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Immunology and Infection

La identificación basada en péptidos de motivos funcionales y sus parejas de unión

doi: 10.3791/50362 Published: June 30, 2013

Summary

Se describen técnicas para diseccionar los mecanismos que subyacen a la secreción de VIH-1 Nef en exosomas. Péptidos específicos cortos derivados de la proteína Nef y transfección fueron explotados para determinar la estructura, la función y las parejas de unión de la secreción Modificación Región de Nef. Estos procedimientos tienen importancia general en muchos estudios sobre el mecanismo.

Abstract

Péptidos específicos cortos derivados de motivos encontrados en proteínas de longitud completa, en nuestro caso el VIH-1 Nef, no sólo conservan su función biológica, pero también pueden inhibir competitivamente la función de la proteína de longitud completa. Un conjunto de 20 péptidos de escaneo Nef, 20 aminoácidos de longitud cada uno con superposición de 10 aminoácidos de su vecino, se utilizaron para identificar los motivos en Nef responsable de su inducción de la apoptosis. Los péptidos que contienen estos motivos apoptóticas inducidas la apoptosis en niveles comparables a la proteína Nef de longitud completa. Un segundo péptido, derivado de la región Modificación secreción (SMR) de Nef, retiene la capacidad de interactuar con las proteínas celulares implicados en la secreción de Nef en exosomas (exNef). Este péptido SMRwt se utilizó como la proteína "cebo" en experimentos de co-inmunoprecipitación para aislar las proteínas celulares que se unen específicamente al motivo SMR de Nef. Se utilizó la transfección y anticuerpos de inhibición de la proteína para alterar físicamente la apuesta interacciónween Nef y mortalin, una de las proteínas de unión a SMR aisladas, y el efecto se midió con un ensayo de secreción de exNef fluorescente basada. La capacidad del péptido SMRwt a outcompete Nef de longitud completa de proteínas celulares que se unen el motivo SMR, lo convierten en el primer inhibidor de la secreción exNef. Por lo tanto, mediante el empleo de las técnicas descritas aquí, que utilizan las propiedades únicas de los péptidos específicos cortos derivados de motivos encontrados en proteínas de longitud completa, se puede acelerar la identificación de motivos funcionales en las proteínas y el desarrollo de inhibidores basados ​​en péptidos de funciones patógenos.

Introduction

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Con el advenimiento de la terapia anti-retroviral, la epidemia de SIDA en el mundo occidental se ha ralentizado, pero no restringido, y la propagación del VIH continúa siendo una importante carga para la salud en todo el mundo. Con la excepción del ensayo marginalmente eficaces RV144 tailandés, vacunas contra el VIH han demostrado hasta ahora la falta de protección de la infección. Por lo tanto, la investigación de posibles dianas terapéuticas, otros todavía se justifica.

Junto con el agotamiento de células T CD4, la activación inmune generalizada persistente es un sello de la infección por VIH. Esta activación inmune crónica (CIA) conduce a un aumento de la renovación celular, las subpoblaciones linfocitarias activadas y diferenciada, el agotamiento y la senescencia celular y la muerte de las células T y las células B a través de la activación inducida por la muerte celular (AICD) 1,2,3, y se ha consolidado como uno de los más fuertes predictores de progresión de la enfermedad 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Sin embargo, los mecanismos subyacentes a la CIA y CD4El agotamiento de la infección por VIH de las células T aún no se han aclarado por completo.

La evidencia de nuestro laboratorio y otros nos condujo a un modelo para la progresión de la enfermedad (Figura 1) en el que la proteína Nef del VIH (factor regulador negativo) induce su secreción en exosomas de células infectadas por el VIH-1 13,14. Estos exosomas que contienen Nef (exNef) inducen la apoptosis en una serie de linajes de células incluyendo las células T CD4 no infectados 15,16. Alternativamente, en monocitos / macrófagos exNef altera los patrones de expresión génica, por ejemplo, la expresión de citoquinas, y parece inducir un estado de activación inmune no programada. Este cuerpo de evidencia sugiere un papel importante para exNef de la CIA y el agotamiento de las células T CD4.

La comprensión de los mecanismos que subyacen a la capacidad de Nef para manipular el tráfico de la vía exosomal será útil en la ingeniería de nuevos inhibidores de la secreción de exNef. La inhibición de la secreción de exNef debe disminuir el agotamiento de células T CD4y la CIA que patogénesis unidad de VIH / SIDA.

Para recopilar la evidencia que condujo a nuestro modelo de progresión de la enfermedad del VIH / SIDA y los datos posteriores que construyeron en este modelo, hemos desarrollado una serie de nuevos reactivos y metodologías que nos permitió analizar la genética de la secreción exNef, y comenzamos a determinar la proteínas celulares implicadas. En el trabajo inicial, se encontró que la proteína Nef induce la apoptosis en células espectadoras y se libera extracelularmente a partir de células transfectadas con y Nef del VIH-infectada 15. Los péptidos derivados de (células del estroma Derived Factor-1, con alfa corte y empalme alternativo) SDF-1α se había demostrado previamente para retener gran parte de la actividad de unión y la señalización de la molécula de longitud completa 17. Especulamos que los péptidos de Nef pueden retener parte de la actividad apoptótica de la proteína completa, y que estos péptidos serían necesariamente contener el dominio apoptótica Nef (s). Para identificar estos péptidos, y en consecuencia, la Nefdominio apoptótica (s), se obtiene un conjunto de 20 HIV-1 Nef péptidos de exploración del Programa de reactivos de referencia NIH Investigación y el SIDA. Estos péptidos 20-aa, cada una superposición de 10 aminoácidos de su vecino, se nombran por el número de su último aminoácido, es decir, N20 Nef se extiende por los aminoácidos 1-20, N30 abarca los aminoácidos Nef 11-30, 16, etc. Hemos encontrado que la exposición de células T a péptidos específicos extracelularmente superposición de dos dominios 10-aa distintas en la apoptosis inducida por la proteína Nef de longitud completa en estas células. El análisis posterior de estos péptidos apoptóticos Nef-derivados reveló su capacidad para interactuar físicamente con el receptor de quimiocinas CXCR4 en la superficie de las células T, con la cinética de unión que permitieron estos péptidos para inhibir competitivamente la unión entre el CXCR4 y su ligando natural SDF-1α. Finalmente, se encontró que la interacción de los péptidos apoptóticos Nef-derivados »con CXCR4 para inducir una respuesta de estrés en estas células T que conducen a la apoptosis. Esta evidencia nos permitió quicdominios funcionales de kly mapa Nef, un proceso que habría llevado mucho más tiempo utilizando técnicas mutagénicos de ADN estándar, tales como alanina mutagénesis de barrido. También mostró que estos péptidos cortos derivados de Nef-conservan la función biológica de los dominios apoptóticas en la proteína de longitud completa.

Después de haber definido el papel de Nef extracelular, es decir, la apoptosis de las células T, que buscó una mejor comprensión de cómo Nef se secreta a partir de las células. Utilizando una serie de construcciones Nef mutados, mapeamos altamente conservadas de proteínas Nef motivos en las regiones N-terminales de ambos Nef del VIH, y su macaco Rhesus equivalente SIV Mac ​​(virus de inmunodeficiencia simia) Nef, que son críticos para la secreción de exNef 13. Uno de estos motivos, la Región Modificación secreción (SMR; 66VGFPV70), fue particularmente crítico, como la sustitución de alanina cualquiera de sus cinco aminoácidos ya sea en gran medida reducido o abolido la secreción exNef. Cuando se suministra a las células a través de C de Active MotifHariot Proteína Reactivo de entrega, un péptido que contiene el SMR unido a una secuencia de péptido FLAG (SMRwt) fue encontrado para inhibir la secreción de exNef tanto Nef-transfectadas y células infectadas por VIH-18. En base a nuestra experiencia previa con péptidos, se decidió utilizar este péptido para dilucidar las moléculas y los mecanismos que subyacen a la función del Nef SMR en la secreción exNef.

Uso del péptido SMRwt como nuestro "proteína cebo", que co-immunoprecipitated parejas de unión celular de la SMR a partir de lisados ​​de células T no infectadas 18. La secuencia de péptido FLAG proporciona un mango conveniente para capturar el péptido SMRwt usando resina de afinidad anti-FLAG. La anterior conclusión de que una sola mutación de valina por alanina en el péptido SMRwt era suficiente para suprimir la inhibición de la secreción de exNef identificado un péptido control conveniente, altamente específico (SMRmut) que se utilizó para descartar las proteínas co-immunoprecipitated no específicos para el SMR. El uso de un péptido con la sdominio ESPECÍFICOS de interés en lugar de la proteína de longitud completa nos permitió pasar por alto la detección de decenas de factores celulares que se unen a otros dominios en Nef 19.

Una vez que se identificaron los socios SMR-unión, el siguiente paso lógico era mostrar que las parejas de unión celulares identificados son importantes para la función biológica 18. El procedimiento estándar de lograr esto es a los niveles de proteína desmontables utilizando los genes miARN objetivo o ARNsi específico de la proteína, y posteriormente se ensayo el efecto sobre la función biológica. Se realizó caída miARN, que inhibe la traducción del ARNm diana, la reducción de la producción de ese objetivo, en este caso una proteína de unión a SMR. Esta reducción de la proteína diana es un efecto indirecto, y posiblemente tiene un efecto retardado sobre la función biológica de la proteína objetivo juega un papel pulg Por consiguiente, también empleó la técnica menos común de la inhibición de anticuerpos para determinar si interrumpir directamente la actividad dela proteína diana reduce o elimina la función biológica. En este procedimiento, los anticuerpos producidos contra la proteína específica se transfectan en la célula usando Reactivo carro, e interactúan directamente con la proteína diana o bien secuestrante que desde su sitio de función, o el bloqueo de su dominio de unión relevante. La inhibición de la proteína diana a través de este procedimiento altera directamente su función, y puede complementar los procedimientos desmontables de ARN por confirmar aún más la importancia de la proteína diana a la función biológica.

Mientras carro de reactivos es eficaz en la entrega de péptidos y proteínas en las células; este proceso consume mucho tiempo y limita los tipos de experimentos, por ejemplo, la exposición prolongada o repetida y en estudios con animales in vivo que se puede realizar. En consecuencia, hemos añadido una secuencia de péptido de penetración celular (CPP) para el péptido SMRwt (SMRwt-CPP) 18 para generar un péptido que podría ser tomado por las células pasivamentede los medios de cultivo. Esta versión fue tan eficaz como la antigua en la inhibición de la secreción de exNef.

La evidencia de estos experimentos publicados demuestra la capacidad de pequeños péptidos que contienen motivos funcionales específicos para antagonizar la función de la proteína de longitud completa a través de la inhibición competitiva, y para aislar las proteínas que se unen a estos motivos. Uno esperaría que estas técnicas deben ser útiles en muchos protocolos experimentales. Ellos también deben ser eficaces en nuevos inhibidores peptídicos de ingeniería de muchos procesos celulares; una función que puede ser mejorada aún más mediante la unión a secuencias de CPP.

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Protocol

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I. El uso de péptidos cortos en Análisis Biológico

I.1. Asignación motivos biológicamente funcionales utilizando péptidos

  1. El tratamiento de las células con péptidos de escaneo Nef
    1. Adquirir un conjunto de péptidos de exploración de la región de interés. Para nuestros experimentos, péptidos 20mer, con 10 superposición de aminoácidos, que abarcan toda la proteína Nef del VIH-1 (205 aa), se obtuvieron a partir del Programa de reactivos de SIDA. Los péptidos se ensayaron individualmente de la siguiente manera:
    2. Añadir 10 ng / ml de péptido al medio de cultivo celular.
    3. Añadir 10 ml de medio de cultivo por placa de cultivos de células Jurkat.
    4. Incubar las culturas de 24 horas a 37 ° C.
  2. Ensayo de Terminal deoxynucleotidyltransferase mediada por dUTP Nick Fin Etiquetado de biotina (TUNEL) de la apoptosis
    1. Lavar las células con PBS 1X, y fijar, por 30 min a temperatura ambiente con paraformaldehído al 4% en PBS 1X, pH 7,4.
    2. Lavar con PBS 1X, y permeabilizar con 0,1% de Triton X-100 para 10min a temperatura ambiente.
    3. Lavar las células dos veces con PBS 1X.
    4. Contar las células teñidas por epifluorescencia en un sistema de microscopía controlado por ordenador.

I.2. Análisis de inhibición competitiva utilizando péptidos

  1. La co-transfección de los péptidos utilizando el Kit de Reactivo de Proteína de entrega carro
    1. Por mezcla de reacción de la transfección, se diluye 1 g de plásmido ADN wtNef-GFP y 100 ng de cualquiera de los péptidos derivados de tipo salvaje del dominio SMR, o péptidos que contienen alanina-sustitución de aminoácidos individuales en el motivo SMR, a un volumen final de 100 l con 1X PBS.
    2. Diluir 6 l de una dilución de carro Reactivo 1/10 a un volumen final de 100 l con agua estéril, y se combinan con la mezcla de ADN-péptido diluido.
    3. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min para permitir la formación del Carro / complejo de ADN-péptido.
    4. Pellet 3 x 10 5 células Jurkat por centrifugación a 600 xg durante 5 min.
    5. Lavar las células dos veces con PBS 1X, y volver a suspender en el complejo de carro / ADN-péptido.
    6. Añadir 400 l de suero libre de medio RPMI 1640 a la suspensión y se incuban las células en placas de cultivo a 37 ° C durante 2 horas.
    7. Añadir 1 ml de medio RPMI 1640 fresco que contiene 10% de FBS a cada placa, y se incuban las células durante 48 horas a 37 ° C.
    8. Células de la cosecha y determinar la eficacia de transfección mediante microscopía de fluorescencia.
  2. Nef-GFP secreción fluorescente lector de placas de ensayo de inhibición de péptido
    1. Recoger los medios libres de células acondicionado de las células recogidas, y transferir 100 l a pocillos individuales de una placa de microtitulación de 96 pocillos negro.
    2. Medir la fluorescencia de GFP en los medios de comunicación en un fluorímetro GENEios Tecan con longitud de onda de excitación 485 nm y 515 nm de longitud de onda de emisión de las unidades fluorescentes relativas.
    3. Establecer el nivel de fluorescencia de GFP en el control (medios de las células co-transfectadas con Nef-GFP y un péptido revueltos) A 100%.
    4. Compárese esto con el nivel de la fluorescencia de GFP en los medios de comunicación de las células co-transfectadas con diversos péptidos SMR para determinar los cambios en la secreción de Nef-GFP.

I.3. Aislar Motif parejas de unión utilizando péptidos como cebo

  1. Co-inmunoprecipitación con péptidos SMR
    1. Se cultivan las células Jurkat en medio RPMI 1640 que contiene 10% de SFB a 37 ° C en un matraz de cultivo tisular T-75, y precipitar las células por centrifugación a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. Determinar la eficacia de la transfección, mediante la colocación de la placa bajo un microscopio de fluorescencia, la captura de imágenes, y, posteriormente, contar las células totales y etiquetados y determinar las células marcadas por ciento.
    2. Resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS 1X, y transferirlo a un tubo Eppendorf de 1,5 ml. Microcentrífuga a 1000 xg durante 1 min. Resuspender el precipitado en 1 ml de α-FLAG tampón de lisis por pipeteo suave. Tampón de lisis: Mezcla de 50 mM de Tris • HCl, pH 7,4, 150 mM de sodio CHLoride [NaCl], 1 mM de EDTA, y 1% de Triton X-100, con 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo [PMSF], y 10 l / ml de inhibidor de la proteasa Cocktail para su uso con células de mamíferos y extractos de tejido [PIC; Sigma]. Haga inmediatamente antes de usar.
    3. Diferencialmente microcentrífuga de las suspensiones a 2000 xg durante 5 min, y a 13.000 xg durante 10 min para sedimentar los restos celulares y el ADN, respectivamente. Recoger el sobrenadante (denominado en lo sucesivo como el "lisado").
    4. Añadir 1 mg de proteína de lisado y 1 g de ya sea la SMRwt o péptido SMRmut a 20 l de anti-FLAG M2 Affinity Gel (en adelante denominado "resina", Sigma). Tenga en cuenta que tanto SMRwt y SMRmut usada aquí tienen una secuencia de etiqueta FLAG incrustado en los péptidos. Llevar la mezcla a un volumen final de 1 ml en tampón de Co-IP (α-FLAG tampón de lisis menos PMSF y PIC). Incubar la mezcla a 4 ° C durante la noche con rotación de extremo a extremo. Como control negativo, incubar el lisado con la resina en ausencia de cualquiera de péptido.
    5. Pellet la resina por microcentrifugación a 5000 - 8000 xg durante 30 seg. Permitir que la resina se asiente durante 2 min antes de manipular la muestra y a continuación, aspirar el sobrenadante. Eliminar el sobrenadante con una pipeta de punta estrecha final, o en una jeringa Hamilton, teniendo cuidado de no transferir ninguna resina. Estrecha gama puntas de pipeta se pueden hacer usando fórceps para pellizcar la apertura de una punta de pipeta de plástico hasta que se cierra parcialmente. La resina se lava cuatro veces con 500 l de tampón de lavado (50 mM de Tris • HCl, pH 7,4, y 150 mM de NaCl). Se eluye las proteínas celulares enlazados con 15 g de péptido FLAG 3X (Sigma) en 50 l de tampón de lavado y se incuba en eje de balancín / agitador durante 30 min a temperatura ambiente.
    6. Concentrar los eluatos por precipitación con acetona, seguido por ebullición en tampón de muestra de Laemmli (Bio-Rad). Separar las proteínas mediante SDS-PAGE en un 4-20% Tris-HCl Criterio prefabricados de gel (Bio-Rad). Teñir el gel con azul brillante de Coomassie R-250 (Bio-Rad). Nota: para los experimentos de identificación de espectrometría de masas (
  2. Co-inmunoprecipitación con proteína Nef-GFP
    1. Mezclar 50 l de Dynabeads proteína G perlas magnéticas (Invitrogen) con 2 g de anti-GFP monoclonal murino en 1 ml de 1X PBS con 0,02% de Tween 20 (PBS-T). Incubar la mezcla con rotación de extremo a extremo en un tubo Eppendorf de 1,5 ml durante 1 hora a 4 ° C.
    2. Se separan las perlas de la memoria intermedia colocando el tubo en un 1,5-ml Magnasphere Tecnología soporte separación magnética (Promega Corp., Madison, WI) que permite desplegable magnética seguido de la eliminación del sobrenadante. Lavar las perlas recubiertas con anti-GFP con 1 ml de PBS-T mediante pipeteo suave.
    3. Lisar las células Jurkat transfectadas Nef-GFP con 1 ml de 1X tampón RIPA + por pipeteo suave y una incubación de 15 men el hielo. + Tampón RIPA: 10X tampón de lisis RIPA, pH 7,4 [Millipore, Bedford, MA] 1:10 diluido en agua estéril, 0.02% azida de sodio [Sigma], y 0,1% de dodecil sulfato sódico [SDS], con 1 mM de PMSF y 10 l / ml PIC añadió inmediatamente antes de usar.
    4. Se precipitan los desechos de células por microcentrifugación a 2000 xg durante 10 min. Recoger el sobrenadante (denominado en lo sucesivo como el "lisado").
    5. Añadir 1 mg de proteína de lisado a las perlas recubiertas con anti-GFP, llevar el volumen final a 1 ml con 1X + tampón RIPA, y se incuba la mezcla con rotación de extremo a extremo durante 1 hora a 4 ° C. Nota: Para los estudios de competición de péptidos, 1 mg de proteína de lisado puede ser pre-incubó con 2 g de SMRwt SMRmut o péptido en 1 ml de 1X tampón RIPA +, antes de ser añadido a las perlas recubiertas con anti-GFP.
    6. Lavar las perlas a través de resuspensión en 1 ml de tampón de lavado (50 mM de Tris • HCl, pH 7,4, 150 mM de NaCl, y 0,1% de Tween 20). Incubar con rotación de extremo a extremo durante 5 min a 4 ° C. Separe las perlas fesde el lavado con el soporte de separación magnética. Lavar las perlas de una segunda y tercera vez con tampones de lavado que contenían 250 mM y 300 mM de NaCl, respectivamente.
    7. Resuspender las perlas en 200 l de PBS, transferir la mezcla a un tubo limpio, y separar las perlas de la colada en el soporte magnético. Hervir las perlas en 50 l de tampón de muestra Laemmli 5 min a 95 ° C, dejar que la mezcla se enfríe durante 10 min a temperatura ambiente, y a continuación, colocar la mezcla en el soporte magnético para la separación, y recoger los sobrenadantes ("eluidos") .
    8. Separar las proteínas del eluato mediante SDS-PAGE en un gel de Tris-HCl prefabricado Criterio 8-16%.
  3. La espectrometría de masas
    1. Impuestos Especiales de las bandas de proteína de interés a partir de geles teñidos con Coomassie.
    2. Reducir las muestras en 10 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT) durante 45 min a 37 ° C.
    3. Se alquila el muestras en yodoacetamida 55 mM durante 45 min a 25 ° C.
    4. Recopilación de las muestras durante la noche con la secuenciación intento de gradopsin (Promega) a 37 ° C.
    5. Desalar los péptidos de la muestra con C-18 ZipTip (Millipore). Mezclar los péptidos de muestra con alfa-CHC Matriz (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), y ellos detectar a un objetivo MTP marco III (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA).
    6. Realizar tandem asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo laser análisis de espectrometría de masas (MALDI-TOF/TOF) utilizando un Bruker Daltonics ultraflex III TOF / TOF.
    7. Comparar los datos de MS / MS a las bases de datos no redundantes y Swiss-Prot NCBI utilizando el algoritmo de la mascota ( www.matrixscience.com ).
  4. El análisis por inmunotransferencia
    1. Se separan las muestras de proteínas por SDS-PAGE al 4-20% o 8-16% Tris-HCl Criterio prefabricados de geles (Bio-Rad). Transferencia de las bandas de electroforesis a una membrana de nitrocelulosa.
    2. Lavar la membrana en solución salina amortiguadora Tris (TBS; Bio-Rad) durante 5 min. Bloque con 5% de leche descremada en TTBS (TBS con 0,1% de Tween 20) durante 1 hora agitando a temperatura ambiente.
    3. Procesar la membrana para inmunotransferencia usando un anticuerpo primario específico en 5% de leche sin grasa con agitación a 4 ° C durante la noche. Lavar en TTBS durante 20 min seguido de un conjugado de anticuerpos IgG HRP secundaria (H + L) en 5% de leche descremada durante 1 hora a temperatura ambiente. Lave en TTBS durante 30-60 min.
    4. Detectar las bandas de proteínas por Western Blot reactivo Luminol (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Exponer el filtro a la película fotográfica. Nota: En algunos experimentos, se utilizó un reactivo de separación para despojar a la membrana (Pierce, Rockford, IL) con la subsiguiente hibridación con un anticuerpo primario y secundario diferente.
    5. Escanear las películas de rayos X en Adobe Photoshop 5.0.2. Realizar un análisis de densitometría usando software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

II. El uso de anticuerpos de inhibición en Análisis Funcional

II.1. La co-transfección de anticuerposs utilizando el Protein Kit Reactivo de entrega carro

  1. Por mezcla de reacción de la transfección, se diluye 1 g de plásmido ADN wtNef-GFP y 1 g de cualquiera de anticuerpo anti-mortalin o anti-α-tubulina anticuerpo, a un volumen final de 100 l con 1X PBS. Nota: Se ha encontrado previamente que la co-transfección del anticuerpo anti-α-tubulina no tiene ningún efecto detectable sobre la secreción de exNef, y por lo tanto, sirve como un control negativo eficaz en estos experimentos.
  2. Diluir 6 l de Reactivo carro sin diluir a un volumen final de 100 l con agua estéril, y se combinan con la mezcla de ADN-anticuerpo diluido.
  3. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min para permitir la formación del Carro / complejo de ADN-anticuerpo.
  4. Pellet 3 x 10 5 células Jurkat por centrifugación a 600 xg durante 5 min.
  5. Lavar las células dos veces con PBS 1X, y volver a suspender en el Carro / complejo de ADN-anticuerpo.
  6. Añadir 400 l de suero libre de medio RPMI 1640 a la suspensión y se incuba la cells en placas de cultivo a 37 ° C durante 2 horas.
  7. Añadir 1 ml de medio RPMI 1640 fresco que contiene 10% de FBS a cada placa, y se incuban las células durante 48 horas a 37 ° C.

II.2. Nef-GFP secreción fluorescente lector de placa de ensayo de anticuerpos de inhibición

  1. Recoger los medios libres de células acondicionado de las células recogidas, y transferir 100 l a pocillos individuales de una placa de microtitulación de 96 pocillos negro.
  2. Medir la fluorescencia de GFP en los medios de comunicación en un fluorímetro GENEios Tecan con longitud de onda de excitación 485 nm y 515 nm de longitud de onda de emisión de las unidades fluorescentes relativas.
  3. Establecer el nivel de fluorescencia de GFP en el control (medios de las células co-transfectadas con Nef-GFP y anti-α-tubulina anticuerpo) a 100%.
  4. Compárese esto con el nivel de la fluorescencia de GFP en los medios de comunicación de las células co-transfectadas con el anticuerpo anti-mortalin para determinar los cambios en la secreción de Nef-GFP.

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Representative Results

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Mapeo de Motivos biológicamente funcional utilizando péptidos. Dos regiones se identificaron en las proteínas Nef que inducen la apoptosis. Péptido la apoptosis impulsada se observó (Figura 2) comienzo con el péptido N50 (AA30-50), alcanzando un máximo de N60 (AA40-60) y N70 (AA50-70), y la disminución de los niveles de fondo en péptido N100 (AA80-100). El principal motivo 1 (M1) pico, centrado en AA50-60, induce> 80% de los niveles de apoptosis de la proteína Nef de longitud completa. Se observó un segundo pico, más pequeño apoptótica abarca péptidos N180 (AA160-180) y la N190 (AA170-190). Esta menor del adorno 2 (M2) pico, centrado en AA170-180, induce ~ 30% de los niveles de apoptosis de la proteína Nef de longitud completa 16.

Análisis de inhibición competitiva utilizando péptidos. En la Figura 3, los péptidos que contienen un SMR intacto inhibió significativamente la secreción de exNef. Esto fue cierto tanto si el motivo se encuentra en el extremo N-terminal (Wildtype-1) o medio (Wildtype-2) del péptido o se duplicó en el péptido (Wildtype-3). Alternativamente, alanina-sustitución de cualquier aminoácido del motivo, con independencia de la posición o el número del motivo en el péptido, abrogó la función del péptido 18. Una-ácido 11-amino revueltos versión de adorno apoptótica de Nef 1 (SM1), descrito previamente 14 y obtenido de Sigma Genosys, se utilizó como control negativo y no tuvo efecto sobre la secreción de exNef. Ver Tabla 1 para obtener una lista de las secuencias de péptidos.

Aislar Motif parejas de unión utilizando péptidos como cebo. La Figura 4A demuestra la co-inmunoprecipitación de cuatro proteínas por el péptido SMRwt (60, 65, 75, y 250 kDa). El péptido SMRmut control negativo no capturar estas proteínas, y estas proteínas no interaccionan de forma no específica con la resina de afinidad en ausencia de péptido, lo que sugiere que las proteínas inmunoprecipitadas se co-interactuandoespecíficamente los motivos SMR del péptido SMRwt. Estas proteínas fueron posteriormente identificados por MALDI-TOF espectrometría de masas en tándem (véase la figura 4B para una muestra representativa), y verificados por el análisis de inmunoblot 18.

El uso de anticuerpos de inhibición en Análisis Funcional. Inhibición con anticuerpos anti-mortalin completamente abolido la secreción exNef (Figura 5). Esto confirmó que se requiere una interacción Nef / mortalin intacta para la secreción exNef. Además, se sugiere fuertemente que el mecanismo por el cual el péptido inhibe la secreción de SMRwt exNef es a través de la interrupción de esta interacción por la competencia directa para mortalin 18.

Tabla 1
Tabla 1. Panel de péptidos SMR desarrollado y probado por su efecto sobre la secreción de exNef Nef-inducida. Esta pestañale fue originalmente publicado en Shelton et al., IMV, 2012 18. En estudios previos, alanina-sustitución de aminoácidos individuales del motivo SMR reduce significativamente, o abolida, la secreción inducida por Nef 18. El virus aislado de un no-progresor largo plazo expresó una variante de Nef por una isoleucina en lugar de V66,. Una de las pocas variaciones reportadas en el motivo SMR altamente conservada 20 Haga clic aquí para ver la tabla más grande .

Figura 1
Figura 1. Efectos de exosomas Nef sobre los principales tipos de células inmunes. Este modelo muestra exNef liberado de las células infectadas, y sus efectos en las células monocitos y células linfocitarias que conducirían al SIDA predijeronpatogénesis. AICD, la muerte celular inducida por la activación. I. Infected virus de célula lanzamientos, exosomas normales y exNef. exNef activa no activados, monocitos no infectados (B). La activación de los monocitos (C) resulta en cambios en la expresión génica que conducen a aumentos en el estado inflamatorio y el resultado en la activación y el agotamiento de las células CD4 + y CD8 + T-células. II. Virus infectó células comunicados, exosomas normales, y exNef. exNef activa, los linfocitos no infectados no activados (D). Los linfocitos activados (E) se someten a cambios de expresión génica que dan lugar a la AICD que resulta en una célula apoptótica (F). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

La figura 2
Figura 2. Peptide escaneo análisis de la proteína Nef del VIH-1 para motivo apoptótica (s). Un conjunto de péptidos 20mer, cada uno con 10 superposición de aminoácidos, que abarcan los aminoácidos 205 de la proteína Nef KNFS, se obtuvo de la Programa de reactivos de SIDA y utiliza en la cartografía de los dominios apoptóticas Nef. Esta cifra fue publicado originalmente en Huang et al., IMV, 2004 13. El eje Y muestra el porcentaje de células que se TUNEL etiquetados, y el eje X indica la condición de tratamiento. Proteína completa Nef [Nef], las células no tratadas [UT], o los péptidos que comienzan con aa1-20 [N20], y terminando con AA190-205 [N205]. Las barras de error indican el error estándar de medición, y los resultados son una recopilación de al menos 3 experimentos independientes. Los picos de apoptosis se denotan por motivos 1 y 2 del adorno.

Figura 3
Figura 3. SMRwt péptido inhibe exNef. Péptidos que contienenuno o más de tipo salvaje Nef SMR motivos de secuencia inhibieron la secreción de exNef, mientras alanina-sustitución de cualquier ácido animo de esta región reduce en gran medida la eficacia del péptido. Esta cifra fue publicado originalmente en Shelton et al., IMV, 2012 15. Los medios de cultivo de células Jurkat T, co-transfectadas con un clon de Nef-GFP y diversos péptidos SMR, se ensayaron para determinar la secreción de exNef. La cantidad de GFP se midió la fluorescencia es equivalente a la cantidad de exNef-GFP en los medios extracelulares. La significación estadística se determinó usando una prueba t no pareada. El efecto sobre la secreción de exNef de diversos péptidos se comparó con la de un péptido de control al azar revueltos (SM1; * valor de p <0,05; ** valor de p <0,01; *** valor p <0,001).

Figura 4
La Figura 4. El péptido SMRwt interactúa específicamente con proteínas de células huésped, incluyendo mor talina. (A) Las proteínas de las células T Jurkat fueron co-inmunoprecipitaron con ya sea la SMRwt o péptidos SMRmut usando resina de afinidad de anticuerpo acoplado a anti-FLAG M2. Tenga en cuenta que tanto SMRwt y SMRmut usada aquí tienen una secuencia de etiqueta FLAG incrustado en los péptidos. Esta cifra fue publicado originalmente en Shelton et al., IMV, 201215. Este procedimiento se repitió en ausencia de péptido ya sea como un control para las interacciones no específicas con la resina de afinidad. La tinción con azul de gel teñido foto muestra las proteínas con pesos moleculares de 60, 65, 75 y 250 kDa (puntas de flecha) tirados por SMRwt que no se bajó por el péptido SMRmut o sin péptido. (B) La banda de 75 kDa se escindió del gel, digerido con tripsina, y se analizaron por MALDI-TOF espectrometría de masas en tándem. La MS / MS Ion búsqueda identificó 75-kDa como mortalin. Las flechas indican las secuencias de los péptidos que coincidan.large.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande la figura

La figura 5
Figura 5. Mortalin bloques de anticuerpos de inhibición de la secreción de exosoma. Medios de cultivo extracelulares a partir de células Jurkat, co-transfectadas con un clon de Nef-GFP y anticuerpos contra cualquiera de mortalin o α-tubulina, se ensayaron para determinar la secreción de exNef. Cuando se compara con el efecto de un anticuerpo contra una proteína que no participan en la secreción de exNef (α-tubulina), la interrupción de la actividad de mortalin por su anticuerpo dio lugar a la abolición completa de la secreción de exNef. La significación estadística se determinó mediante la prueba t no pareada comparando la secreción exNef en presencia del anticuerpo contra el anticuerpo mortalin α-tubulina (*** valor p <0,001). Esta cifra fue publicado originalmente en Shelton et al., IMV, 2012 18.

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Discussion

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La comprensión de los mecanismos que subyacen a la capacidad de Nef para manipular el tráfico de la vía exosomal será útil en la ingeniería de nuevos inhibidores de la secreción de exNef. La inhibición de la secreción de exNef debe disminuir el agotamiento de células T CD4 y la CIA que patogénesis unidad de VIH / SIDA. Para lograr este objetivo, hemos desarrollado una serie de nuevos reactivos y metodologías que nos permitió analizar la genética de la secreción exNef, y comenzamos a determinar las proteínas celulares implicadas. Este enfoque también condujo al desarrollo de la primera inhibidor para apuntar directamente la secreción de exNef, el péptido SMRwt.

Un hallazgo clave de nuestro trabajo es que los péptidos cortos específicos derivados de motivos se encuentran en las proteínas de larga duración, en nuestro caso del VIH-1 Nef, no sólo conservan su función biológica, sino que también puede inhibir competitivamente la función de la proteína de longitud completa. Debido a que estos péptidos conservan su función biológica, que se pueden utilizar para identificar dominios funcionalesen la proteína de longitud completa. Se requieren dos cosas: la generación de péptidos que escanean la proteína de interés, ya sea de toda su longitud o una región de la proteína cree que contiene el dominio funcional, y un ensayo para probar la función biológica en cuestión. Dado que carecía de información que nos permita limitamos nuestra búsqueda de motivos que inducen apoptosis en regiones específicas del Nef, se utilizó un conjunto de péptidos de digitalización de toda su longitud. Si bien este proceso se hace más simple por tamaño relativamente pequeño de Nef, también hemos aplicado este enfoque a más grandes (> 75 kDa), las proteínas. Un ensayo bien establecido para la medición de la apoptosis (TUNEL) se empleó para identificar péptidos que retienen la función biológica de interés, en este caso, la apoptosis inducida por Nef de las células T CD4. Curiosamente, el análisis posterior en el documento original demostró que los péptidos identificados apoptóticas retenidos> 80% de la actividad biológica de la proteína Nef de longitud completa, y competitivamente inhibida CXCR4 vinculantede su ligando natural SDF-1α.

Del mismo modo, un péptido corto que contiene el motivo SMR de Nef conservó su capacidad biológica de interactuar con las proteínas celulares implicadas en la secreción exNef. Sin embargo, en este ejemplo la retención de la actividad no condujo a imitación de una función Nef, como fue el caso con la inducción de la apoptosis, pero en lugar llevó a la inhibición. Debido a que el péptido SMRwt obligado efectivamente los sitios SMR de unión de estas proteínas celulares, que interrumpe sus interacciones con Nef, y, en consecuencia, impide la secreción de Nef en exosomas. Como el motivo Nef de interés se conoce a partir de estudios de mapeo genético anteriores, hemos sido capaces de limitar el desarrollo de péptidos a las variaciones de la SMR. En lugar de identificar nuevos motivos funcionales, hemos utilizado estos péptidos, y un ensayo basado en la fluorescencia desarrollado previamente para medir la secreción exNef, para demostrar que el papel del SMR en la secreción exNef estaba vinculada directamente a su secuencia primaria específica.

el VIH-1, Interacción Human Protein Base de datos listas de más de 60 proteínas celulares que interactúan directamente con Nef y, posiblemente, como muchos como 200 que interactúan directamente o indirectamente 19. Al restringir la secuencia de de nuestra cebo de proteína a la con motivos de interés, nos evitar tener que ordenar a a través de los docenas de proteínas que habría sido co-inmunoprecipitadas por la proteína de Nef-de longitud completa. El mayoría de los estas proteínas, mientras que específico para Nef, no sería parejas de unión para SMR de Nef, y por lo tanto constituiría de fondo / ruido. Un cálculo conservadora es que redujimos el ruido por 15x (60/4). En esencia, nuestro enfoque aumentó manera efectiva la relación de señal-to-noise, reduciendo al mínimo de fondo debido a off-sitio, o en nuestro caso off-motivo de unión a, lo que nos permite identify proteínas que se unen específicamente la SMR. Sin embargo, es posible que, mediante el uso de este método, hemos fallado para capturar todas las proteínas celulares SMR-vinculantes, particularmente aquellas que requieren la interacción con tanto la SMR y un segunda con motivos de obligar a Nef, o aquellos cuya vinculante es dependiente de secundaria o estructura terciaria.

Mortalin, una proteína celular co-immunoprecipitated por el péptido SMRwt, fue demostrado ser necesarios para la secreción exNef por desmontables los genes miARN y la inhibición anticuerpo. El el ex es una técnica bien-establecido de que reduce o elimina expresión de la proteína apuntado. A la inversa, la inhibición anticuerpo no afecta los niveles de expresión de proteínas, pero en su lugar inhibe la físicamente la interacción del proteína de dirigida con otras proteínas. Se utilizó este segunda método de para demostrar la importancia de la la interacción Nef-mortalin para la secreción exNef. La inhibición Anticuerpo es un procedimiento de recta-hacia adelante que requiere un método para la introducción de el anticuerpoen la célula y un ensayo de para las pruebas de su efecto sobre la la función de biológico en cuestión. Se utilizó la Carroza Proteína Reactivo de de entrega a nombre de Shuttle anticuerpos anti-mortalin en la célula, y la ensayo mencionado anteriormente de fluorescencia-basado en para medir los cambios en la secreción de exNef. Como la mayoría de los procedimientos de anticuerpo-basados ​​en, la eficacia de la inhibición de anticuerpo se limitada por la afinidad y la especificidad de el anticuerpo para la proteína apuntado.

A objetivo de mayor importancia de la investigación del VIH es el desarrollo de la novela la terapéutica de y la identificación de objetivos potenciales para la terapia. Los procedimientos descritos a aquí de apalancamiento péptidos cortos específicas, que retienen su función biológica y puede inhibir forma competitiva la función de las proteínas de larga duración en, a que acelere este proceso. Mientras que los experimentos descritos estaban dirigidos a la comprensión de un función de la tecla el VIH, los técnicas de empleadas deberían ser aplicables a la estudio de las interacciones proteína-proteína y el desarrollo de péptido-basado eninhibidores en varios campos.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Acknowledgments

Esta trabajo fue apoyado por NIH / NIGMS / del SAM (Grant 58268), NIH / CNRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance concesión de financiación GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA subvención de F31AI091484, Emory subvención de CFAR P30 A1050409. Esta investigación se llevó a cabo en un instalación construida con el apoyo de Investigación Instalaciones Improvement Grant # C06 RR18386 a partir NIH / CNRR. Los las células Jurkat, el conjunto de 20 el VIH-1 péptidos Nef, como así como la de conejo anti-el VIH-1 Nef antisuero fueron obtenerse a a partir de la SIDA de los NIH Investigación & Programa de reactivos de Referencia, (Rockville, MD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20mer peptide set with 10 amino acid overlap NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 4641
TUNEL Assay Roche 11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent Active Motif 30100
Tecan GENEios fluorimeter (Tecan Group, Switzerland)
96-well black microtiter plate Corning 3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
Dynabeads Protein G magnetic beads Invitrogen 100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) Promega Corp., Madison, WI Z5332
C-18 ZipTip Millipore ZTC18S096 C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution
MALDI TOF/TOF Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF

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References

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La identificación basada en péptidos de motivos funcionales y sus parejas de unión
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Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S., Johnson, K., Roth, W., Powell, M., Bond, V. Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners. J. Vis. Exp. (76), e50362, doi:10.3791/50362 (2013).More

Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S., Johnson, K., Roth, W., Powell, M., Bond, V. Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners. J. Vis. Exp. (76), e50362, doi:10.3791/50362 (2013).

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