ou a SMRwt SMRmut a 20 ul de anti-FLAG M2 gel de afinidade (daqui em diante chamado de "resina", Sigma). Note-se que tanto SMRwt e SMRmut usados ​​aqui têm uma sequência de marcador FLAG incorporados nos péptidos. Levar a mistura até um volume final de 1 ml em tampão de Co-IP (tampão de lise α-FLAG sem PMSF e PIC). Incubar a mistura a 4 ° C durante a noite, com rotação extremidade-a-extremidade. Como controlo negativo, incubar o lisado com a resina na ausência de qualquer péptido.
    5. Pellet da resina por microcentrifugação a 5000 - 8000 xg durante 30 seg. Permitir resina que se contentar com 2 min antes de manusear a amostra e, em seguida, aspirar o sobrenadante. Remover o sobrenadante com uma ponteira estreita-end, ou uma seringa Hamilton, tomando cuidado para não transferir qualquer resina. Ponteiras Narrow-end pode ser feita usando uma pinça de beliscar a abertura de uma pipeta de plástico até que seja parcialmente fechada. Lavar a resina com quatro vezes com 500 ul de tampão de lavagem (50 mM Tris • HCl pH 7,4, e NaCl 150 mM). Eluir as proteínas celulares ligados com 15 ug de péptido FLAG 3X (Sigma) em 50 ul de tampão de lavagem e incubar no balancim / agitador durante 30 min à temperatura ambiente.
    6. Concentra-se o eluato por precipitação com acetona, seguido por fervura em tampão de amostra de Laemmli (Bio-Rad). Separa-se as proteínas por SDS-PAGE a 4-20% em Tris-HCl Critério de gel pré-moldado (Bio-Rad). Coloração do gel com Azul Brilhante de Coomassie R-250 (Bio-Rad). Nota: para os experimentos de identificação de espectrometria de massa (
  2. Co-imunoprecipitação com a proteína Nef-GFP
    1. Misturar 50 ml de Dynabeads proteína G esferas magnéticas (Invitrogen) com 2 ug de anticorpo monoclonal murino anti-GFP em 1 ml de 1X PBS com 0,02% de Tween 20 (PBS-T). Incubar a mistura com rotação extremidade-a-extremidade num tubo de Eppendorf de 1,5 ml durante 1 hora a 4 ° C.
    2. Separa-se as esferas do buffer, colocando o tubo em 1,5 ml Magnasphere Tecnologia suporte de separação magnética (Promega Corp, Madison, WI), permitindo suspenso magnético, seguido por remoção do sobrenadante. Lave os anti-GFP esferas revestidas com 1 ml de PBS-T usando pipetagem suave.
    3. Lise de células de Jurkat transf Nef-GFP com 1 ml de 1X tampão RIPA + por pipetagem suave e incubação durante 15 mem em gelo. + Tampão RIPA: 10X tampão de lise RIPA, pH 7,4 [Millipore, Bedford, MA] 01:10 diluída em água estéril, 0,02% de azida de sódio [Sigma], e 0,1% de sulfato de dodecilo e sódio [SDS], com 1 mM de PMSF e 10 ul / ml PIC adicionado imediatamente antes de usar.
    4. Pellet os restos celulares por microcentrifugação a 2000 xg durante 10 min. Recolhe-se o sobrenadante (daqui em diante referido como o "ligado").
    5. Adicionar 1 mg de proteína de lisado para os anti-GFP grânulos revestidos, trazer o volume final de 1 ml com 1X + tampão RIPA, e incubar-se a mistura com rotação extremidade-a-extremidade durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Para estudos de competição de péptidos, de 1 mg de proteína de lisado pode ser pré-incubadas com 2 ug de SMRwt SMRmut ou péptido em 1 ml de RIPA + 1X tampão, antes de serem adicionados aos anti-GFP grânulos revestidos.
    6. Lavar os grânulos através de ressuspensão em 1 ml de tampão de lavagem (50 mM Tris • HCl pH 7,4, NaCl 150 mM e 0,1% de Tween 20). Incubar com rotação extremidade-a-extremidade durante 5 min a 4 ° C. Separa-se a grânulos de from a lavagem usando o suporte de separação magnética. Lavar as pérolas uma segunda e uma terceira vez com tampões de lavagem contendo NaCl 250 mM e 300 mM, respectivamente.
    7. Voltar a suspender as pérolas em 200 ul de PBS, transferir a mistura para um tubo limpo, e separar as pérolas da lavagem sobre o suporte magnético. Ferver as esferas em 50 ul de tampão de amostra Laemmli, 5 min a 95 ° C, deixar a mistura a arrefecer durante 10 min à temperatura ambiente, e, em seguida, colocar a mistura sobre o suporte para a separação magnética, e recolhem-se os sobrenadantes ("eluatos") .
    8. Separa-se as proteínas do eluato por SDS-PAGE em um tampão Tris-HCl Critério pré-moldado em gel 8-16%.
  3. Espectrometria de massa
    1. Impostos as bandas de proteínas de interesse de géis corados com Coomassie.
    2. Reduzir as amostras em 10 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT) durante 45 minutos a 37 ° C.
    3. Alquilar as amostras em 55 mM de iodoacetamida durante 45 minutos a 25 ° C.
    4. Digerir as amostras durante a noite com o seqüenciamento tentativa graupsin (Promega) a 37 ° C.
    5. Dessalinizar os péptidos da amostra com ZipTip C-18 (Millipore). Misture os peptídeos da amostra com alfa-CHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), e identificá-los em um alvo MTP quadro III (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA).
    6. Realize conjunto dessorção / ionização tempo de laser matrix-assisted de vôo análise Espectrometria de Massa (MALDI-TOF/TOF), utilizando um Bruker Daltonics UltraFlex III TOF / TOF.
    7. Compare os dados do MS / MS para os bancos de dados não-redundantes e Swiss-Prot NCBI usando o algoritmo Mascote ( www.matrixscience.com ).
  4. Immunoblot Análise
    1. Separa-se as amostras de proteína por SDS-PAGE a 4-20% ou 8-16% de Tris-HCl Critério de géis pré-moldado (Bio-Rad). Transferir as bandas electroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose.
    2. Lava-se a membrana em tampão salino Tris (TBS; Bio-Rad), durante 5 min. Bloco com 5% de leite desnatado em TTBS (TBS com 0,1% de Tween 20) durante 1 hora, agitando à temperatura ambiente.
    3. Processo para a membrana de imunotransferência, utilizando um anticorpo específico primário em 5% de leite desnatado, com agitação a 4 ° C durante a noite. Lavar com TTBS, durante 20 min seguido por um conjugado de HRP de IgG de anticorpo secundário (H + L) em 5% de leite desnatado durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavar em TTBS durante 30-60 min.
    4. Detectar as bandas de proteínas por Western Blotting Reagente Luminol (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Exponha o filtro para filme fotográfico. Nota: Em algumas experiências, um reagente de extracção foi usada para retirar a membrana (Pierce, Rockford, IL), com hibridização subsequente com um anticorpo primário e secundário diferente.
    5. Digitalizar os filmes de raios-X para o Adobe Photoshop 5.0.2. Realizar análise de densitometria utilizando o software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

II. Utilização de inibição de anticorpos em Análise Funcional

II.1. A co-transfecção de anticorposs usando o Chariot Protein entrega kit de reagentes

  1. Por mistura de reacção a transfecção, diluir wtNef 1 ug de DNA do plasmídeo-GFP e 1 ug de qualquer anticorpo anti-mortalin ou anticorpo anti-tubulina-α, para um volume final de 100 ul com 1X PBS. Nota: Foi encontrado anteriormente que a co-transfecção do anticorpo anti-α-tubulina tem nenhum efeito detectável sobre a secreção exNef e, portanto, funciona como um eficaz controlo negativo nestas experiências.
  2. Dilui-se 6 ml de Reagente Carruagem diluído para um volume final de 100 uL com água estéril, e combinar-se com a mistura de ADN-anticorpo diluído.
  3. Incubar à temperatura ambiente durante 30 min para permitir a formação da Carruagem / complexo DNA-anticorpo.
  4. Pellets de 3 x 10 5 células Jurkat por centrifugação a 600 xg durante 5 min.
  5. Lave as células duas vezes com 1X PBS, e ressuspender em Carruagem / complexo DNA-anticorpo.
  6. Adicionar 400 ul de soro de meio RPMI 1640 para a suspensão e incubar a cvaras em placas de cultura a 37 ° C durante 2 horas.
  7. Adicionar 1 ml de meio RPMI 1640 fresco contendo 10% de FBS a cada placa e incubar as células durante 48 horas a 37 ° C.

II.2. Nef-GFP fluorescente Secreção Leitor de Placas de ensaio de inibição de anticorpos

  1. Recolher os meios condicionados isentos de células a partir de células colhidas e transferir 100 ul às cavidades individuais de uma placa de microtitulação de 96 poços preta.
  2. Medida de fluorescência da GFP nos meios de comunicação em um GENEios fluorímetro Tecan com comprimento de onda de excitação de 485 nm e 515 nm de comprimento de onda de emissão em unidades fluorescentes relativos.
  3. Definir o nível de fluorescência da GFP no controlo (meio de células co-transfectadas com a Nef-GFP e o anticorpo anti-tubulina-α) a 100%.
  4. Compare-se com o nível de fluorescência da GFP nos meios das células co-transfectadas com o anticorpo anti-mortalin para determinar as alterações na secreção de Nef-GFP.

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Representative Results

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Mapeamento Motivos Biologicamente Funcionais utilizando péptidos. Duas regiões foram identificados nas proteínas Nef que induzem a apoptose. Apoptose Peptídeo orientado foi observada (Figura 2), começando com o péptido N50 (AA30-50), atingindo um máximo de N60 (AA40-60) e N70 (aa50-70), e para diminuir os níveis de base de péptido N100 (aa80-100). O principal motivo 1 (M1), pico, centrando-aa50-60, induz> 80% dos níveis de apoptóticos da proteína Nef de comprimento completo. Um segundo pico de apoptose, menor foi observada abrangendo peptídeos N180 (aa160-180) e N190 (AA170-190). Este motivo menor 2 (M2), pico, centrado em AA170-180, induz ~ 30% dos níveis de apoptose de comprimento completo da proteína Nef 16.

Análise de inibição competitiva utilizando péptidos. Na Figura 3, os péptidos que contêm um SMR intacta inibiu significativamente a secreção exNef. Isto era verdade se o motivo foi localizado no terminal N (WildtyPE-1) ou no meio (tipo selvagem-2) do péptido, ou foi repetido no péptido (tipo selvagem-3). Alternativamente, alanina-substituição de qualquer aminoácido do motivo, independentemente da posição do motivo ou o número no péptido, anulada a função do péptido 18. Uma 11-amino-ácido mexidos versão do Motivo apoptótica de Nef 1 (SM1), previamente descrito 14 e obtido a partir de Sigma Genosys, foi utilizado como um controlo negativo e não teve nenhum efeito sobre a secreção de exNef. Ver Tabela 1 para uma lista de seqüências peptídicas.

Isolando Motivo Partners ligação usando Peptídeos como isca. A Figura 4A mostra a co-imunoprecipitação de quatro proteínas pelo péptido SMRwt (60, 65, 75, e 250 kDa). O péptido SMRmut controlo negativo não capturar estas proteínas, e estas proteínas não interagem de forma não específica com a resina de afinidade, na ausência de péptido, sugerindo que as proteínas co-imunoprecipitadas foram interagindoespecificamente com os motivos do péptido SMR SMRwt. Estas proteínas foram subsequentemente identificados por MALDI-TOF de espectrometria de massa em tandem (ver figura 4B para uma amostra representativa), e verificado por análise de imunotransferência 18.

Utilização de inibição de anticorpos em análise funcional. Inibição com anticorpo anti-mortalin completamente abolida secreção exNef (Figura 5). Este confirmou que um Nef / mortalin interação intacto é necessária para a secreção exNef. Além disso, sugere fortemente que o mecanismo pelo qual o péptido SMRwt inibe a secreção exNef é através da ruptura desta interacção por competição directa para mortalin 18.

Tabela 1
Tabela 1. Painel de péptidos SMR desenvolvidos e testados quanto ao seu efeito sobre a secreção de exNef Nef-induzida. Essa guiale foi originalmente publicado em Shelton et al., JVI, 18, ​​2012. Em estudos anteriores, a alanina-substituição de aminoácidos únicos do motivo SMR significativamente reduzida ou abolida, a secreção induzida por Nef 18. Vírus isolado de um nonprogressor longo prazo expressa uma variante de Nef com uma isoleucina no lugar do V66;. Uma das poucas variações ocorridas no altamente conservada SMR motivo 20 Clique aqui para ampliar a tabela .

Figura 1
Figura 1. Efeitos da exossomos Nef nas principais tipos de células do sistema imunológico. Este modelo exibe exNef liberado a partir de células infectadas, e seus efeitos sobre as células monócitos e células linfocitárias que levariam a AIDS previstopatogênese. AICD, a ativação da morte celular induzida. I. Infected célula versões do vírus, exosomes normais, e exNef. exNef ativa inativos, monócitos infectados (B). A ativação dos monócitos (C) resulta em mudanças na expressão dos genes que levam a aumentos no estado inflamatório e resultar em ativação e exaustão de CD4 + e células T CD8 +. II. Infected célula lançamentos de vírus, exosomes normais, e exNef. exNef activa não activados, os linfócitos não infectados (D). Os linfócitos ativados (E) sofrer alterações de expressão de genes que resultam em aicd resultando em um celular por apoptose (F). Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 2
Figura 2. Peptídeoe análise da proteína Nef do HIV-1 padrão de apoptose (s) de digitalização. Um conjunto de péptidos 20-mer, cada um com 10 sobreposição de aminoácidos, que abrangem os 205 aminoácidos da proteína Nef knfs, foi obtido a partir do Programa Reagente de SIDA e usado no mapeamento dos domínios apoptóticos Nef. Esta figura foi originalmente publicado em Huang et al., JVI, 2004 13. O eixo Y mostra a percentagem de células que são rotulados de TUNEL, e o eixo X indica a condição de tratamento. Proteína Nef completa [Nef], células não tratadas [UT], ou a partir dos péptidos com aa1-20 [N20], e terminando com AA190-205 [N205]. As barras de erro indicam o erro padrão de medição, e os resultados são uma compilação de pelo menos 3 experiências independentes. Os picos de apoptose são identificados por um motivo e Motif 2.

Figura 3
Figura 3. Péptido SMRwt inibe exNef. Péptidos contendoum ou mais de tipo selvagem Nef SMR motivos de sequências inibiu a secreção de exNef, enquanto que a alanina-substituição de qualquer ácido animo desta região muito reduzida eficácia do péptido. Esta figura foi originalmente publicado em Shelton et al., JVI, 15, 2012. Os meios de cultura a partir de células T Jurkat, co-transfectadas com um clone de Nef-GFP e vários péptidos SMR, foram ensaiadas quanto à secreção exNef. A quantidade de fluorescência da GFP medidos é equivalente à quantidade de exNef-GFP no meio extracelular. A significância estatística foi determinada utilizando um teste t não pareado. O efeito sobre a secreção de exNef vários péptidos foi comparada com a de uma forma aleatória mexidos péptido de controlo (SM1, * p <0,05; ** valor de p <0,01, *** p <0,001).

Figura 4
Figura 4. O péptido SMRwt interage especificamente com proteínas da célula hospedeira, incluindo mor talina. (A), proteínas de células T de Jurkat foram co-imunoprecipitados com o SMRwt ou péptidos SMRmut utilizando resina de afinidade de anticorpo acoplado M2 Anti-Flag. Note-se que tanto SMRwt e SMRmut usados ​​aqui têm uma sequência de marcador FLAG incorporados nos péptidos. Esta figura foi originalmente publicado em Shelton et al., JVI, 201.215. Este procedimento foi repetido na ausência de péptido quer como um controlo para as interacções não específicas com a resina de afinidade. O gel corado com azul de Coomassie ilustrado mostra proteínas com pesos moleculares de 60, 65, 75 e 250 kDa (setas) puxado para baixo por SMRwt que não foram puxados para baixo pelo péptido SMRmut com ou sem péptido. (B) A banda de 75 kDa foi excisada a partir do gel, digeridas com tripsina e analisada por MALDI-TOF de espectrometria de massa em tandem. O MS / MS Ion Pesquisa identificou os 75-kDa como mortalin. Setas indicam as seqüências dos peptídeos correspondentes.large.jpg "target =" _blank "> Clique aqui para ver maior figura

Figura 5
Figura 5. Mortalin blocos de inibição da secreção de anticorpos. Exossomo meios de cultura extracelulares a partir de células de Jurkat, co-transfectadas com um clone de Nef-GFP e os anticorpos contra ambos mortalin α ou tubulina, foram ensaiadas quanto à secreção exNef. Quando comparado com o efeito de um anticorpo contra uma proteína não envolvidas na secreção exNef (α-tubulina), perturbações da actividade da mortalin por seu anticorpo resultou na abolição completa da secreção exNef. A significância estatística foi determinada pelo teste t não emparelhado de secreção comparando exNef na presença do anticorpo contra o anticorpo mortalin α-tubulina (*** p <0,001). Esta figura foi originalmente publicado em Shelton et al., JVI, 18, ​​2012.

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Discussion

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A compreensão dos mecanismos subjacentes à capacidade da Nef manipular o caminho de tráfico exosomal será útil em inibidores da secreção exNef novos engenharia. A inibição da secreção exNef deve diminuir a depleção de células T CD4 e CIA que patogênese unidade HIV / AIDS. Para atingir este objetivo, temos desenvolvido uma série de novos reagentes e metodologias que nos permitiu analisar a genética da secreção exNef, e começar a determinar as proteínas celulares envolvidas. Esta abordagem também levou ao desenvolvimento do primeiro inibidor para visar directamente exNef secreção, o péptido SMRwt.

A principal conclusão do nosso trabalho é que os péptidos curtos derivados de motivos específicos encontrados em proteínas de comprimento total, no nosso caso o HIV-1 Nef, não só mantêm a sua função biológica, mas também pode inibir competitivamente a função da proteína de comprimento completo. Porque estes péptidos reter a sua função biológica, elas podem ser usadas para identificar domínios funcionaisna proteína de comprimento completo. Duas coisas são requeridas: a geração de péptidos que varrem a proteína de interesse, ou toda a sua extensão ou a uma região da proteína que contenha o domínio funcional, e um ensaio para testar a função biológica em questão. Uma vez que não dispunha de informações que permitem estreitar nossa busca por motivos de indução de apoptose em regiões específicas de Nef, foi utilizado um conjunto de peptídeos de digitalização de todo o seu comprimento. Embora este processo foi facilitada pela dimensão da Nef relativamente pequeno, nós também ter aplicado esta abordagem para maiores (> 75 kDa) proteínas. Um ensaio bem estabelecido para medir a apoptose (TUNEL) foi utilizada para identificar péptidos que retêm a função biológica de interesse, neste caso, a apoptose induzida por Nef de células T CD4. Curiosamente, a análise subsequente no papel inicial demonstrou que os péptidos identificados apoptóticos retida> 80% da actividade biológica da proteína Nef de comprimento completo, e inibiu competitivamente CXCR4 vinculativodo seu ligando natural SDF-1α.

Do mesmo modo, um péptido curto que contém o motivo de SMR Nef manteve a sua capacidade biológica para interagir com proteínas celulares envolvidas na secreção exNef. No entanto, neste exemplo, a retenção de actividade não conduziu a mímica de uma função de Nef, como era o caso com a indução de apoptose, mas em vez conduziu à inibição. Porque o peptídeo SMRwt efetivamente ligado os sites SMR de ligação destas proteínas celulares, que interrompeu suas interações com Nef e, conseqüentemente, impediu a secreção de Nef em exossomos. À medida que o padrão de Nef de interesse era conhecido a partir de estudos de mapeamento genético anteriores, nós fomos capazes de limitar o desenvolvimento de péptidos para as variações do SMR. Em vez de identificar novos motivos funcionais, usamos esses peptídeos, e um ensaio baseado em fluorescência previamente desenvolvido para medir a secreção exNef, para demonstrar que o papel do SMR na secreção exNef estava ligada diretamente à sua seqüência primária específica.

HIV-1, Human Protein Interaction banco de dados lista de mais de 60 proteínas celulares que interagem diretamente com Nef e possivelmente até 200 que interagem direta ou indiretamente, 19. Ao restringir a seqüência de nossa proteína isca para o motivo de interesse, evitamos ter que classificar através das dezenas de proteínas que teria sido co-imunoprecipitados pela proteína Nef de corpo inteiro. A maior parte destas proteínas, embora específicos para Nef, não seria parceiros de ligação do SMR para Nef, e constituiria, assim, do fundo / ruído. Um cálculo conservadora é de que o ruído reduzido através de 15x (60/4). Em essência, a nossa abordagem efetivamente aumentou a relação sinal-ruído, minimizando o fundo devido a off-site, ou no nosso caso, de ligação fora do motivo, o que nos permite identify proteínas que se ligam especificamente a SMR. No entanto, é possível que, usando este método, têm falhado para capturar todas as proteínas celulares SMR de ligação, especialmente aqueles que requerem interacção tanto com o SMR e um segundo motivo de se ligar a Nef, ou aqueles cuja ligação é dependente ou secundária estrutura terciária.

Mortalin, uma proteína celular de co-imunoprecipitada pelo péptido SMRwt, foi demonstrado que a necessária para a secreção exNef por knockdown miRNA e inibição do anticorpo. A primeira é uma técnica bem estabelecida que reduz ou elimina a expressão da proteína alvo. Por outro lado, a inibição do anticorpo não afecta os níveis de expressão de proteínas, mas em vez disso inibem fisicamente a interacção da proteína alvo com outras proteínas. Usamos este segundo método para demonstrar a importância da interação Nef-mortalin para a secreção exNef. Inibição do anticorpo é um procedimento simples e direta que requer um método para a introdução do anticorpopara dentro da célula e com um ensaio para testar o seu efeito sobre a função biológica em questão. Usamos a Proteína Reagente Entrega Chariot para transporte de anticorpos anti-mortalin para dentro da célula, eo ensaio baseado em fluorescência acima mencionado para medir as mudanças na secreção de exNef. Como a maioria dos processos baseados em anticorpos, a eficácia da inibição de anticorpo é limitado pela afinidade e especificidade do anticorpo para a proteína alvo.

Um dos principais objetivos da pesquisa do HIV é o desenvolvimento de novas terapias ea identificação de potenciais alvos para a terapia. Os procedimentos aqui descritos alavancagem péptidos curtos específicos, que retêm a sua função biológica e podem inibir competitivamente a função das proteínas de comprimento total, a fim de acelerar o processo. Embora as experiências descritas eram dirigidas para a compreensão de uma tecla de função de HIV, as técnicas empregues devem ser aplicáveis ​​para o estudo das interacções proteína-proteína e o desenvolvimento de-base de péptidoinibidores em vários campos.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58.268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance subvenção GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA concessão F31AI091484, Emory CFAR concessão P30 A1050409. Esta investigação foi realizada em uma instalação construída com o apoio de centros de pesquisa Melhoria Grant # C06 RR18386 do NIH / NCRR. As células de Jurkat, o conjunto de 20 péptidos Nef, bem como o de coelho anti-HIV-1 Nef soro foram obtidos a partir do NIH AIDS Research & Programa Reagente de Referência, (Rockville, MD), de HIV-1.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20mer peptide set with 10 amino acid overlap NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 4641
TUNEL Assay Roche 11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent Active Motif 30100
Tecan GENEios fluorimeter (Tecan Group, Switzerland)
96-well black microtiter plate Corning 3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
Dynabeads Protein G magnetic beads Invitrogen 100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) Promega Corp., Madison, WI Z5332
C-18 ZipTip Millipore ZTC18S096 C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution
MALDI TOF/TOF Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF

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Identificação baseada em peptídeo de motivos funcionais e seus parceiros de ligação
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Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S., Johnson, K., Roth, W., Powell, M., Bond, V. Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners. J. Vis. Exp. (76), e50362, doi:10.3791/50362 (2013).More

Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S., Johnson, K., Roth, W., Powell, M., Bond, V. Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners. J. Vis. Exp. (76), e50362, doi:10.3791/50362 (2013).

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