Summary
Tekniker för att dissekera mekanismerna bakom utsöndringen av HIV-1 Nef i exosomes beskrivs. Specifika korta peptider härledda från Nef och protein transfektion utnyttjades för att bestämma struktur, funktion och bindande partner Nef utsöndring Modification Region. Dessa förfaranden har allmän relevans i många mekanistiska studier.
Abstract
Specifika korta peptider härledda från motiv som finns i hellånga proteiner, i vårt fall HIV-1 Nef, inte bara behålla sin biologiska funktion, men kan även kompetitivt hämma funktionen hos fullängdsproteinet. En uppsättning av 20 Nef scanning peptider, 20 aminosyror i längd med varje överlappande 10 aminosyror av dess granne, användes för att identifiera motiven i Nef ansvarig för dess induktion av apoptos. Peptider innehållande dessa apoptotiska motiv inducerade apoptos på nivåer jämförbara med den fullängds Nef protein. En andra peptid, som härrör från Sekretion Modification regionen (SMR) av Nef, bibehöll förmågan att interagera med cellulära proteiner som är involverade i Nef s sekretion i exosomes (exNef). Denna SMRwt peptid användes som "bete" protein i co-immunoprecipitation experiment för att isolera cellulära proteiner som binder specifikt till Nef s SMR motiv. Protein transfektion och antikropp hämning användes för att fysiskt störa interaktionen satsninglan Nef och mortalin, en av de isolerade SMR-bindande proteiner, och effekten mättes med en fluorescent-baserad exNef sekretion analys. Den SMRwt peptiden förmåga att konkurrera fullängds Nef för cellulära proteiner som binder SMR motiv, gör den till den första hämmare av exNef sekretion. Således, genom att använda de tekniker som beskrivs här, som utnyttjar de unika egenskaperna hos specifika korta peptider härledda från motiv som finns i hellånga proteiner kan man påskynda identifiering av funktionella motiv i proteiner och utvecklingen av peptidbaserade inhibitorer av patogena funktioner.
Introduction
Med tillkomsten av antiretroviral behandling har aidsepidemin i västvärlden har avtagit, men inte begränsas, och spridningen av hiv fortsätter att vara ett stort hälsoproblem börda över hela världen. Med undantag av den marginellt effektiva RV144 Thai rättegång, har HIV-vaccin hittills visat underlåtenhet att skydda mot infektion. Således är forskning om ytterligare potentiella terapeutiska mål fortfarande motiverad.
Tillsammans med CD4 T-cell utarmning, är ihållande generaliserad immun aktivering en kännemärke av HIV-infektion. Detta kronisk immun aktivering (CIA) leder till ökning i cell omsättning, aktiverade och differentierade lymfocytära subpopulationer, cellulär utmattning och åldrande, och dödandet av T-celler och B-celler via aktivering-inducerad celldöd (AICD) 1,2,3, och det är väl etablerad som en av de starkaste prediktorer för sjukdomsförloppet 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Men de mekanismer som ligger bakom CIA och CD4T-cells uttömning hos HIV-infektion förblir inte helt klarlagd.
Bevis från vårt labb och andra ledde oss till en modell för sjukdomsprogression (figur 1), där HIV-protein Nef (Negative Regulatory Factor) inducerar sin utsöndring i exosomes från HIV-1-infekterade celler 13,14. Dessa Nef-innehållande exosomes (exNef) inducera apoptos i ett antal cellinjer inklusive oinfekterade CD4 T-celler 15,16. Alternativt, i monocyter / makrofager exNef förändrar genuttryck mönster, t.ex. cytokinexpression, och tycks framkalla ett tillstånd av ledig immun aktivering. Denna mängd bevis tyder på en viktig roll för exNef i CIA och CD4 T-cells uttömning.
Att förstå den bakomliggande mekanismen Nef förmåga att manipulera exosomal trafficking vägen kommer att vara användbara i inhibitorer engineering nya av exNef sekretion. Hämning av exNef sekretion bör minska CD4 T-cell utarmningoch CIA som driver hiv / aids patogenes.
För att samla bevis som ledde till att vår modell för hiv / aids sjukdomsprogression och efterföljande uppgifter som byggde på denna modell, har vi utvecklat ett antal nya reagens och metoder som tillät oss att analysera genetiken av exNef sekretion, och börjar bestämma cellulära proteiner inblandade. I det inledande arbetet, fann vi att Nef protein inducerar apoptos i åskådareffekter celler och frisätts extracellulärt från Nef-transfekterade och HIV-infekterade celler 15. Peptider härledda från SDF-1α (Stromal cell derived factor-1, med alternativ splitsning alfa) hade tidigare visat att behålla mycket av bindningen och signaleringsaktivitet av full-längd molekyl 17. Vi spekulerade att peptider av Nef kan behålla en del av den apoptotiska aktiviteten hos det fullständiga proteinet, och att dessa peptider skulle nödvändigtvis behöver innehålla Nef apoptotiska domän (er). Att identifiera dessa peptider, och följaktligen Nefapoptotiska domän (er), erhöll vi en uppsättning av 20 HIV-1 Nef scanning peptider från NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Dessa 20-aa peptider, vardera överlappande 10 aminosyror av sin granne, som namnges av antalet sitt sista aminosyran, dvs N20 spänner Nef aminosyrorna 1-20, N30 spänner Nef aminosyrorna 11-30, etc 16. Vi fann att exponera T-celler extracellulärt till specifika peptider överlappar två distinkta 10-aa domäner i fullängd Nef protein inducerad apoptos i dessa celler. Efterföljande analys av dessa Nef-härledda apoptotiska peptider avslöjade deras förmåga att fysiskt interagera med kemokinreceptorn CXCR4 på ytan av T-celler, med bindningskinetik som tillät dessa peptider för att kompetitivt inhibera bindning mellan CXCR4 och dess naturliga ligand SDF-1α. Slutligen var Nef-härledda apoptotiska peptider interaktion med CXCR4 fann att inducera en stressreaktion i dessa T-celler vilket leder till apoptos. Denna bevisning tillät oss att quicKLY karta Nef funktionella domäner, en process som skulle ha tagit mycket längre tid med vanliga DNA mutagena tekniker såsom alaninscanning mutagenes. Den visade också att dessa korta Nef-härledda peptider behöll den biologiska funktionen hos de apoptotiska domäner i full längd protein.
Efter att ha identifierat en roll för extracellulär Nef, dvs apoptos av T-celler, sökte vi en bättre förståelse för hur Nef utsöndrades från cellerna. Med hjälp av en serie av muterade Nef konstruktioner, vi kartlagt högkonserverade motiv Nef protein i N-terminala regionerna av både HIV Nef, och dess Rhesusapa motsvarighet SIV mac (Simian immunbristvirus) Nef, som är avgörande för exNef sekretion 13. Ett av dessa motiv, utsöndringen Modification Region (SMR, 66VGFPV70), var särskilt kritisk, eftersom alanin ersättning av någon av sina fem aminosyror antingen kraftigt minskas eller avskaffas exNef sekretion. När levereras till celler via Active Motif s Chariot Protein Delivery Reagent, en peptid innehållande SMR fäst till en FLAG peptidsekvens (SMRwt) har visat sig hämma exNef sekretion från både Nef-transfekterade och HIV-infekterade celler 18. Utifrån våra tidigare erfarenheter med peptider, beslutade vi att använda denna peptid för att belysa de molekyler och mekanismer som ligger bakom Nef SMR: s roll i exNef sekretion.
Använda SMRwt peptid som vår "bete protein", vi co-immunprecipiterade cellulära bindande partner till SMR från icke-infekterade T-cellysat 18. FLAG peptidsekvensen förutsatt ett bekvämt handtag för att fånga SMRwt peptiden med användning av anti-FLAG affinitetsharts. Vår tidigare upptäckt att en enda valin till alanin mutation i SMRwt peptiden var tillräckligt för att avskaffa dess hämning av exNef sekretion identifierat ett bekvämt, mycket specifik kontroll peptid (SMRmut) som vi använde för att utesluta co-immunoutfällda proteiner inte specifika för SMR. Med hjälp av en peptid med specifika området av intresse snarare än fullängdsproteinet tillät oss att kringgå screening av dussintals cellulära faktorer som binder till andra domäner i Nef 19.
När vi identifierat de SMR-bindande partners, ett logiskt nästa steg var att visa att de identifierade cellulära bindande samarbetspartners är viktiga för den biologiska funktionen 18. Standardproceduren för att åstadkomma detta är att nivåer knockdown protein med användning målprotein-specifik miRNA eller siRNA, och därefter analysera effekten på den biologiska funktionen. Vi utförde miRNA knockdown, som hämmar translation av mål-mRNA, vilket minskar produktionen av det målet, i detta fall en SMR-bindande protein. Denna minskning av målproteinet är en indirekt effekt, och eventuellt har en fördröjd effekt på den biologiska funktionen av riktade protein spelar en roll i. Därför använde vi också mindre vanlig teknik antikropp inhibition för att avgöra om direkt störa aktiviteten hosmålproteinet reducerar eller eliminerar den biologiska funktionen. I detta förfarande, höjde antikroppar mot det riktade proteinet transfekteras in i cellen med Chariot Reagens och interagera direkt med målproteinet antingen binda den från dess plats av funktion, eller blockera dess aktuella domänen. Hämning av målproteinet genom detta förfarande stör direkt dess funktion, och kan komplettera RNA knockdown förfaranden genom ytterligare bekräftar vikten av målproteinet till den biologiska funktionen.
Medan Chariot Reagens är effektiv på att leverera peptider och proteiner i celler, denna process är tidskrävande och begränsar vilka typer av experiment, t.ex. långvarig eller upprepad exponering och in vivo djurstudier som kan utföras. Följaktligen lade vi en cell-penetrerande peptid (CPP) sekvens till SMRwt peptiden (SMRwt-CPP) 18 för att generera en peptid som kunde tas upp av celler passivtfrån odlingsmediet. Denna version var lika effektivt som det tidigare på att hämma exNef sekretion.
Bevisen från dessa publicerade experiment visar förmågan hos små peptider innehållande specifika funktionella motiv för att motverka funktion fullängdsproteinet genom kompetitiv hämning, och för att isolera de proteiner som binder dessa motiv. Man skulle förvänta sig att dessa tekniker ska vara användbart i många experimentella protokoll. De bör också vara effektiva i peptid engineering nya hämmare av många cellulära processer, en funktion som kan förbättras ytterligare genom koppling till CPP sekvenser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I. Användning av korta peptider i biologisk analys
I.1. Kartläggning biologiskt funktionella motiv Använda peptider
- Behandla celler med Nef scanning peptider
- Anskaffa en uppsättning peptider scanning regionen av intresse. För våra experiment, 20mer peptider, med 10 aminosyror överlappning, som spänner över hela HIV-1 Nef protein (205 aa), erhölls från AIDS Reagens Program. Peptiderna analyserades individuellt på följande sätt:
- Tillsätt 10 ng / ml av peptid till cellodlingsmediet.
- Tillsätt 10 ml odlingsmedium per platta till Jurkat cellkulturer.
- Inkubera kulturer för 24 timmar vid 37 ° C.
- Terminal deoxynucleotidyltransferase-medierad dUTP biotin Nick ändmärkning (TUNEL) analys av apoptos
- Tvätta cellerna med 1 x PBS, och fixa under 30 min vid rumstemperatur med 4% paraformaldehyd i 1X PBS, pH 7,4.
- Tvätta med 1X PBS, och permeabilisering med 0,1% Triton X-100 för 10min vid rumstemperatur.
- Skölj cellerna två gånger med 1X PBS.
- Räkna färgade celler genom epifluorescens på ett datorstyrt mikroskopi systemet.
I.2. Kompetitiv hämning Analys med peptider
- Samtransfektion av peptider med hjälp av Chariot Protein Kit Leverans Reagens
- Per transfektion reaktionsblandningen, späddes 1 | ig wtNef-GFP plasmid-DNA och 100 ng av antingen vild typ peptider härledda från SMR-domänen, eller peptider som innehåller alanin-utbyte av enskilda aminosyror i SMR motiv, till en slutlig volym av 100 | il med 1X PBS.
- Späd 6 | il av en 1/10 utspädning av Chariot Reagens till en slutlig volym av 100 | al med sterilt vatten, och kombinera med den utspädda DNA-peptid-mix.
- Inkubera vid rumstemperatur under 30 min för att medge bildning av Chariot / DNA-peptidkomplex.
- Pellets 3 x 10 5 Jurkat cellerna genom centrifugering vid 600 xg under 5 min.
- Tvätta cellerna två gånger med 1X PBS, och suspendera i Chariot / DNA-peptid komplex.
- Lägg 400 | il serumfritt RPMI 1640-medium till suspensionen och inkubera cellerna i odlingsplattor vid 37 ° C under 2 timmar.
- Tillsätt 1 ml färskt RPMI 1640-medium innehållande 10% FBS till varje platta, och inkubera cellerna under 48 h vid 37 ° C.
- Harvest celler och bestämmer transfektion effektivitet genom fluorescerande mikroskopi.
- Nef-GFP sekretion fluorescerande plattläsare analys av peptid inhibition
- Samla cellfria konditionerade media från de skördade cellerna, och överför 100 pl till enskilda brunnar i en 96-brunnars svart mikrotiterplatta.
- Mät GFP fluorescens i media på en Tecan GENEios fluorimeter med 485 exciteringsvåglängd nm och emission våglängd 515 nm i relativa fluorescerande enheter.
- Ställ in nivån av GFP fluorescens i kontrollgruppen (medium från celler samtransfekterade med Nef-GFP och en kodad peptid) Vid 100%.
- Jämför detta med den nivå av GFP fluorescens i media från celler samtransfekterade med olika SMR peptider för att fastställa förändringar i Nef-GFP sekretion.
I.3. Isolera Motif bindningsparter Använda peptider som bete
- Co-immunoprecipitation med SMR peptider
- Väx Jurkatceller i RPMI 1640-medium innehållande 10% FBS vid 37 ° C i en T-75 vävnadsodlingskolv, och pellets cellerna genom centrifugering vid 1000 x g under 20 min vid 4 ° C. Bestäm transfektionseffektiviteten, genom att placera plattan under ett fluorescensmikroskop, ta bilder, och därefter räkna den totala och märkta celler och bestämma procentandelen märkta celler.
- Resuspendera cellpelleten i 1 ml 1X PBS, och överföra den till en 1,5-ml Eppendorf-rör. Mikrocentrifug vid 1000 x g under 1 min. Återsuspendera pelleten i 1 ml α-FLAG Lysis buffert genom försiktig pipettering. Lysbuffert: Blanda 50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM natrium-chloride [NaCl], 1 mM EDTA och 1% Triton X-100, med 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid [PMSF], och 10 | il / ml proteasinhibitorcocktail för användning med däggdjurscell och vävnadsextrakt [PIC, Sigma]. Gör omedelbart före användning.
- Differentiellt mikrocentrifug suspensionema vid 2000 xg under 5 min och vid 13.000 xg under 10 minuter för pelletering av cellrester och DNA, respektive. Samla upp supernatanten (hädanefter kallad den "lysat").
- Tillsätt 1 mg lysat protein och 1 | ig av antingen SMRwt eller SMRmut peptid till 20 | il av anti-FLAG M2 Affinity Gel (nedan kallad "harts", Sigma). Notera att både SMRwt och SMRmut används här ha en sekvens FLAG-tag inbäddad i peptiderna. Låt blandningen till en slutlig volym av 1 ml i Co-IP-buffert (α-FLAG Lysbuffert minus PMSF och PIC). Inkubera blandningen vid 4 ° C över natten med end-over-end rotation. Som en negativ kontroll, inkubera lysatet med hartset i frånvaro av antingen peptid.
- Pellet hartset genom mikrocentrifugering vid 5.000 - 8.000 xg under 30 sek. Tillåt harts nöja 2 minuter innan du hanterar provet och sedan aspirera supernatanten. Avlägsna supernatanten med en smal-end pipett spets, eller en Hamilton spruta, försiktigt så att inte överföra något harts. Smal-end pipettspetsar kan göras med hjälp av pincett för att nypa öppnandet av en plast pipettspets tills den är delvis stängd. Tvätta hartset fyra gånger med 500 | il tvättbuffert (50 mM Tris • HCl pH 7,4, och 150 mM NaCl). Eluera de bundna cellulära proteiner med 15 pg av 3X FLAG-peptiden (Sigma) i 50 | il tvättbuffert och inkubera på rocker / skakare under 30 min vid rumstemperatur.
- Koncentrera eluaten genom acetonutfällning, följt av kokning i Laemmli provbuffert (Bio-Rad). Separera de proteiner genom SDS-PAGE på en 4-20% Tris-HCl Kriterium förgjuten gel (Bio-Rad). Färga gelén med Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Obs: för identifiering masspektrometri experiment (
- Co-immunoprecipitation med Nef-GFP-proteinet
- Blanda 50 pl av Dynabeads Protein G magnetiska pärlor (Invitrogen) med 2 ^ g murin monoklonal anti-GFP i 1 ml 1X PBS med 0,02% Tween 20 (PBS-T). Inkubera blandningen med end-over-end rotation i en 1,5-ml Eppendorf-rör under 1 h vid 4 ° C.
- Separera pärlorna från bufferten genom att placera röret på en 1,5-ml MagnaSphere Technology Magnetic Separation stativ (Promega Corp, Madison, WI) som möjliggör magnetisk pulldown följt av avlägsnande av supernatanten. Tvätta anti-GFP belagda pärlor med 1 ml PBS-T med hjälp av försiktig pipettering.
- Lyse Nef-GFP-transfekterade Jurkat-celler med 1 ml 1X RIPA + buffert genom försiktig pipettering och inkubation under 15 mi på is. RIPA + buffert: 10X RIPA lyseringsbuffert, pH 7,4 [Millipore, Bedford, MA] utspädd 1:10 i sterilt vatten, 0,02% natriumazid [Sigma], och 0,1% natriumdodecylsulfat [SDS], med 1 mM PMSF och 10 ^ il / ml PIC tillsattes omedelbart före användning.
- Pellet celldebris genom mikrocentrifugering vid 2000 xg under 10 min. Samla upp supernatanten (hädanefter kallad den "lysat").
- Tillsätt 1 mg lysat protein till de anti-GFP belagda pärlor, bringa den slutliga volymen till 1 ml med 1X RIPA + buffert och inkubera blandningen med end-over-end rotation under 1 h vid 4 ° C. Obs: För peptid konkurrens studier kan 1 mg av Lysate protein förinkuberas med 2 pg SMRwt eller SMRmut peptid i 1 ml 1X RIPA + buffert, innan den tillsätts till de anti-GFP belagda kulor.
- Tvätta pärlorna genom resuspension i 1 ml tvättbuffert (50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM NaCl och 0,1% Tween 20). Inkubera med end-over-end rotation i 5 minuter vid 4 ° C. Separera pärlor from tvätten med magnetisk separation Stand. Tvätta pärlor en andra och tredje gång med tvättbuffertar innehållande 250 mM och 300 mM NaCl, respektive.
- Återsuspendera pärlorna i 200 | il PBS, för över blandningen till ett rent rör, och separera pärlorna från wash på den magnetiska stativ. Koka på pärlorna i 50 | il Laemmli-provbuffert 5 min vid 95 ° C, låt blandningen svalna i 10 min vid rumstemperatur, och placera sedan blandningen på magnetiskt stativ för separering, och samla supernatanterna ("eluat") .
- Separera proteinerna av eluatet genom SDS-PAGE på en 8-16% Tris-HCl Kriterium precast gel.
- Masspektrometri
- Punktskatter proteinbanden av intresse från Coomassie-färgade geler.
- Minska proverna i 10 mM 1,4-ditiotreitol (DTT) under 45 min vid 37 ° C.
- Alkylera sampel i 55 mM jodacetamid under 45 min vid 25 ° C.
- Smälta proverna natten med sekvensering årskurs försökPSIN (Promega) vid 37 ° C.
- Avsalta prov peptider med C-18 ZipTip (Millipore). Blanda provet peptiderna med alfa-CHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), och hitta dem på en MTP målram III (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA).
- Utför tandem matrix-assisted laser desorption / jonisering tid-flygning (MALDI-TOF/TOF) masspektrometrianalys med en Bruker Daltonics UltraFlex III TOF / TOF.
- Jämför MS / MS-data till NCBI icke-redundanta och Swiss-Prot databaser med hjälp av Mascot algoritm ( www.matrixscience.com ).
- Immunoblotanalys
- Separera proteinproverna genom SDS-PAGE på 4 till 20% eller 8-16% Tris-HCl Kriterium förgjutna geler (Bio-Rad). Överför banden elektroforetiskt till ett nitrocellulosa membran.
- Tvätta membranet i Tris-buffrad saltlösning (TBS, Bio-Rad) under 5 min. Blockera med 5% fettfri mjölk i TTBS (TBS med 0,1% Tween 20) under 1 h genom skakning vid rumstemperatur.
- Process membranet för immunblotting med användning av en specifik primär antikropp i 5% fettfri mjölk med skakning vid 4 ° C över natten. Tvätta i TTBS under 20 min följt av en sekundär HRP konjugerad IgG (H + L)-antikropp i 5% fettfri mjölk under 1 timme vid rumstemperatur. Tvätta i TTBS under 30-60 min.
- Detektera proteinbanden genom Western Blotting Luminol Reagent (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Exponera filtret för att fotografisk film. Obs: I vissa experiment, var en strippa reagens som används för att skala av membranet (Pierce, Rockford, IL) med efterföljande hybridisering med en annan primär och sekundär antikropp.
- Skanna röntgenfilmerna i Adobe Photoshop 5.0.2. Utför densitometry analys med ImageJ programvara (National Institutes of Health, Bethesda, MD).
II. Användning av antikropp Hämning i Functional Analysis
II.1. Samtransfektion av Antibodtalet med Chariot Protein Kit Leverans Reagens
- Per transfektion reaktionsblandningen, späddes 1 | ig wtNef-GFP-plasmid-DNA och 1 ^ g av antingen anti-mortalin antikropp eller anti-α-tubulin antikropp, till en slutlig volym av 100 | il med 1X PBS. Anmärkning: Man har tidigare funnit att samtransfektion av den anti-α-tubulin antikropp har ingen detekterbar effekt på exNef sekretion, och således, tjänar den som en effektiv negativ kontroll i dessa experiment.
- Späd 6 il outspädd Chariot Reagens till en slutlig volym av 100 | al med sterilt vatten, och kombinera med den utspädda DNA-antikropp blanda.
- Inkubera vid rumstemperatur under 30 min för att medge bildning av Chariot / DNA-antikropp-komplex.
- Pellets 3 x 10 5 Jurkat cellerna genom centrifugering vid 600 xg under 5 min.
- Tvätta cellerna två gånger med 1X PBS, och suspendera i Chariot / DNA-antikropp komplex.
- Lägg 400 | il serumfritt RPMI 1640-medium till suspensionen och inkubera cells i odlingsplattor vid 37 ° C under 2 timmar.
- Tillsätt 1 ml färskt RPMI 1640-medium innehållande 10% FBS till varje platta, och inkubera cellerna under 48 h vid 37 ° C.
II.2. Nef-GFP utsöndring Bildrörsplattan Reader Analys av antikroppar Hämning
- Samla cellfria konditionerade media från de skördade cellerna, och överför 100 pl till enskilda brunnar i en 96-brunnars svart mikrotiterplatta.
- Mät GFP fluorescens i media på en Tecan GENEios fluorimeter med 485 exciteringsvåglängd nm och emission våglängd 515 nm i relativa fluorescerande enheter.
- Ställ in nivån av GFP fluorescens i kontrollgruppen (medium från celler samtransfekterade med Nef-GFP och anti-α-tubulin antikropp) på 100%.
- Jämför detta till nivån av GFP-fluorescens i media från celler co-transfekterade med anti-mortalin antikropp för att fastställa förändringar av Nef-GFP sekretion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kartläggning biologiskt funktionella motiv med hjälp av peptider. Två regioner identifierades på Nef proteiner som framkallar apoptos. Peptid-driven apoptos observerades (figur 2) som börjar med peptid N50 (aa30-50), en topp på N60 (aa40-60) och N70 (aa50-70), och minskar till bakgrundsnivåerna vid peptid N100 (aa80-100). Den stora Motif 1 (M1) topp, centrering på aa50-60, inducerar> 80% av de apoptotiska nivåer av full längd Nef protein. En andra, mindre apoptotisk topp observerades spänner peptiderna N180 (aa160-180) och N190 (aa170-190). Denna mindre Motif 2 (M2) topp, centrerad på aa170-180, inducerar ~ 30% av de apoptotiska nivåer av full längd Nef protein 16.
Kompetitiv inhibering Analysis using Peptider. I figur 3, peptider innehållande en intakt SMR hämmades signifikant exNef sekretion. Detta var sant om motivet var belägen vid N-terminalen (Wildtype-1) eller mitten (Vildtyps-2) av peptiden, eller duplicerades i peptiden (Vildtyps-3). Alternativt, alanin-substitution av en aminosyra av motivet, oberoende av motivet position eller nummer i peptiden upphävde peptidens funktion 18. En 11-amino-syra förvrängd version av Nef s apoptotiska Motif 1 (SM1), som tidigare beskrivits 14 och erhölls från Sigma Genosys, användes som en negativ kontroll och hade ingen effekt på exNef sekretion. Se tabell 1 för en förteckning över de peptidsekvenserna.
Isolera Motif bindningsparter Använda peptider som bete. Figur 4A visar co-immunoutfällning av fyra proteiner genom den SMRwt peptiden (60, 65, 75, och 250 kDa). Den negativa kontrollen SMRmut peptiden inte fånga dessa proteiner, och dessa proteiner inte ospecifikt interagera med affinitetsharts i frånvaro av peptid, vilket antyder att de co-immunoprecipiterade proteiner var interagerarspecifikt med SMR motiv av SMRwt peptiden. Dessa proteiner har senare identifierats av MALDI-TOF tandem masspektrometri (se figur 4B för ett representativt urval), och kontrolleras av immunblotanalys 18.
Användning av antikropp Hämning i Functional Analysis. Hämning med anti-mortalin antikropp helt avskaffas exNef sekretion (Figur 5). Detta bekräftade att en intakt Nef / mortalin interaktion krävs för exNef sekretion. Vidare föreslår det starkt att den mekanism genom vilken SMRwt peptiden hämmar exNef sekretion är genom störning av denna interaktion genom direkt konkurrens för mortalin 18.
Tabell 1. Panel av SMR peptider utvecklats och testats för deras effekt på Nef-inducerad exNef sekretion. Här flikenle publicerades ursprungligen i Shelton et al., JVI 2012 18. I tidigare studier, alanin-ersättning av enstaka aminosyror i SMR motivet reduceras avsevärt, eller avskaffas, Nef-inducerad sekretion 18. Virus som isolerats från en långsiktig nonprogressor uttryckte en variant av Nef med en isoleucin istället för V66,. En av de rapporterade några variationer i högt konserverade SMR motiv 20 Klicka här för att se större tabell .
Figur 1. Effekter av Nef exosomes om viktiga immuna celltyper. Denna modell visar exNef frigörs från infekterade celler, och det är förutsedda effekter på monocyter och lymfatiska celler som skulle leda till aidspatogenes. AICD, aktivering inducerad celldöd. I. infekterad cell releaser virus, normala exosomes, och exNef. exNef aktiverar oaktiverade, oinfekterade monocyter (B). Aktiveringen av monocyter (C) resulterar i förändringar i genuttryck som leder till ökningar av det inflammatoriska tillståndet och resultera i aktivering och konsumtion av CD4 + och CD8 + T-celler. II. Infekterad cell releaser virus, normala exosomes, och exNef. exNef aktiverar oaktiverade, icke infekterade lymfocyter (D). De aktiverade lymfocyter (E) genomgår förändringar genuttryck som resulterar i AICD resulterar i en apoptotiska celler (F). Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Peptide scanning analys av HIV-1 Nef protein för apoptotisk motiv (er). En uppsättning av 20-mer peptider, var och en med 10 aminosyror överlappning, som spänner över de 205 aminosyrorna i KNFS Nef-proteinet, erhölls från AIDS Reagent Program och används i kartläggningen Nef apoptotiska domäner. Denna siffra publicerades ursprungligen i Huang et al., JVI, 2004 13. Y-axeln visar procent celler som är TUNEL märkta, och X-axeln betecknar behandlingen tillstånd. Full Nef protein [Nef], obehandlade celler [UT], eller peptiderna börjar med Aa1-20 [N20], och slutar med AA190-205 [N205]. Felstaplar betecknar standardavvikelsen för mätningen, och resultatet är en sammanställning av minst 3 oberoende experiment. Topparna av apoptos betecknas med Motif 1 och Motif 2.
Figur 3. SMRwt peptid inhiberar exNef. Peptider innehållandeen eller flera vildtyp Nef SMR sekvensmotiv hämmade utsöndringen av exNef, medan alanin-byte av någon Animo syra i regionen kraftigt minskat peptiden effektivitet. Denna siffra publicerades ursprungligen i Shelton et al., JVI 2012 15. Odlingsmedier från Jurkat T-celler, co-transfekterade med en Nef-GFP-klonen och olika peptider SMR, analyserades med avseende på exNef sekretion. Mängden GFP-fluorescens mätt är ekvivalent med mängden av exNef-GFP i de extracellulära medierna. Statistisk signifikans bestämdes med användning av ett oparat t-test. Effekten på exNef utsöndring av olika peptider jämfördes med den av en slumpmässigt kodad peptid kontroll (SM1, * p-värde <0,05; ** p-värde <0,01, *** p-värde <0,001).
Figur 4. Den SMRwt peptiden interagerar specifikt med värdcellproteiner, inklusive mor Talin. (A) Proteiner från Jurkat T-celler sam-immunoprecipiterades med antingen SMRwt eller SMRmut peptider med anti-FLAG M2 antikroppsförenade affinitetsharts. Notera att både SMRwt och SMRmut används här ha en sekvens FLAG-tag inbäddad i peptiderna. Denna siffra publicerades ursprungligen i Shelton et al., JVI, 201215. Detta förfarande upprepades i frånvaro av antingen peptid som en kontroll för icke-specifika interaktioner med affinitetsharts. Den Coomassie Blue färgade gelén bilden visar proteiner med molekylvikt 60, 65, 75 och 250 kDa (pilspetsar) tryckas ned genom SMRwt som inte revs av SMRmut peptiden eller utan peptid. (B) Den 75-kDa band skars ut från gelén, trypsin-digererad, och analyserades genom MALDI-TOF-tandemmasspektrometri. MS / MS Ion Sök identifierat de 75-kDa som mortalin. Pilar betecknar sekvenserna hos de matchande peptider.large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild
Figur 5. Mortalin antikropps inhibering block exosome sekretion. Extracellulära odlingsmedia från Jurkat-celler, co-transfekterade med en Nef-GFP-klonen och antikroppar mot antingen mortalin eller α-tubulin, analyserades med avseende på exNef sekretion. Vid en jämförelse med effekten av en antikropp mot ett protein som inte är involverat i exNef sekretion (α-tubulin), störningar av mortalin s aktivitet genom dess antikropp resulterade i fullständig avskaffande av exNef sekretion. Statistisk signifikans bestämdes genom oparat t-test jämför exNef sekretion i närvaro av mortalin antikroppen kontra α-tubulin antikropp (*** p-värde <0,001). Denna siffra publicerades ursprungligen i Shelton et al., JVI 2012 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att förstå den bakomliggande mekanismen Nef förmåga att manipulera exosomal trafficking vägen kommer att vara användbara i inhibitorer engineering nya av exNef sekretion. Hämning av exNef sekretion bör minska CD4 T-cells uttömning och CIA som driver hiv / aids patogenes. Mot detta mål, har vi utvecklat ett antal nya reagens och metoder som tillät oss att analysera genetiken av exNef sekretion, och börjar bestämma de cellulära inblandade proteinerna. Detta synsätt ledde också till utvecklingen av den första hämmare till direkt rikta exNef sekretion, den SMRwt peptiden.
En viktig slutsats av vårt arbete är att specifika korta peptider härledda från motiv som finns i hellånga proteiner, i vårt fall HIV-1 Nef, inte bara behålla sin biologiska funktion, men kan också kompetitivt hämma funktionen av full längd protein. Eftersom dessa peptider bibehåller sin biologiska funktion, kan de användas för att identifiera funktionella domäneri fullängdsproteinet. Krävs två saker: generering av peptider som söker av proteinet av intresse, antingen hela sin längd eller en region av proteinet tros innehålla den funktionella domän, och en analys för att testa den biologiska funktionen i fråga. Eftersom vi saknade information som skulle tillåta oss att begränsa vår sökning efter apoptosinducerande motiv till specifika regioner av Nef, använde vi en uppsättning av peptider scanning hela sin längd. Även om denna process gjordes enklare genom Nef: s relativa litenhet har vi tillämpat även denna metod för större (> 75 kDa) proteiner. En väletablerad analys för att mäta apoptos (TUNEL) användes för att identifiera peptider bibehåller den biologiska funktionen av intresse, i detta fall, Nef-inducerad apoptos av CD4 T-celler. Intressant nog visade den efterföljande analysen i den ursprungliga papper som de identifierade apoptotiska peptiderna behöll> 80% av den biologiska aktiviteten för den hellånga Nef protein och kompetitivt hämmade CXCR4 bindningav dess naturliga ligand SDF-1α.
Likaså behöll en kort peptid innehållande SMR motivet av Nef dess biologiska förmåga att interagera med cellulära proteiner som är involverade i exNef sekretion. Men i detta fall bibehållande av aktivitet inte leda till härmning av en Nef-funktion, vilket var fallet med apoptosinduktion, men ledde istället till inhibering. Eftersom SMRwt peptiden effektivt binds de SMR-bindningsställen av dessa cellulära proteiner, stört det deras samspel med Nef, och därmed förhindrade Nef utsöndring i exosomes. Som Nef motivet av intresse var känd från tidigare genetiska kartläggningsstudier, kunde vi begränsa peptid utveckling till variationer i SMR. Istället för att identifiera nya funktionella motiv, använde vi dessa peptider och en tidigare utvecklad fluorescens-baserad analys för att mäta exNef sekretion, för att visa att SMR roll i exNef sekretion var kopplad direkt till dess specifika primära sekvensen.
HIV-1, listar Human Protein Interaction Database mer än 60 cellulära proteiner som interagerar direkt med Nef och möjligen så många som 200 som interagerar direkt eller indirekt 19. Genom att begränsa den sekvens av vår betesprotein till motivet av intresse, undvek vi att behöva sortera igenom dussintals proteiner som skulle ha co-immunoprecipiterades av full längd Nef protein. Majoriteten av dessa proteiner, medan specifika för Nef, inte skulle vara bindande partners för Nef s SMR, och skulle därmed utgöra bakgrund / brus. En försiktig beräkning är att vi minskat bullret med 15x (60/4). I huvudsak vår strategi effektivt ökat signal-till-brus-förhållande genom att minimera bakgrunden på grund av off-site, eller i vårt fall off-motiv bindning, vilket tillåter oss att identify proteiner som specifikt binder SMR. Emellertid är det möjligt att, genom att använda denna metod, har vi misslyckades med att fånga alla SMR-bindande cellulära proteiner, särskilt de som kräver samverkan med både SMR och ett andra motiv att binda Nef, eller de vars bindning är beroende av sekundär eller tertiär struktur.
Mortalin, ett cellulärt protein co-immunoprecipiterades av SMRwt peptiden, visade sig krävas för exNef utsöndring av miRNA knockdown och antikroppar inhibition. Den förstnämnda är en väletablerad teknik som reducerar eller eliminerar uttryck av riktade protein. Omvänt påverkar antikroppar inhibition inte proteinuttrycksnivåer, utan fysiskt hämmar riktade proteinets interaktion med andra proteiner. Vi använde denna andra metod för att påvisa betydelsen av Nef-mortalin interaktion för exNef sekretion. Antikropp hämning är en rättfram procedur som kräver ett förfarande för införande av antikroppenin i cellen och en analys för att testa dess effekt på den biologiska funktionen i fråga. Vi använde Chariot Reagent Protein Leverans till shuttle anti-mortalin antikroppar in i cellen, och den ovan nämnda fluorescens-baserad analys för att mäta förändringar i exNef sekretion. Liksom de flesta antikropp-baserade förfaranden, är effektiviteten av antikropp hämning begränsas av affinitet och specificitet för antikroppen för riktad proteinet.
Ett viktigt mål för HIV-forskningen är att utveckla nya läkemedel och identifiering av potentiella mål för behandling. De förfaranden som beskrivs här utnyttja specifika korta peptider, som bibehåller sin biologiska funktion och kan kompetitivt inhibera funktionen av hellånga proteiner, för att påskynda denna process. Medan de beskrivna experimenten var riktade på att förstå en nyckel HIV funktion, bör de metoder tillämpas för att studera protein-proteininteraktioner och utvecklingen av peptid-baseradehämmare inom flera områden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance finansiering bidrag GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA bidrag F31AI091484, Emory CFAR bidrag P30 A1050409. Denna undersökning genomfördes i en anläggning konstruerad med stöd från forskningsanläggningar Förbättring Grant # C06 RR18386 från NIH / NCRR. De Jurkatceller, den uppsättning av 20 HIV-1 Nef peptider, liksom kanin anti-HIV-1 Nef antiserum erhölls från NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, (Rockville, MD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20mer peptide set with 10 amino acid overlap | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 4641 | |
| TUNEL Assay | Roche | 11 684 809 910 | |
| Chariot Protein Delivery Reagent | Active Motif | 30100 | |
| Tecan GENEios fluorimeter | (Tecan Group, Switzerland) | ||
| 96-well black microtiter plate | Corning | 3792 | |
| anti-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Invitrogen | 100.03D | |
| MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) | Promega Corp., Madison, WI | Z5332 | |
| C-18 ZipTip | Millipore | ZTC18S096 | C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution |
| MALDI TOF/TOF | Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF |
References
- Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen? Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
- Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
- Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).
- Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).
- Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).
- Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).
- Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).
- Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).
- Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).
- Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).
- Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
- Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).
- Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).
- Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).
- James, C. O., Huang, M. -B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).
- Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).
- Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).
- Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).
- Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).
- Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).
