Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Peptid-baserede identifikation af funktionskravene motiver og deres bindingspartnere

Published: June 30, 2013 doi: 10.3791/50362
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology, Biochemistry, & Immunology, Morehouse School of Medicine, 2Institute for Systems Biology, 3Advanced Medical & Dental Institute, Universiti Sains Malaysia

Summary

Teknikker til at dissekere mekanismerne bag udskillelsen af ​​HIV-1 Nef i exosomes beskrevet. Specifikke korte peptider afledt fra Nef og protein transfektion blev udnyttet til at bestemme strukturen, funktionen og bindingspartnere af Nef s Sekretion Ændring Region. Disse procedurer har generel relevans i mange mekanistiske undersøgelser.

Abstract

Specifikke korte peptider afledt fra motiver fundet i proteiner i fuld længde, i vores tilfælde HIV-1 Nef, ikke blot bevarer deres biologiske funktion, men kan også kompetitivt at inhibere funktionen af ​​fuldlængde-proteinet. Et sæt af 20 Nef scanning peptider, 20 aminosyrer i længde med hver overlappende 10 aminosyrer af dets nabo, blev brugt til at identificere motiver i Nef ansvarlig for induktion af apoptose. Peptider indeholdende disse apoptotiske motiver apoptose på niveauer svarende til den fulde længde Nef-protein. En andet peptid, der stammer fra Sekretion Ændring region (SMR) i Nef bevaret evnen til at interagere med cellulære proteiner involveret i Nef s sekretion i exosomer (exNef). Denne SMRwt peptid blev anvendt som "lokkemad" protein i co-immunopræcipitation eksperimenter at isolere cellulære proteiner, der binder specifikt til Nef s SMR motiv. Protein transfektion og antistof hæmning blev anvendt til fysisk at forstyrre vekselvirkningen betlem Nef og Mortalin, en af ​​de isolerede SMR-bindende proteiner, og virkningen blev målt med et fluorescerende-baserede exNef sekretion assay. Den SMRwt peptid evne til at udkonkurrere fuld længde Nef for cellulære proteiner, som binder SMR motiv, gør det til det første hæmmer af exNef sekretion. Således, ved anvendelse af teknikkerne beskrevet her, der udnytter de unikke egenskaber af specifikke korte peptider afledt fra motiver fundet i proteiner i fuld længde, kan man accelerere identifikation af funktionelle motiver i proteiner og udvikling af peptid-baserede inhibitorer af patogene funktioner.

Introduction

Med fremkomsten af ​​anti-retroviral behandling er aids-epidemien i den vestlige verden er blevet bremset, men ikke indskrænket, og udbredelsen af ​​hiv fortsætter med at være et stort sundhedsmæssigt belastning i hele verden. Med undtagelse af den marginalt effektive RV144 Thai retssag, har HIV-vacciner hidtil vist manglende beskyttelse mod infektion. Således er forskning i yderligere potentielle terapeutiske mål stadig berettiget.

Sammen med CD4 T-celle depletion, er vedvarende generaliseret immunaktivering kendetegnende for HIV-infektion. Denne Kronisk immunaktivering (CIA), fører til stigninger i celle omsætning, aktiverede og differentieret lymfatisk delpopulationer, cellulære udmattelse og ældning, og drabene på T-celler og B-celler via aktivering celledød (AICD) 1,2,3, og det er godt etableret som en af de stærkeste prædiktorer for sygdomsprogression 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Men mekanismerne bag CIA og CD4T-celle depletion ved HIV-infektion er endnu ikke fuldt belyst.

Evidens fra vores laboratorium, og andre førte os til en model for sygdomsprogression (figur 1), hvor HIV-proteinet Nef (Negativ Regulatory Factor) inducerer sin sekretion i exosomes fra HIV-1 inficerede celler 13,14. Disse Nef-holdige exosomer (exNef) inducere apoptose i en række cellelinier, herunder inficerede CD4 T-celler 15,16. Alternativt, i monocytter / makrofager exNef ændrer genekspression mønstre, f.eks cytokinekspression, og synes at inducere en tilstand af uplanlagt immunaktivering. Dette organ bevis antyder en vigtig rolle for exNef i CIA og CD4 T-celle depletion.

Forstå de mekanismer, der ligger til grund Nef evne til at manipulere exosomal trafficking vej vil være nyttige i tekniske hidtil ukendte inhibitorer af exNef sekretion. Inhibering af exNef sekretion vil aftage CD4 T-celle depletionog CIA at drive HIV / AIDS patogenese.

At samle de beviser, der førte til vores model for HIV / AIDS sygdomsprogression og de efterfølgende data, bygget på denne model, har vi udviklet en række nye reagenser og metoder, tilladt os at analysere genetik exNef sekretion, og begynde at bestemme cellulære proteiner involveret. I det indledende arbejde, fandt vi, at Nef-protein inducerer apoptose i bystander celler og frigives ekstracellulært fra Nef-transficerede og HIV-inficerede celler 15. Peptider afledt af SDF-1α (stromacelle Derived Factor-1, med alternativ splejsning alfa) tidligere er blevet vist at bevare meget af den bindende og signalering aktivitet molekyle i fuld længde 17. Vi spekuleret på, at peptider af Nef kunne bevare nogle af den apoptotiske aktivitet af den fulde protein-, og at disse peptider ville nødvendigvis indeholde Nef apoptotiske domæne (r). At identificere disse peptider, og dermed Nefapoptotic domæne (r), opnåede vi et sæt af 20 HIV-1-Nef scanning peptider fra NIH AIDS forskning og referencereagenten Program. Disse 20-aa peptider er hver overlappende 10 aminosyrer af sin nabo, navngivet af antallet af deres sidste aminosyre, dvs N20 spænder Nef aminosyrerne 1-20, N30 spænder Nef aminosyrer 11-30, osv. 16.. Vi fandt at udsætte T-celler ekstracellulært til specifikke peptider overlappende to forskellige 10-aa domæner i fuld længde Nef-protein induceret apoptose i disse celler. Efterfølgende analyse af disse Nef-afledte apoptotiske peptider viste deres evne til fysisk at interagere med chemokinreceptor CXCR4 på overfladen af ​​T-celler, med bindingskinetik der tillod disse peptider til kompetitivt at inhibere binding mellem CXCR4 og dens naturlige ligand SDF-1α. Endelig blev de Nef-afledte apoptotiske peptider interaktion med CXCR4 sig at inducere en stress-respons i disse T-celler, hvilket fører til apoptose. Dette beviser tilladt os at quicKLY map Nef funktionelle domæner, en proces, der ville have taget meget længere tid ved hjælp af standard DNA mutagene teknikker såsom alaninscanningsmutagenese. Det viste også, at disse korte Nef-afledte peptider bibeholdt den biologiske funktion af de apoptotiske domæner i fuld-længde proteinet.

Efter at have identificeret en rolle for ekstracellulær Nef, dvs apoptose af T-celler, søgte vi en bedre forståelse af, hvordan Nef blev udskilt fra cellerne. Anvendelse af en serie af muterede Nef konstruktioner kortlagde vi stærkt konserverede Nef proteinmotiver i de N-terminale regioner af både HIV Nef, og dens Rhesus macaque tilsvarende SIV mac (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, der er kritiske for exNef sekretion 13. En af disse motiver, sekretion Ændring Region (SMR, 66VGFPV70), var særligt kritisk, da alanin udskiftning af nogen af ​​sine fem aminosyrer enten stærkt reduceret eller afskaffet exNef sekretion. Ved levering til celler via Active Motif s Chariot Protein Delivery Reagent, et peptid indeholdende SMR fastgjort til en FLAG peptidsekvens (SMRwt) blev fundet at inhibere exNef sekretion fra både Nef-transficerede og HIV-inficerede celler 18. Baseret på vores tidligere erfaringer med peptider, besluttede vi at bruge dette peptid at belyse molekyler og mekanismerne bag det Nef SMR rolle i exNef sekretion.

Brug af SMRwt peptid som vores "bait protein", vi co-immunofældet cellulære bindende partnere i SMR fra inficerede T-cellelysater 18. FLAG-peptidsekvensen billede en praktisk håndtag til at opfange SMRwt peptid under anvendelse af anti-FLAG affinitetsharpiks. Vores tidligere fund, at en enkelt valin til alanin mutation i SMRwt peptid var tilstrækkelige til at afvikle sin hæmning af exNef sekretion identificeret en bekvem, meget særlige kontrol peptid (SMRmut), som vi brugte til at udelukke co-immunopræcipiterede proteiner ikke specifikke for SMR. Ved hjælp af et peptid med sPECIFIKKE domæne af interesse snarere end fuld-længde proteinet tilladt os at omgå screening af dusinvis af cellulære faktorer, der binder til andre domæner i Nef 19..

Når vi identificeret de SMR-bindende partnere et logisk næste skridt var at vise, at de identificerede cellulære bindende partnere er vigtige for den biologiske funktion 18.. Den normale procedure at opnå dette er at Knockdown protein niveauer ved hjælp målprotein-specifik miRNA eller siRNA, og efterfølgende assay effekt på den biologiske funktion. Vi udførte miRNA knockdown, som hæmmer translation af mål-mRNA'et, hvilket reducerer produktionen af ​​dette mål, i dette tilfælde en SMR-bindende protein. Denne reduktion af målproteinet er en indirekte effekt, og muligvis har en forsinket virkning på den biologiske funktion den tilsigtede protein spiller en rolle i. Derfor har vi også ansat den mindre almindelige antistof hæmning teknik at afgøre, om direkte forstyrre aktiviteten afmålproteinet reducerer eller eliminerer den biologiske funktion. I denne procedure, rejst antistoffer mod målrettet proteinet, transficeres ind i cellen ved hjælp Chariot reagens, og interagere direkte med målproteinet enten sekvestrerende det fra sin hjemmeside af funktion, eller blokere dens relevante bindende domæne. Inhibering af målproteinet gennem denne procedure direkte forstyrrer dens funktion, og kan supplere RNA knockdown procedurer ved yderligere bekræfter betydningen af ​​målproteinet til den biologiske funktion.

Mens Chariot Reagent er effektivt til at levere peptider og proteiner i celler denne proces er tidskrævende og begrænser de typer af eksperimenter, fx langvarig eller gentagen eksponering og in vivo dyreforsøg, der kan udføres. Derfor har vi tilføjet en celle-gennemtrængende peptid (CPP) sekvens med SMRwt peptid (SMRwt-CPP) 18 at generere et peptid, der kunne optages af celler passivtfra kulturmedier. Denne version var lige så effektivt som den førstnævnte inhibering exNef sekretion.

Dataene fra disse publicerede eksperimenter viser evnen hos små peptider indeholdende specifikke funktionelle motiver til at antagonisere funktionen af ​​fuldlængde proteinet gennem kompetitiv inhibering, og at isolere de proteiner, der binder disse motiver. Man ville forvente, at disse teknikker bør være nyttige i mange forsøgsprotokoller. De bør også være effektiv i engineering nye peptidbaserede inhibitorer af mange cellulære processer, en funktion, der kan blive yderligere forstærket af kobling til CPP sekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I. Anvendelse af korte peptider i Biologisk Analysis

I.1. Kortlægning Biologisk Funktionelle Motiver Brug peptider

  1. Behandling celler med Nef scanning peptider
    1. Skaffe en række af peptider scanning området af interesse. For vores eksperimenter, 20mer peptider, med 10 aminosyrer overlap, spænder over hele HIV-1 Nef-protein (205 aa), blev opnået fra AIDS Reagent Program. Peptiderne analyseres individuelt som følger:
    2. Tilsæt 10 ng / ml af peptidet til cellekulturmediet.
    3. 10 ml dyrkningsmedium pr plade til at Jurkat cellekulturer.
    4. Inkuber kulturer til 24 timer ved 37 ° C.
  2. Terminale deoxynucleotidyltransferase-medieret dUTP biotin nick end Mærkning (TUNEL) assay af apoptose
    1. Vask cellerne med 1X PBS, og fastsætte i 30 minutter ved stuetemperatur med 4% paraformaldehyd i 1X PBS, pH 7,4.
    2. Vask med 1X PBS, og permeabilisere med 0,1% Triton X-100 for 10min ved stuetemperatur.
    3. Skyl cellerne to gange med 1X PBS.
    4. Tælle farvede celler ved epifluorescens på en computerstyret mikroskopi-system.

I.2. Kompetitiv hæmning Analyse hjælp peptider

  1. Co-transfektion af peptider ved hjælp af Chariot Protein Delivery Reagent Kit
    1. Pr transfektion reaktionsblandingen, fortyndes 1 ug wtNef-GFP plasmid-DNA og 100 ng af enten vildtype peptider afledt fra SMR domæne, eller peptider indeholdende alanin-erstatning af individuelle aminosyrer i SMR motiv, til et endeligt volumen på 100 gl med 1X PBS.
    2. Fortynd 6 pi af en 1/10 fortynding af Chariot Reagent til et endeligt volumen på 100 gl med sterilt vand, og blandes med det fortyndede DNA-peptid mix.
    3. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter for at tillade dannelse af Chariot / DNA-peptid kompleks.
    4. Pellet 3 x 10 5 Jurkat-celler ved centrifugering ved 600 xg i 5 min.
    5. Vask cellerne to gange med 1X PBS, og resuspender i Chariot / DNA-peptid kompleks.
    6. Tilføj 400 pi serumfrit RPMI 1640-medium til suspensionen, og inkuber cellerne i dyrkningsplader ved 37 ° C i 2 timer.
    7. Tilsæt 1 ml frisk RPMI 1640 medium indeholdende 10% FBS til hver plade, og inkuber cellerne i 48 timer ved 37 ° C.
    8. Høst celler og bestemme transfektionseffektivitet ved fluorescensmikroskopi.
  2. Nef-GFP sekretion fluorescerende pladelæser assay af peptid hæmning
    1. Saml de cellefrie konditionerede medier fra de høstede celler, og overføre 100 pi til individuelle brønde i en 96-brønds sort mikrotiterplade.
    2. Mål GFP-fluorescens i medierne på en Tecan GENEios fluorimeter med excitationsbølgelængde 485 nm og emission bølgelængde 515 nm i relative fluorescerende enheder.
    3. Indstil niveauet af GFP-fluorescens i kontrolgruppen (medier fra celler co-transficeret med Nef, GFP og en kodet peptid) Ved 100%.
    4. Sammenlign dette til det niveau af GFP-fluorescens i medierne fra celler co-transficeret med forskellige SMR peptider at bestemme ændringer i Nef-GFP sekretion.

I.3. Isolating Motiv Bindende Partners Brug Peptider som Bait

  1. Co-immunoprecipitation med SMR peptider
    1. Grow Jurkat-celler i RPMI 1640 medium indeholdende 10% FBS ved 37 ° C i en T-75 vævskulturkolbe, og pellet cellerne ved centrifugering ved 1.000 x g i 20 min ved 4 ° C. Bestem transfektionseffektivitet ved at placere pladen under et fluorescensmikroskop, tage billeder, og derefter tælle totalt og mærkede celler og bestemme procent mærkede celler.
    2. Resuspender cellepelleten i 1 ml 1X PBS, og overføre det til en 1,5-ml Eppendorf rør. Mikrocentrifuge ved 1.000 xg i 1 min. Pellet resuspenderes i 1 ml α-FLAG Lysis buffer ved forsigtig pipettering. Lysepuffer: Bland 50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM natrium CHLoride [NaCl], 1 mM EDTA og 1% Triton X-100, med 1 mM phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF], og 10 ul / ml Protease Inhibitor Cocktail til brug med pattedyrcelle og vævsekstrakter [PIC, Sigma]. Foretag umiddelbart før brug.
    3. Differentielt mikrocentrifuge suspensionerne ved 2.000 xg i 5 minutter, og ved 13.000 xg i 10 minutter for at pelletere cellerester og DNA hhv. Saml supernatanten (herefter benævnt "lysat").
    4. Tilsæt 1 mg lysat protein og 1 ug af enten SMRwt eller SMRmut peptid til 20 ul anti-FLAG M2 affinitetsgel (herefter kaldet "harpiks", Sigma). Bemærk at både SMRwt og SMRmut brugt her har en FLAG-tag-sekvens indlejret i peptiderne. Blandingen bringes til et slutvolumen på 1 ml i Co-IP buffer (α-FLAG Lysis buffer minus PMSF og PIC). Inkuber blandingen ved 4 ° C natten over med ende-over-ende rotation. Som en negativ kontrol, inkubere lysatet med harpiksen i fravær af enten peptid.
    5. Pellet harpiksen ved mikrocentrifugering på 5.000 - 8.000 xg i 30 sek. Tillad harpiks til at nøjes med 2 min før håndtering af prøven og derefter aspirer supernatanten. Fjern supernatanten med en smal ende pipettespids eller en Hamilton sprøjte, pas på ikke at overføre nogen harpiks. Narrow-end pipettespidser kan gøres ved hjælp af pincet til at klemme åbningen af ​​en plastik pipette spids, indtil det er delvist lukket. Resinen vaskes fire gange med 500 ul vaskepuffer (50 mM Tris • HCl pH 7,4, og 150 mM NaCl). Elueres bundne cellulære proteiner med 15 ug af 3X FLAG peptid (Sigma) i 50 pi vaskepuffer og inkuber på rocker / ryster i 30 minutter ved stuetemperatur.
    6. Koncentrer Eluaterne ved acetonefældning, efterfulgt af kogning i Laemmli prøvepuffer (Bio-Rad). Adskille proteiner ved SDS-PAGE på en 4-20% Tris-HCI Criterion færdigstøbte gel (Bio-Rad). Farv gelen med Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Bemærk: for massespektrometri identifikation eksperimenter (
  2. Co-immunfældning med Nef-GFP-protein
    1. Bland 50 pi Dynabeads Protein G magnetiske perler (Invitrogen) med 2 ug af murin monoklonalt anti-GFP i 1 ml 1X PBS med 0,02% Tween 20 (PBS-T). Inkuber blandingen med ende-over-ende rotation i en 1,5 ml Eppendorf-rør i 1 time ved 4 ° C.
    2. Adskille perlerne fra bufferen ved at placere røret på en 1,5-ml MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (Promega Corp, Madison, WI), så magnetisk pulldown efterfulgt af fjernelse af supernatanten. Vask anti-GFP overtrukne perler med 1 ml PBS-T bruger blide pipettering.
    3. Lyse Nef-GFP transficerede Jurkat-celler med 1 ml 1X RIPA + buffer ved forsigtig pipettering og inkubation i 15 mi på is. RIPA + buffer: 10X RIPA Lysis Buffer, pH 7,4 [Millipore, Bedford, MA] fortyndet 1:10 i sterilt vand, 0,02% natriumazid [Sigma], og 0,1% natriumdodecylsulfat [SDS] med 1 mM PMSF og 10 pi / ml PIC indsættes umiddelbart før brug.
    4. Pelletere cellerester ved mikrocentrifugering ved 2.000 xg i 10 min. Saml supernatanten (herefter benævnt "lysat").
    5. Tilsæt 1 mg lysat protein til anti-GFP coatede perler, bringe slutvolumenet til 1 ml med 1X RIPA + puffer og inkuberes blandingen med ende-over-ende rotation i 1 time ved 4 ° C. Bemærk: peptid konkurrence undersøgelser kan 1 mg af Lysate protein præinkuberet med 2 ug SMRwt eller SMRmut peptid i 1 ml 1X RIPA + buffer, forud for at blive føjet til anti-GFP overtrukne perler.
    6. Vask perlerne gennem resuspension i 1 ml vaskebuffer (50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM NaCI og 0,1% Tween 20). Inkuber med ende-over-ende rotation i 5 min ved 4 ° C. Adskille perlerne from vask ved hjælp af magnetisk separation Stand. Vaske perlerne en anden og tredje gang med vaskebuffere indeholdende 250 mM og 300 mM NaCl, hhv.
    7. Resuspendere perlerne i 200 pi PBS, overføre blandingen til et rent glas og adskille perlerne fra vask på magnetisk stativ. Kog perlerne i 50 pi af Laemmli prøvepuffer 5 minutter ved 95 ° C, lad blandingen afkøle i 10 minutter ved stuetemperatur, og derefter placere blandingen på den magnetiske stativ til separation, og indsamle supernatanterne ("Eluaterne") .
    8. Adskille proteinerne i eluatet ved SDS-PAGE på en 8-16% Tris-HCI Kriterium færdigstøbte gel.
  3. Massespektrometri
    1. Excise proteinbåndene af interesse fra Coomassie-farvede geler.
    2. Reducer prøverne i 10 mM 1,4-dithiothreitol (DTT) i 45 minutter ved 37 ° C.
    3. Alkylere prøverne i 55 mM iodacetamid i 45 minutter ved 25 ° C.
    4. Fordøje prøverne natten over med sekventering klasse prøvepsin (Promega) ved 37 ° C.
    5. Afsalte prøven peptider med C-18 ZipTip (Millipore). Prøven blandes peptider med alfa-CHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), og spotte dem på en MTP målramme III (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA).
    6. Udfør tandem matrix-assisteret laser desorption / ionisering tid-flyvning (MALDI-TOF/TOF) massespektrometri analyse ved hjælp af en Bruker Daltonics Ultraflex III TOF / TOF.
    7. Sammenlign MS / MS data til NCBI ikke-redundante og Swiss-Prot databaser ved hjælp af Mascot algoritmen ( www.matrixscience.com ).
  4. Immunoblotanalyse
    1. Adskil proteinprøver ved SDS-PAGE på 4-20% eller 8-16% Tris-HCI Criterion færdigstøbte geler (Bio-Rad). Overfør båndene elektroforetisk til en nitrocellulosemembran.
    2. Vask membranen i Tris bufferet saltvand (TBS, Bio-Rad) i 5 min. Bloker med 5% skummetmælk i TTBS (TBS med 0,1% Tween 20) i 1 time ved omrystning ved stuetemperatur.
    3. Behandl membran til immunoblotting med et specifikt primært antistof i 5% skummetmælk med rystning ved 4 ° C natten over. Vask i TTBS i 20 minutter efterfulgt af en sekundær konjugeret IgG (H + L)-antistof i 5% skummetmælk i 1 time ved stuetemperatur. Vask i TTBS i 30-60 min.
    4. Detektere proteinbånd ved Western Blotting Luminol Reagent (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, Californien). Udsætte filteret til fotografisk film. Bemærk: I nogle eksperimenter blev en stripning reagens, der anvendes til at strippe membranen (Pierce, Rockford, IL) med efterfølgende hybridisering med en anden primær og sekundær antistof.
    5. Scan X-ray film til Adobe Photoshop 5.0.2. Udfør densitometrianalyse hjælp ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

II. Anvendelse af antistof Hæmning i Functional Analysis

II.1. Co-transfektion af antistofferneerne ved hjælp af Chariot Protein Delivery Reagent Kit

  1. Pr transfektion reaktionsblandingen, fortyndes 1 ug wtNef-GFP plasmid-DNA og 1 ug af enten anti-Mortalin antistof eller anti-α-tubulin antistof, til et endeligt volumen på 100 gl med 1X PBS. Bemærk: Det blev tidligere fastslået, at co-transfektion af anti-α-tubulin antistof har ingen påviselig virkning på exNef sekretion, og dermed er det fungerer som en effektiv negativ kontrol i disse forsøg.
  2. Fortynd 6 pi ufortyndet Chariot Reagent til et endeligt volumen på 100 gl med sterilt vand, og blandes med det fortyndede DNA-antistof mix.
  3. Inkuber ved stuetemperatur i 30 minutter for at tillade dannelse af Chariot / DNA-antistof-komplekset.
  4. Pellet 3 x 10 5 Jurkat-celler ved centrifugering ved 600 xg i 5 min.
  5. Vask cellerne to gange med 1X PBS, og resuspender i Chariot / DNA-antistof-komplekset.
  6. Tilsæt 400 ul serum-frit RPMI 1640 medium til suspensionen, og inkuberes calen i dyrkningsplader ved 37 ° C i 2 timer.
  7. Tilsæt 1 ml frisk RPMI 1640 medium indeholdende 10% FBS til hver plade, og inkuber cellerne i 48 timer ved 37 ° C.

II.2. Nef-GFP Sekretion Fluorescerende Plate Reader Assay af antistof Inhibition

  1. Saml de cellefrie konditionerede medier fra de høstede celler, og overføre 100 pi til individuelle brønde i en 96-brønds sort mikrotiterplade.
  2. Mål GFP-fluorescens i medierne på en Tecan GENEios fluorimeter med excitationsbølgelængde 485 nm og emission bølgelængde 515 nm i relative fluorescerende enheder.
  3. Indstil niveauet af GFP-fluorescens i kontrolgruppen (medier fra celler co-transficeret med Nef, GFP og anti-α-tubulin antistof) på 100%.
  4. Sammenlign dette til det niveau af GFP-fluorescens i medierne fra celler co-transficeret med anti-Mortalin antistof at bestemme ændringer i Nef-GFP sekretion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kortlægning Biologisk Funktionelle Motiver hjælp peptider. To regioner blev identificeret på Nef proteiner, der inducerer apoptose. Peptid-drevet apoptose blev observeret (figur 2), der begynder med peptid N50 (AA30-50) og toppede på N60 (aa40-60) og N70 (aa50-70), og aftagende til baggrundsniveau på peptid N100 (aa80-100). Den største Motif 1 (M1) top, centreret om aa50-60, inducerer> 80% af de apoptotiske niveauer i fuld længde Nef-protein. En anden, mindre apoptotisk top blev observeret spænder peptider N180 (AA160-180) og N190 (aa170-190). Denne mindre Motif 2 (M2) top, centreret på aa170-180 inducerer ~ 30% af de apoptotiske niveauer af fuldlængde Nef-protein 16.

Kompetitiv inhibering Analyse hjælp Peptider. I figur 3, væsentligt peptider indeholdende en intakt SMR inhiberet exNef sekretion. Dette var sandt, om motivet var placeret ved N-terminalen (Wildtype-1) eller midt (vildtype-2) af peptidet, eller blev kopieret i peptidet (vildtype-3). Alternativt, alanin-substitution af enhver aminosyre af motivet, uanset motivets position eller nummer i peptidet, ophævede peptidets funktion 18. En 11-amino-syre scrambled version af Nef er apoptotisk Motif 1 (SM1), tidligere beskrevet 14 og opnået fra Sigma Genosys, blev anvendt som en negativ kontrol og havde ingen effekt på exNef sekretion. Se Tabel 1 for en liste over de peptidsekvenserne.

Isolating Motiv Bindende Partners Brug Peptider som Bait. Figur 4A viser co-immunfældning af fire proteiner ved SMRwt peptid (60, 65, 75, og 250 kDa). Den negative kontrol SMRmut peptid ikke fange disse proteiner, og disse proteiner ikke uspecifikt interagere med affinitet harpiksen i fravær af peptid, hvilket antyder, at co-immunpræcipiterede proteiner blev interagerespecielt med SMR motiver af SMRwt peptid. Disse proteiner blev efterfølgende identificeret ved MALDI-TOF tandem massespektrometri (se figur 4B for et repræsentativt udsnit) og verificeret af immunoblotanalyse 18.

Anvendelse af antistof Hæmning i Functional Analysis. Hæmning med anti-Mortalin antistof helt afskaffet exNef sekretion (figur 5). Dette bekræftede, at en intakt Nef / Mortalin interaktion er nødvendig for exNef sekretion. Desuden er det antyder kraftigt, at den mekanisme, hvormed SMRwt peptidet hæmmer exNef sekretion er gennem afbrydelse af denne interaktion ved direkte konkurrence om Mortalin 18.

Tabel 1
Tabel 1. Panel of SMR peptider udviklet og testet for deres virkning på Nef-induceret exNef sekretion. Denne fanele blev oprindeligt udgivet i Shelton et al., JVI 2012 18.. I tidligere undersøgelser, signifikant alanin-erstatning af enkelte aminosyrer i SMR motiv reduceres eller afskaffes, Nef-induceret sekretion 18. Virus isoleret fra langsigtet nonprogressor udtrykte en variant af Nef med isoleucin i stedet for V66,. En af de få rapporterede variationer i højt bevarede SMR motiv 20 Klik her for at se større tabel .

Figur 1
Figur 1. Effekter af Nef exosomes om vigtige immune celletyper. Denne model viser exNef frigivet fra inficerede celler, og det er forudsagt effekter på monocytiske celler og lymfatisk celler, der ville føre til AIDSpatogenese. AICD, aktivering induceret celledød. I. inficeret celle udgivelser virus, normale exosomes og exNef. exNef aktiverer uaktiverede, uinficerede monocytter (B). Aktiveringen af monocytter (C) resulterer i ændringer i genekspression fører til stigninger i den inflammatoriske tilstand og resultere i aktivering og udtømning af CD4 + og CD8 + T-celler. II. Inficeret celle udgivelser virus, normale exosomes og exNef. exNef aktiverer uaktiverede, inficerede lymfocytter (D). De aktiverede lymfocytter (E) undergår genekspression ændringer, som resulterer i AICD resulterer i en apoptotisk celle (F). Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Peptide scanning analyse af HIV-1 Nef protein til apoptotisk motiv (r). Et sæt af 20mer peptider, hver med 10 aminosyrer overlap, spænder over 205 aminosyrer af KNFS Nef proteinet blev opnået fra AIDS Reagent Program og anvendes i kortlægning af Nef apoptotiske domæner. Dette tal blev oprindeligt udgivet i Huang et al., JVI, 2004 13. Y-aksen viser procentdelen af ​​celler, der er TUNEL mærket, og X-aksen angiver behandlingen tilstand. Fuld Nef protein [Nef], ubehandlede celler [UT] eller peptiderne starter med Aa1-20 [N20] og slutter med AA190-205 [N205]. Fejlsøjler betegne standard målefejl, og resultaterne er en samling af mindst 3 uafhængige forsøg. Toppene af apoptose er angivet med Motiv 1 og Motif 2.

Figur 3
Figur 3. SMRwt peptidet hæmmer exNef. Peptider indeholdendeén eller flere vildtype Nef SMR sekvensmotiver inhiberede sekretionen af ​​exNef, mens alanin-erstatning af enhver animo syre af denne region stærkt reduceret peptidet effektivitet. Dette tal blev oprindeligt udgivet i Shelton et al., JVI, 2012 15. Dyrkningsmedier fra Jurkat T-celler, co-transficeret med en Nef-GFP-klon og forskellige SMR peptider, blev analyseret for exNef sekretion. Mængden af ​​GFP-fluorescens målt svarer til mængden af ​​exNef-GFP i de ekstracellulære medier. Statistisk signifikans blev bestemt under anvendelse af en uparret t-test. Virkningen på exNef sekretion af forskellige peptider blev sammenlignet med den af ​​et tilfældigt kodede peptid kontrol (SM1, * p-værdi <0,05, ** p-værdi <0,01, *** p-værdi <0,001).

Figur 4
Figur 4.. Den SMRwt peptid interagerer specifikt værtscelleproteiner, herunder mor talin. (A) Proteiner fra Jurkat T-celler blev co-immunpræcipiteret med enten SMRwt eller SMRmut peptider under anvendelse af anti-FLAG-M2-antistof-koblede affinitetsharpiks. Bemærk at både SMRwt og SMRmut brugt her har en FLAG-tag-sekvens indlejret i peptiderne. Dette tal blev oprindeligt udgivet i Shelton et al., JVI, 201215. Denne procedure blev gentaget i fravær af enten peptid som en kontrol for ikke-specifikke interaktioner med affinitet harpiks. Coomassie blåfarvet afbilledet gel viser proteiner med molekylvægte på 60, 65, 75 og 250 kDa (pilespidser) trykkes ned ved SMRwt, der ikke trækkes ned af den SMRmut peptidet eller uden peptid. (B) Den 75-kDa band blev udskåret fra gelen, trypsin-spaltet, og analyseret ved MALDI-TOF tandem massespektrometri. MS / MS Ion Søgning identificeret de 75-kDa som Mortalin. Pile angiver sekvenserne af de tilsvarende peptider.large.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur

Figur 5
Figur 5. Mortalin antistof hæmning blokke exosome sekretion. Extracellulære dyrkningsmedier fra Jurkat-celler, co-transficeret med en Nef-GFP-klon og antistoffer mod enten Mortalin eller α-tubulin, blev analyseret for exNef sekretion. Sammenlignet med effekten af ​​et antistof mod et protein, der ikke er involveret i exNef sekretion (α-tubulin), forstyrrelse af Mortalin aktivitet ved sin antistof resulterede i fuldstændig afskaffelse af exNef sekretion. Statistisk signifikans blev bestemt ved uparret t-test, som sammenligner exNef sekretion i nærværelse af Mortalin antistoffet versus α-tubulin antistof (*** p-værdi <0,001). Dette tal blev oprindeligt udgivet i Shelton et al., JVI 2012 18..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forstå de mekanismer, der ligger til grund Nef evne til at manipulere exosomal trafficking vej vil være nyttige i tekniske hidtil ukendte inhibitorer af exNef sekretion. Hæmning af exNef sekretion bør mindske CD4 T-celle depletion og CIA at drive HIV / AIDS patogenese. Til dette mål, har vi udviklet en række nye reagenser og metoder, tilladt os at analysere genetik exNef sekretion, og begynde at bestemme de cellulære involverede proteiner. Denne fremgangsmåde førte også til udviklingen af ​​den første inhibitor til direkte målrette exNef sekretion, den SMRwt peptid.

En central konklusion af vores arbejde er, at specifikke korte peptider afledt fra motiver fundet i proteiner i fuld længde, i vores tilfælde HIV-1 Nef, ikke blot bevarer deres biologiske funktion, men kan også kompetitivt at inhibere funktionen af ​​fuldlængde-proteinet. Fordi disse peptider bevarer deres biologiske funktion, kan de anvendes til at identificere funktionelle domæneri fuld længde proteinet. To ting kræves: generering af peptider, der scanner proteinet af interesse enten hele sin længde eller et område af proteinet menes at indeholde det funktionelle domæne, og et assay til at teste den biologiske funktion pågældende. Da vi manglede oplysninger, som ville tillade os indsnævre vores søgen efter apoptoseinducerende motiver til bestemte regioner af Nef, brugte vi et sæt af peptider scanning hele dens længde. Selv om denne proces blev gjort enklere ved Nef relativt lille størrelse, har vi også anvendt denne metode til større (> 75 kDa) proteiner. En veletableret assay til måling af apoptose (TUNEL) blev anvendt til at identificere peptider bevarer den biologiske funktion af interesse, i dette tilfælde, Nef-induceret apoptose af CD4 T-celler. Interessant, den efterfølgende analyse i den oprindelige papir viste, at de identificerede apoptotiske peptider bibeholdt> 80% af den biologiske aktivitet af den fuldlængde-Nef-protein, og inhiberes kompetitivt CXCR4 bindendeaf dets naturlige ligand SDF-1α.

Ligeledes en kort peptid indeholdende SMR motiv af Nef bevaret sin biologiske evne til at interagere med cellulære proteiner involveret i exNef sekretion. Men i dette tilfælde tilbageholdelse af aktivitet ikke føre til mimicry en Nef funktion, som det var tilfældet med apoptose induktion, men førte i stedet til hæmning. Fordi SMRwt peptidet effektivt bundet de SMR-bindingssteder af disse cellulære proteiner, det forstyrrede deres samspil med Nef, og dermed forhindrede Nef s sekretion i exosomes. Da Nef motiv af interesse var kendt fra tidligere genetiske kortlægning studier, var vi i stand til at begrænse peptid udvikling til variationer af SMR. I stedet for at identificere nye funktionelle motiver, brugte vi disse peptider, og en tidligere udviklet fluorescens-baserede assay til måling exNef sekretion, at godtgøre, at SMR rolle i exNef sekretion var knyttet direkte til dens specifikke primære sekvens.

hiv-1, Human Protein Interaction Database lister mere end 60 cellulære proteiner, der interagerer direkte med Nef og muligvis så mange som 200, der interagerer direkte eller indirekte 19. Ved at begrænse sekvensen af ​​vores agn protein til motivet af interesse, undgik vi at skulle gå igennem de snesevis af proteiner, der ville være blevet co-immunpræcipiteret af fuldlængde Nef-protein. De fleste af disse proteiner, mens specifik for Nef, ikke ville være bindende partnere for Nef s SMR, og vil således udgøre baggrund / støj. En konservativ beregning er, at vi har reduceret støj ved 15x (60/4). I det væsentlige, effektivt vores tilgang øget signal-støj-forholdet ved at minimere baggrund på grund af off-site, eller i vores tilfælde off-motiv binding, tillader os at identify proteiner, der specifikt binder SMR. Men det er muligt, ved hjælp af denne metode, er det ikke lykkedes at indfange alle SMR-bindende cellulære proteiner, især dem, der kræver interaktion med både SMR og en anden motiv til at binde Nef, eller dem, hvis binding er afhængig af sekundær eller tertiære struktur.

Mortalin, en cellulært protein co-immunpræcipiteret af SMRwt peptidet, blev vist at være nødvendige for exNef sekretion af miRNA knockdown og antistof hæmning. Førstnævnte er en veletableret teknik, der reducerer eller eliminerer ekspression af det målrettede protein. Derimod er antistof hæmning ikke påvirke protein-ekspressionsniveauer, men i stedet fysisk hæmmer målrettede proteins interaktion med andre proteiner. Vi brugte denne anden metode til at påvise betydningen af ​​Nef-Mortalin interaktion for exNef sekretion. Antistof hæmning er en straight-forward procedure, der kræver en fremgangsmåde til indføring af antistoffeti cellen, og et assay til at teste dens virkning på den biologiske funktion pågældende. Vi bruges Chariot Protein Delivery Reagent til shuttle anti-Mortalin antistoffer i cellen, og den førnævnte fluorescens-baseret assay at måle ændringer i exNef sekretion. Ligesom de fleste antistof-baserede procedurer, er effektiviteten af ​​antistof hæmning begrænset af affinitet og specificitet af antistoffet til målrettet protein.

Et vigtigt mål for HIV-forskning er udvikling af nye lægemidler og identifikation af potentielle mål for terapi. De her beskrevne procedurer udnytte specifikke korte peptider, der bevarer deres biologiske funktion og kompetitivt kan inhibere funktionen af ​​proteiner i fuld længde, for at fremskynde denne proces. Mens de beskrevne eksperimenter blev rettet mod at forstå en nøgle HIV funktion, bør de anvendte teknikker anvendes til studiet af protein-protein interaktioner og udvikling af peptid-baseredehæmmere i flere områder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Research Alliance finansiering tilskud GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA tilskud F31AI091484, Emory CFAR tilskud P30 A1050409. Denne undersøgelse blev gennemført i et anlæg bygget med støtte fra Research Facilities Improvement Grant # C06 RR18386 fra NIH / NCRR. Jurkat-celler, det sæt af 20 HIV-1-Nef-peptider, såvel som kanin-anti-HIV-1 Nef antiserum blev opnået fra NIH AIDS Research & referencereagens Program (Rockville, MD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20mer peptide set with 10 amino acid overlap NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 4641
TUNEL Assay Roche 11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent Active Motif 30100
Tecan GENEios fluorimeter (Tecan Group, Switzerland)
96-well black microtiter plate Corning 3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
Dynabeads Protein G magnetic beads Invitrogen 100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) Promega Corp., Madison, WI Z5332
C-18 ZipTip Millipore ZTC18S096 C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution
MALDI TOF/TOF Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen? Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
  2. Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
  3. Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).
  4. Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).
  5. Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).
  6. Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).
  7. Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).
  8. Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).
  9. Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).
  10. Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).
  11. Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
  12. Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).
  13. Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).
  14. Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).
  15. James, C. O., Huang, M. -B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).
  16. Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).
  17. Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).
  18. Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).
  19. Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).
  20. Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).

Tags

Virology Biokemi Immunologi infektion smitsomme sygdomme molekylær biologi medicin genetik mikrobiologi Genomics proteiner exosomer HIV peptider exocytose protein menneskesmugling sekretion HIV-1 Nef Sekretion Ændring Region SMR peptid AIDS assay
Peptid-baserede identifikation af funktionskravene motiver og deres bindingspartnere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali,… More

Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S., Johnson, K., Roth, W., Powell, M., Bond, V. Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners. J. Vis. Exp. (76), e50362, doi:10.3791/50362 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter