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Immunology and Infection

Peptid-basierte Identifizierung von Functional Motive und ihre Bindungspartner

Published: June 30, 2013 doi: 10.3791/50362
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology, Biochemistry, & Immunology, Morehouse School of Medicine, 2Institute for Systems Biology, 3Advanced Medical & Dental Institute, Universiti Sains Malaysia

Summary

Techniken, um die Mechanismen der Sekretion von HIV-1 Nef in exosomes zerlegen beschrieben. Spezifische kurze Peptide von Nef-Protein und Transfektion abgeleitet wurden genutzt, um die Struktur, Funktion und Bindungspartner von Nef die Sekretion Modification Region bestimmen. Diese Verfahren haben allgemeine Bedeutung in vielen mechanistischen Studien.

Abstract

Spezifische kurze Peptide von Motiven in vollständigen Proteine ​​gefunden, in unserem Fall HIV-1 Nef abgeleitet behalten nicht nur ihre biologische Funktion, kann aber auch kompetitiv hemmen die Funktion des Proteins vollständiger Länge. Ein Satz von 20 Nef Abtastung Peptide, 20 Aminosäuren lang mit jeweils überlappenden 10 Aminosäuren seines Nachbarn, wurden verwendet, um Motive in Nef verantwortlich für die Induktion der Apoptose zu identifizieren. Peptide, die diese apoptotischen Motive induziert Apoptose in Mengen vergleichbar mit der Volllängen-Nef-Protein. Ein zweites Peptid, aus dem Sekret Modification Region (SMR) von Nef abgeleitet behielten die Fähigkeit, mit zellulären Proteinen in Nef-Sekretionssystem in exosomes (exNef) beteiligt interagieren. Diese SMRwt Peptid wurde als "Köder"-Protein in Co-Immunopräzipitation Experimenten an zelluläre Proteine, die spezifisch an das Nef SMR Motiv zu isolieren. Protein-und Antikörper-Transfektion Hemmung wurde verwendet, um physisch stören die Interaktion Wetteschen Nef und Mortalin, einer der isolierten SMR-bindende Proteine, und der Effekt wurde mit einem Fluoreszenz-basierte exNef Sekretion-Assay gemessen. Die SMRwt Peptid die Fähigkeit, in voller Länge Nef für zelluläre Proteine, die die SMR Motiv binden outcompete, treffen es die erste Inhibitor des exNef Sekretion. Somit kann durch Verwendung der hier beschriebenen Techniken, die die einzigartigen Eigenschaften von bestimmten kurze Peptide von Motiven in voller Länge Proteinen abgeleitet nutzen, kann eine Beschleunigung der Identifizierung funktioneller Motive in Proteinen und die Entwicklung von Peptid-basierten Inhibitoren von pathogenen Funktionen.

Introduction

Mit dem Aufkommen der antiretroviralen Therapie, hat die AIDS-Epidemie in der westlichen Welt wurde verlangsamt, aber nicht eingeschränkt, und die Ausbreitung von HIV nach wie vor eine große gesundheitliche Belastung auf der ganzen Welt sein. Mit Ausnahme der geringfügig wirksam RV144 Thai-Studie, haben HIV-Impfstoffe bisher fehlende vor Infektionen zu schützen gezeigt. Somit ist die Erforschung zusätzlicher, potentielle therapeutische Targets noch gerechtfertigt.

Zusammen mit CD4 T-Zell-Depletion ist anhaltenden generalisierten Aktivierung des Immunsystems ein Markenzeichen der HIV-Infektion. Diese chronische Aktivierung Immune (CIA) führt in die Zellerneuerung aktiviert und differenziert lymphatischer Subpopulationen zelluläre Seneszenz und Erschöpfung, und die Tötung von T-Zellen und B-Zellen über Aktivierungs-induzierte Zelltod (AICD) 1,2,3 erhöht, und es ist bekannt als einer der stärksten Prädiktoren der Krankheitsprogression 4,5,6,7,8,9,10,11,12 gegründet. Doch die Mechanismen zugrunde CIA und CD4T-Zell-Depletion bei HIV-Infektionen bleiben vollständig aufgeklärt werden.

Evidence aus unserem Labor und andere führte uns zu einem Vorbild für Krankheitsprogression (Abbildung 1), wobei das HIV Protein Nef (Negative Regulatory Factor) induziert die Sekretion in Exosomen von HIV-1-infizierten Zellen 13,14. Diese Nef enthaltenden Exosomen (exNef) Apoptose in einer Anzahl von Zelllinien, einschließlich nicht-infizierten CD4 T-Zellen 15,16. Alternativ kann in Monozyten / Makrophagen exNef ändert Genexpressionsmuster, zB Cytokin-Expression und scheint einen Zustand der Zeitplan Aktivierung des Immunsystems zu induzieren. Dieser Körper des Beweises schlägt eine wichtige Rolle für exNef in CIA und CD4 T-Zell-Depletion.

Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen Nef die Fähigkeit zu manipulieren die exosomalen Menschenhandel Weg wird in der Technik neuartige Inhibitoren der exNef Sekretion nützlich. Hemmung der Sekretion exNef sollte vermindern die CD4 T-Zell-DepletionCIA und die Fahrt HIV / AIDS Pathogenese.

Um die Beweise dafür, dass unser Modell für HIV / AIDS Krankheitsverlauf und die nachfolgenden Daten, die auf diesem Modell zu bauen, führte zu sammeln, haben wir eine Reihe neuer Reagenzien und Methoden, die uns die Genetik der exNef Sekretion analysieren erlaubt, und fangen an, die bestimmen, zelluläre Proteine ​​beteiligt. In der ersten Arbeit, fanden wir, dass Nef-Protein Apoptose in Bystander-Zellen induziert und extrazellulär von Nef-transfizierten und HIV-infizierten Zellen freigesetzt 15. Peptide, die von SDF-1α (Stromazellen abgeleiteten Faktor-1, zu alternativem Spleißen alpha) abgeleitet wurde zuvor gezeigt, dass viel von der Bindung und Signalisierung Aktivität des Volllängenmolekül 17 beizubehalten. Wir spekuliert, dass Peptide Nef könnten einige der apoptotischen Aktivität des vollständigen Proteins, und dass diese Peptide zwangsläufig enthalten Nef apoptotischen Domäne (n) zu halten. Um diese Peptide zu identifizieren und damit das Nefapoptotischen Domain (s), erhalten wir eine Reihe von 20 HIV-1 Nef Scannen Peptide aus dem NIH AIDS Forschung und Reference Reagent Programm. Diese 20-aa Peptide, jeweils überlappenden 10 Aminosäuren von seinem Nachbarn, durch die Anzahl ihrer letzten Aminosäure, dh N20 Spannweiten Nef Aminosäuren 1-20, N30 Spannweiten Nef Aminosäuren 11-30, etc 16 benannt. Wir fanden, dass T-Zellen Aussetzen extrazellulär um spezifische Peptide überlappenden zwei verschiedene 10-aa-Domänen in der full-length Nef-Protein induziert Apoptose in diesen Zellen. Eine anschließende Analyse dieser Nef-abgeleiteten Peptide zeigten apoptotische ihre Fähigkeit, physisch mit den Chemokinrezeptor CXCR4 auf der Oberfläche von T-Zellen, mit Bindungskinetik, dass diese Peptide kompetitiv hemmen zwischen CXCR4 und ihre natürlichen Liganden SDF-1α-Bindung erlaubt interagieren. Schließlich wurde das Nef-abgeleiteten Peptide apoptotischen 'Interaktion mit CXCR4 gefunden, um eine Stress-Reaktion in dieser T-Zellen führt zu Apoptose zu induzieren. Diese Beweise konnten wir quickly Karte Nef die funktionellen Domänen, ein Prozess, der viel länger gedauert haben, mit Standard-DNA-Techniken wie erbgutverändernd Alanin-Scanning-Mutagenese. Es zeigte auch, dass diese kurze Nef-abgeleitete Peptide die biologische Funktion der apoptotischen Domänen in dem Protein voller Länge erhalten.

Nach der Identifizierung eine Rolle für extrazelluläre Nef, dh Apoptose von T-Zellen, suchten wir ein besseres Verständnis davon, wie Nef wurde aus Zellen abgesondert. Mittels einer Reihe von mutierten Konstrukte Nef, wir abgebildet hochkonservierten Nef-Protein Motive in den N-terminalen Regionen von sowohl HIV Nef und seine Rhesusaffen entspricht SIV Mac ​​(Simian Immunodeficiency Virus) Nef, die kritisch für exNef Sekretion 13 sind. Eines dieser Motive, die Sekretion Modification Region (SMR; 66VGFPV70), war besonders kritisch, da Alanin Ersatz eines seiner fünf Aminosäuren entweder stark reduziert oder abgeschafft exNef Sekretion. Wenn die Zellen über Active Motif der C geliefertHariot Protein Lieferung Reagenz, ein Peptid, das die SMR an einem FLAG-Peptid-Sequenz (SMRwt) wurde festgestellt, dass exNef Sekretion sowohl von Nef-transfizierten und HIV-infizierten Zellen 18 hemmen. Basierend auf unseren bisherigen Erfahrungen mit Peptiden, beschlossen wir, dieses Peptid zu verwenden, um die Moleküle und Mechanismen der Nef SMR Rolle in exNef Sekretion aufzuklären.

Mit dem SMRwt Peptid als unsere "Köder-Protein", wir co-immunpräzipitiert zellulären Bindungspartner des SMR von infizierten T-Zell-Lysaten 18. Die FLAG-Peptid-Sequenz bot eine bequeme Handhabe für die Erfassung der SMRwt Peptid mit anti-FLAG Affinitätsharz. Unsere bisherigen Feststellung, dass eine einzige Mutation Valin im SMRwt Peptid Alanin ausreichend für die Abschaffung ihrer Hemmung der Sekretion exNef identifiziert eine komfortable, sehr spezifische Kontrolle Peptid (SMRmut), die wir verwendet, um auszuschließen, Co-immunpräzipitierten Proteine ​​nicht spezifisch für die SMR. Verwendung eines Peptids mit der specific Domäne von Interesse anstatt der Volllängenprotein erlaubt uns, das Screening von Dutzenden von zellulären Faktoren, die zu anderen Domänen in Nef 19 binden zu umgehen.

Sobald wir identifizierten die SMR-Bindungspartner, ein logischer nächster Schritt war es zu zeigen, dass die identifizierten zellulären Bindungspartner wichtig sind für die biologische Funktion 18. Das Standardverfahren dies zu tun ist, um Knockdown Protein-Ebene mit Zielprotein-spezifische miRNA oder siRNA, und anschließend Assay die Auswirkungen auf die biologische Funktion. Wir führten miRNA Knockdown, die Übersetzung der Ziel-mRNA inhibiert, Senkung der Produktionskosten des Ziels, in diesem Fall ein SMR-bindendes Protein. Diese Verringerung des Zielproteins ist eine indirekte Wirkung und gegebenenfalls eine verzögerte Wirkung auf die biologische Funktion des Zielproteins eine Rolle spielt in. Folglich haben wir auch die weniger häufig Antikörper Hemmung Technik eingesetzt werden, um festzustellen, ob direkt durch Stören der Aktivitätdas Zielprotein verringert oder beseitigt die biologische Funktion. In diesem Verfahren erhöht Antikörper gegen das Zielprotein in der Zelle unter Verwendung Chariot Reagenz transfiziert und interagieren direkt mit dem Zielprotein entweder Maskierungsmittel es von seinem Ort der Funktion oder Sperrung der entsprechenden bindenden Domäne. Die Hemmung des Zielproteins durch dieses Verfahren direkt stört ihre Funktion und kann RNA Knockdown Verfahren durch weitere Bestätigung der Bedeutung des Zielproteins an das biologische Funktion ergänzen.

Während Chariot Reagenz ist wirksam bei der Bereitstellung von Peptiden und Proteinen in Zellen, das Verfahren ist zeitraubend und begrenzt die Arten von Experimenten, z. B. längere oder wiederholte Aufnahmen und in vivo Tierversuchen, die durchgeführt werden können. Folglich haben wir einen zellpenetrierendes Peptid (CPP)-Sequenz des Peptids SMRwt (SMRwt-CPP) 18, ein Peptid, das von Zellen aufgenommen könnten passiv zu generierenaus dem Kulturmedium. Diese Version war ebenso wirksam wie bei der Hemmung der ehemaligen exNef Sekretion.

Die Erkenntnisse aus dieser veröffentlichten Versuche demonstriert die Fähigkeit von kleinen Peptiden, die spezifische funktionelle Motive, um die Funktion des Proteins vollständiger Länge durch kompetitive Hemmung antagonisieren, und die Proteine, die diese Motive binden isolieren. Man würde erwarten, dass diese Techniken sollten in vielen experimentellen Protokolle nützlich. Sie sollten auch wirksam in der Technik neue Peptid-Inhibitoren vieler zellulärer Prozesse, eine Funktion, die weiter verbessert werden durch Bindung an CPP-Sequenzen.

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Protocol

I. Verwendung von kurzen Peptiden in biologischen Analyse

I.1. Mapping biologisch funktionelle Motive unter Verwendung von Peptiden

  1. Die Behandlung von Zellen mit Nef Scannen Peptide
    1. Beschaffen eines Satzes von Peptiden, Abtasten des Bereichs von Interesse. Für unsere Experimente 20mer Peptide mit 10 Aminosäuren überlappen, überspannen die gesamte HIV-1 Nef-Protein (205 aa) wurden von der AIDS-Reagenz-Programm erhalten. Die Peptide werden einzeln wie folgt getestet:
    2. In 10 ng / ml des Peptids zu dem Zellkulturmedium.
    3. 10 ml Kulturmedium pro Platte auf Zellkulturen Jurkat.
    4. Inkubieren Kulturen für 24 Stunden bei 37 ° C.
  2. Klemme deoxynucleotidyltransferase-vermittelte dUTP Nick End Biotin Labeling (TUNEL)-Assay von Apoptose
    1. Waschen der Zellen mit PBS 1X und befestigen für 30 min bei Raumtemperatur mit 4% Paraformaldehyd in 1 × PBS, pH 7,4.
    2. Waschen mit 1 × PBS und Permeabilisierung mit 0,1% Triton X-100 für 10min bei Raumtemperatur.
    3. Spülen Sie die Zellen zweimal mit 1 × PBS.
    4. Graf gefärbten Zellen durch Epifluoreszenz auf einem Computer-gesteuerten System Mikroskopie.

I.2. Competitive Analysis Inhibition unter Verwendung von Peptiden

  1. Co-Transfektion von Peptiden mit Hilfe der Chariot Protein Lieferung Reagent Kit
    1. Per Transfektion Reaktionsmischung verdünnte 1 ug wtNef-GFP Plasmid-DNA und 100 ng entweder Wildtyp-Peptide aus der SMR-Domäne stammen, oder Peptide, die Alanin-Austausch einzelner Aminosäuren in der SMR-Motiv, mit einem Gesamtvolumen von 100 ul mit 1X PBS.
    2. Verdünnen 6 ul einer 1/10 Verdünnung von Chariot Reagenz zu einem Endvolumen von 100 ul mit sterilem Wasser, und verbinden sich mit der verdünnten DNA-Peptid-Mix.
    3. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min, um die Bildung des Wagens / DNA-Peptid-Komplex zu erlauben.
    4. Pellet 3 x 10 5 Jurkat Zellen durch Zentrifugation bei 600 xg für 5 min.
    5. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS 1X und Resuspension in der Chariot / DNA-Peptid-Komplex.
    6. In 400 ul serumfreiem RPMI 1640-Medium zu der Suspension und Inkubation der Zellen in Petrischalen bei 37 ° C für 2 Stunden.
    7. 1 ml frisches RPMI 1640-Medium mit 10% FBS zu jeder Platte, und Inkubieren der Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C.
    8. Ernten Sie die Zellen und bestimmen Transfektionseffizienz durch Fluoreszenz-Mikroskopie.
  2. Nef-GFP Sekretion fluoreszierenden Platte Leser-Test von Peptid-Hemmung
    1. Sammeln des zellfreien konditionierten Medien aus den geernteten Zellen und dann 100 ul in einzelne Vertiefungen einer 96-well Mikrotiterplatte schwarz.
    2. Measure GFP-Fluoreszenz in den Medien auf einem Tecan GENEios Fluorimeters mit Anregungswellenlänge 485 nm und Emissionswellenlänge 515 nm in relativen Fluoreszenzeinheiten.
    3. Stellen Sie das Niveau der GFP-Fluoreszenz in der Kontrollgruppe (Medien von Zellen mit Nef-GFP kotransfiziert und einen zerhackten Peptid) Bei 100%.
    4. Man vergleiche dies mit der Ebene der GFP-Fluoreszenz in den Medien von Zellen mit verschiedenen Peptiden SMR cotransfiziert, um Änderungen in Nef-GFP-Sekretion bestimmen.

I.3. Isolieren Motif Binding Partner unter Verwendung von Peptiden als Köder

  1. Co-Immunpräzipitation mit SMR Peptide
    1. Wachsen Jurkat-Zellen in RPMI 1640-Medium mit 10% FBS bei 37 ° C in einem T-75 Zellkulturflasche und Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Bestimmen Sie die Transfektionseffizienz, indem Sie die Platte unter einem Fluoreszenzmikroskop, Bilder aufnehmen und anschließend zählen die insgesamt und markierten Zellen und bestimmen die Prozent markierten Zellen.
    2. Zellpellet in 1 ml 1X PBS, und überträgt es auf einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Microcentrifuge bei 1.000 xg für 1 min. Das Pellet in 1 ml α-FLAG Lysis Puffer durch vorsichtiges Pipettieren. Lysepuffer: Mix 50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM Natrium chlorid [NaCl], 1 mM EDTA und 1% Triton X-100, mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF] und 10 ul / ml Protease Inhibitor Cocktail für die Verwendung mit Säugerzellen und Gewebeextrakten [PIC; Sigma]. Als unmittelbar vor dem Gebrauch.
    3. Unterschiedlich Mikrozentrifugengefäß die Suspensionen bei 2.000 xg für 5 min, und bei 13.000 g für 10 min zur Pelletierung der Zelltrümmer und DNA sind. Die überstehende Flüssigkeit (im folgenden als "Lysat" bezeichnet).
    4. 1 mg Lysat Eiweiß und 1 ug entweder der SMRwt oder SMRmut Peptid 20 ul anti-FLAG M2 Affinity Gel (im Folgenden als "Harz"; Sigma). Beachten Sie, dass sowohl SMRwt und SMRmut welche hier einen FLAG-Tag-Sequenz in den Peptide eingebettet haben. Bringen Sie die Mischung auf ein Gesamtvolumen von 1 ml in Co-IP-Puffer (α-FLAG Lysepuffer minus PMSF und PIC). Inkubieren der Mischung bei 4 ° C über Nacht mit end-over-end Drehung. Als negative Kontrolle inkubieren des Lysats mit dem Harz in Abwesenheit von entweder Peptid.
    5. Pellet das Harz durch Mikrozentrifugation bei 5.000 - 8.000 × g für 30 sek. Erlauben Harz für 2 min vor dem Umgang mit der Probe absetzen und dann den Überstand aspirieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Schmalspurbahn Ende Pipettenspitze oder einer Hamilton-Spritze, man aufpassen, nicht jede Harz übertragen. Narrow-End-Pipettenspitzen können mit einer Pinzette, um die Eröffnung eines Kunststoffpipettenspitze kneifen, bis es teilweise geschlossen ist. Das Harz viermal mit 500 ul Waschpuffer (50 mM Tris • HCl pH 7,4 und 150 mM NaCl). Eluieren der gebundenen zellulären Proteinen mit 15 ug 3X FLAG-Peptid (Sigma) in 50 ul Waschpuffer und Inkubation für Ventildeckel / Schüttler für 30 min bei Raumtemperatur.
    6. Konzentrieren Sie sich die Eluate durch Aceton Niederschlag, durch Kochen in Laemmli Probenpuffer (Bio-Rad) gefolgt. Trennen der Proteine ​​durch SDS-PAGE auf einem 4-20% Tris-HCl Kriterium vorgefertigte Gel (Bio-Rad). Färben Sie das Gel mit Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Hinweis: für die Massenspektrometrie Identifizierung Experimente (
  2. Co-Immunpräzipitation mit Nef-Protein GFP
    1. Mix 50 ul Dynabeads Protein G magnetischen Kügelchen (Invitrogen) mit 2 ug monoklonalen anti-GFP in 1 ml 1X PBS mit 0,02% Tween 20 (PBS-T). Inkubieren der Mischung mit end-over-end Drehung in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen für 1 Stunde bei 4 ° C.
    2. Trennen Sie die Perlen aus dem Puffer, indem das Röhrchen auf einem 1,5-ml Magnasphere Technologie Magnetic Separation Stand (Promega Corp, Madison, WI) ermöglicht magnetischen Pulldown gefolgt von der Entfernung des Überstandes. Waschen Sie die anti-GFP beschichteten Beads mit 1 ml PBS-T mit sanften Pipettieren.
    3. Lyse Nef-GFP transfizierten Jurkat-Zellen mit 1 ml RIPA + 1X Puffer durch vorsichtiges Pipettieren und Inkubation für 15 min auf Eis. RIPA Puffer +: 10X RIPA Lysis-Puffer, pH 7.4 [Millipore, Bedford, MA] 1:10 in sterilem Wasser, 0,02% Natriumazid [Sigma], und 0,1% Natriumdodecylsulfat [SDS], mit 1 mM PMSF und 10 ul / ml PIC hinzugefügt unmittelbar vor dem Gebrauch.
    4. Pellet die Zelltrümmer durch Mikrozentrifugation bei 2.000 × g für 10 min. Die überstehende Flüssigkeit (im folgenden als "Lysat" bezeichnet).
    5. 1 mg Lysat Protein zu den anti-GFP beschichteten Kügelchen, bringen das Endvolumen auf 1 ml mit 1X RIPA + Puffer und Inkubation der Mischung mit end-over-end Rotation für 1 Stunde bei 4 ° C. Hinweis: Für Peptid Wettbewerb Studien, 1 mg Lysate Protein kann mit 2 ug SMRwt oder SMRmut Peptid werden in 1 ml RIPA + 1X Puffer, bevor sie an den anti-GFP Kügelchen hinzugefügt vorinkubiert.
    6. Waschen Sie die Perlen durch Resuspension in 1 ml Waschpuffer (50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM NaCl und 0,1% Tween 20). Inkubieren mit end-over-end Drehung für 5 min bei 4 ° C. Trennen Sie die Perlen from die Wäsche mit dem Magnetic Separation-Stand. Waschen Sie die Perlen ein zweites und drittes Mal mit Waschpuffer mit 250 mM und 300 mM NaCl, beziehungsweise.
    7. Resuspendieren der Beads in 200 ul PBS, die Masse in ein sauberes Röhrchen, und trennen Sie die Perlen aus der Wäsche auf dem magnetischen Standfuß. Kochen Sie die Perlen in 50 ul Laemmli Probenpuffer 5 min bei 95 ° C, lassen Sie die Mischung für 10 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen, und legen Sie dann die Mischung auf dem magnetische Halterung für die Trennung, und sammeln Sie die Überstände ("Eluate") .
    8. Trennen der Proteine ​​im Eluat mittels SDS-PAGE auf einem 8-16% Tris-HCl Kriterium vorgefertigte Gel.
  3. Massenspektrometrie
    1. Steuerverwaltung die Proteinbanden von Interesse aus Coomassie-gefärbten Gelen.
    2. Reduzieren Sie die Proben in 10 mM 1,4-Dithiothreitol (DTT) für 45 min bei 37 ° C
    3. ALKYLAT die Proben in 55 mM iodoacetamide für 45 min bei 25 ° C.
    4. Verdauen die Proben über Nacht mit sequencing grade tryPSIN (Promega) bei 37 ° C.
    5. Desalt die Probe Peptide mit C-18 ZipTip (Millipore). Mischen Sie die Probe Peptide mit alpha-CHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), und sie vor Ort auf eine MTP Zielframe III (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA).
    6. Führen Tandem Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Zeit of-flight (MALDI-TOF/TOF)-Massenspektrometrie-Analyse unter Verwendung eines Bruker Daltonics ultraflex III TOF / TOF.
    7. Vergleichen Sie die MS / MS-Daten der NCBI nicht-redundante und Swiss-Prot-Datenbanken mit der Mascot-Algorithmus ( www.matrixscience.com ).
  4. Immunoblot-Analyse
    1. Abtrennung des Proteins Proben durch SDS-PAGE auf 4-20% oder 8-16% Tris-HCl Kriterium Fertiggelen (Bio-Rad). Übertragen der Bänder elektrophoretisch auf eine Nitrocellulose-Membran.
    2. Waschen Sie die Membran in Tris Buffered Saline (TBS; Bio-Rad) für 5 min. Blockieren mit 5% Magermilch in TTBS (TBS mit 0,1% Tween 20) 1 h unter Schütteln bei Raumtemperatur.
    3. Verfahren der Membran Immunoblot mit einem spezifischen primären Antikörper in 5% fettfreier Milch unter Schütteln bei 4 ° C über Nacht. Waschen in TTBS für 20 min durch einen sekundären HRP konjugierten IgG (H + L)-Antikörper in 5% fettfreier Milch für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Waschen in TTBS für 30-60 min.
    4. Erkennen die Proteinbanden durch Western Blot Luminol Reagenz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Setzen Sie die Filter, um fotografischen Film. Anmerkung: In einigen Experimenten wurde eine Stripping-Reagenz wurde verwendet, um die Membran (Pierce, Rockford, IL) mit anschließender Hybridisierung mit einem anderen primären und sekundären Antikörper abzustreifen.
    5. Scannen Sie die X-ray-Filme in Adobe Photoshop 5.0.2. Führen Densitometrie Analyse mit ImageJ Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

II. Verwendung von Antikörper Inhibition in Functional Analysis

II.1. Co-Transfektion von Antiköries mit dem Chariot Protein Lieferung Reagent Kit

  1. Per Transfektion Reaktionsmischung verdünnte 1 ug wtNef-GFP Plasmid-DNA und 1 ug entweder anti-Mortalin Antikörper oder anti-α-Tubulin-Antikörper, auf ein Endvolumen von 100 ul mit 1X PBS. Anmerkung: Es wurde zuvor festgestellt, dass die Co-Transfektion der anti-α-Tubulin-Antikörper keine nachweisbare Wirkung auf die Sekretion exNef hat, und dient somit als eine effektive negative Kontrolle in diesen Experimenten.
  2. Verdünnen 6 ul unverdünnt Chariot Reagenz zu einem Endvolumen von 100 ul mit sterilem Wasser, und verbinden sich mit der verdünnten DNA-Antikörper-Mix.
  3. Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min, um die Bildung des Wagens / DNA-Antikörper-Komplexes erlauben.
  4. Pellet 3 x 10 5 Jurkat Zellen durch Zentrifugation bei 600 xg für 5 min.
  5. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS 1X und Resuspension in der Chariot / DNA-Antikörper-Komplex.
  6. In 400 ul serumfreiem RPMI 1640-Medium zu der Suspension und Inkubation der cEllen in Petrischalen bei 37 ° C für 2 Stunden.
  7. 1 ml frisches RPMI 1640-Medium mit 10% FBS zu jeder Platte, und Inkubieren der Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C.

II.2. Nef-GFP Sekretion Fluorescent Assay Plate Reader von Antikörper Inhibition

  1. Sammeln des zellfreien konditionierten Medien aus den geernteten Zellen und dann 100 ul in einzelne Vertiefungen einer 96-well Mikrotiterplatte schwarz.
  2. Measure GFP-Fluoreszenz in den Medien auf einem Tecan GENEios Fluorimeters mit Anregungswellenlänge 485 nm und Emissionswellenlänge 515 nm in relativen Fluoreszenzeinheiten.
  3. Stellen Sie das Niveau der GFP-Fluoreszenz in der Kontrollgruppe (Medien von Zellen mit Nef-GFP und anti-α-Tubulin-Antikörper co-transfiziert) bei 100%.
  4. Man vergleiche dies mit der Ebene der GFP-Fluoreszenz in den Medien von Zellen, die mit anti-Mortalin-Antikörper cotransfiziert, um Änderungen in Nef-GFP-Sekretion bestimmen.

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Representative Results

Mapping biologisch funktionelle Motive unter Verwendung von Peptiden. Beiden Regionen wurden auf Nef Proteine, die Apoptose zu induzieren identifiziert. Peptid-driven Apoptose wurde (Abbildung 2) zu Beginn mit Peptid N50 (aa30-50) beobachtet, Höchststand bei N60 (AA40-60) und N70 (AA50-70), und der Abnahme in den Hintergrund Ebenen, auf Peptid N100 (aa80-100). Der große Motif 1 (M1) Spitze ausgerichtet auf AA50-60 induziert> 80% der Apoptoserate von der vollen Länge Nef-Protein. Eine zweite, kleinere apoptotischen Peak beobachtet überspannt Peptide N180 (aa160-180) und N190 (AA170-190). Dieser kleine Motiv 2 (M2)-Peak, auf AA170-180 zentriert, induziert ~ 30% der apoptotischen Ebenen voller Länge Nef-Protein 16.

Competitive Analysis Inhibition unter Verwendung von Peptiden. In Abbildung 3, Peptide, die eine intakte SMR signifikant gehemmt exNef Sekretion. Dies trifft zu, ob das Motiv am N-Terminus (Wildty befandPE-1) oder mittleren (Wildtyp-2) des Peptids, oder in dem Peptid (Wildtyp-3) dupliziert. Alternativ Alanin-Substitution einer beliebigen Aminosäure des Motivs, unabhängig von der Position Motiv oder eine Nummer in das Peptid, aufgehoben Funktion des Peptids 18. Ein 11-Aminosäure-Version des verwürfelten apoptotischen Motif NEF 1 (SM1), die zuvor beschrieben und 14 erhalten von Sigma Genosys, wurde als negative Kontrolle verwendet und hatte keine Wirkung auf exNef Sekretion. Siehe Tabelle 1 finden Sie eine Liste der Peptid-Sequenzen.

Isolieren Motif Binding Partner unter Verwendung von Peptiden als Köder. 4A zeigt die Co-Immunpräzipitation von vier Proteine ​​durch die SMRwt Peptid (60, 65, 75, und 250 kDa). Die negative Kontrolle SMRmut Peptid nicht erfassen diese Proteine ​​und diese Proteine ​​nicht unspezifisch mit der Affinität Harz in Abwesenheit von Peptid zu interagieren, was darauf hindeutet, dass die co-immunpräzipitiert Proteine ​​interagierenspeziell mit den SMR Motive der SMRwt Peptid. Diese Proteine ​​wurden anschließend durch MALDI-TOF-Tandem-Massenspektrometrie (siehe Abbildung 4B für eine repräsentative Stichprobe) identifiziert und verifiziert durch Immunoblot-Analyse 18.

Verwendung von Antikörper Inhibition in Functional Analysis. Inhibition mit anti-Mortalin Antikörper vollständig abgeschafft exNef Sekretion (Abbildung 5). Dies bestätigte, dass ein intakter Nef / Mortalin Interaktion für exNef Sekretion erforderlich ist. Darüber hinaus ist es stark darauf hin, dass der Mechanismus, durch den die SMRwt Peptid hemmt exNef Sekretion durch Unterbrechung dieser Interaktion durch direkte Konkurrenz für Mortalin 18 ist.

Tabelle 1
Tabelle 1. Panel of SMR Peptide entwickelt und hinsichtlich ihrer Wirkung auf Nef-induzierte Sekretion exNef getestet. Dieser Reiterle wurde ursprünglich in Shelton et al., JVI, 2012 18 veröffentlicht. In früheren Studien, Alanin-Austausch einzelner Aminosäuren des SMR Motiv deutlich reduziert oder abgeschafft, Nef-induzierte Sekretion 18. Virus von einer langfristigen nonprogressor isoliert ausgedrückt eine Variante von Nef mit einem Isoleucin anstelle des V66;. Einer der wenigen berichtet Variationen in der hoch konservierten Motiv SMR 20 Klicken Sie hier, um eine größere Tabelle anzuzeigen .

Abbildung 1
Abbildung 1. Auswirkungen von Nef exosomes über wichtige Immunsystem Zelltypen. Dieses Modell zeigt exNef aus infizierten Zellen freigesetzt, und es ist Auswirkungen auf Monozyten und Lymphozyten Zellen, die zu AIDS führen würde vorhergesagtPathogenese. AICD, Aktivierung induzierten Zelltod. I. infizierten Zelle Veröffentlichungen Virus normalen exosomes und exNef. exNef aktiviert aktivierten, nicht infizierte Monozyten (B). Die Aktivierung der Monozyten (C) führt zu Veränderungen in der Genexpression, die zu Aufstockungen in den entzündlichen Zustand und Ergebnis in Aktivierung und Erschöpfung von CD4 + und CD8 + T-Zellen. II. Infizierten Zelle Veröffentlichungen Virus normalen exosomes und exNef. exNef aktiviert aktivierten, nicht-infizierten Lymphozyten (D). Die aktivierten Lymphozyten (E) unterziehen Veränderungen der Genexpression, die sich in AICD was zu einer apoptotischen Zelle (F). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .

Abbildung 2
Abbildung 2. Peptide Scanning Analyse der HIV-1 Nef-Protein für apoptotische Motiv (e). Eine Reihe von 20-mer Peptiden, die jeweils mit 10 Aminosäuren überlappen, stammen aus den 205 Aminosäuren des knfs Nef-Protein, aus der AIDS Reagent Programm wurde erhalten und bei der Kartierung der Nef apoptotischen Domains. Diese Figur wurde ursprünglich in Huang et al., JVI, 2004 13. Die Y-Achse zeigt den Prozentsatz der Zellen, die TUNEL gekennzeichnet sind, und die X-Achse bezeichnet die Behandlung erhalten. Volle Nef-Protein [Nef], unbehandelten Zellen [UT] oder die Peptide beginnend mit AA1-20 [N20], und endend mit AA190-205 [N205]. Fehlerbalken bezeichnen den Standardfehler der Messung, und die Ergebnisse sind eine Zusammenstellung von mindestens 3 unabhängigen Experimenten. Die Spitzen von Apoptose durch Motiv 1 und Motiv 2 bezeichnet.

Abbildung 3
Abbildung 3. SMRwt Peptid hemmt exNef. Peptide, dieeine oder mehrere Wildtyp Nef SMR Sequenzmotive hemmte die Sekretion von exNef, während Alanin-Ersatz eines animo Säure dieser Region stark reduziert Wirksamkeit des Peptids. Diese Figur wurde ursprünglich in Shelton et al., JVI, 2012 15 veröffentlicht. Kulturmedien von Jurkat-T-Zellen, mit einem Nef-GFP-Klon und verschiedene SMR Peptide co-transfiziert wurden für exNef Sekretion untersucht. Die Menge an GFP-Fluoreszenz gemessen wird, entspricht der Menge an exNef-GFP in den extrazellulären Medien. Statistische Signifikanz wurde unter Verwendung eines ungepaarten t-Test. Die Wirkung auf die Sekretion exNef verschiedener Peptide wurde mit der verglichen mit einer zufällig verwürfelt Peptid Steuerung (SM1, * p-Wert <0.05; ** p-Wert <0,01; *** p-Wert <0,001).

Fig. 4
Abbildung 4. Das Peptid interagiert SMRwt speziell Wirtszelle Proteine, einschließlich mor Talin. (A) Proteine ​​von Jurkat-T-Zellen wurden entweder mit der SMRwt oder SMRmut Peptiden unter Verwendung von anti-FLAG M2-Antikörper gebundene Affinitätsharz co-immunpräzipitiert. Beachten Sie, dass sowohl SMRwt und SMRmut welche hier einen FLAG-Tag-Sequenz in den Peptide eingebettet haben. Diese Figur wurde ursprünglich in Shelton et al., JVI, 201215 veröffentlicht. Dieses Verfahren wurde in der Abwesenheit von entweder Peptid als Kontrolle für unspezifische Wechselwirkungen mit dem Affinitätsharz wiederholt. Die Coomassie Blau gefärbten Gel abgebildeten zeigt Proteine ​​mit Molekulargewichten von 60, 65, 75 und 250 kDa (Pfeilspitzen) heruntergezogen SMRwt, die nicht durch die SMRmut Peptid oder ohne Peptid gezogen wurden. (B) Das 75-kDa-Bande wurde aus dem Gel ausgeschnitten, Trypsin verdaut und durch MALDI-TOF-Tandem-Massenspektrometrie. Die MS / MS Ion Search identifizierte die 75-kDa als Mortalin. Die Pfeile zeigen die Sequenzen der passenden Peptide.large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen

Abbildung 5
Abbildung 5. Mortalin Antikörper Hemmung Blöcke exosome Sekretion. Extracellular Kulturmedien von Jurkat-Zellen mit einem Nef-GFP-Klon und Antikörper entweder gegen Mortalin oder α-Tubulin-co-transfiziert wurden für exNef Sekretion untersucht. Wenn der Wirkung eines Antikörpers gegen ein Protein nicht in exNef Sekretion (α-Tubulin), Störungen des Mortalin Aktivitäten durch seinen Antikörper führte zu einer vollständigen Aufhebung der exNef Sekretion beteiligt verglichen. Statistische Signifikanz wurde bestimmt durch ungepaarten t-Test vergleicht exNef Sekretion in Anwesenheit des Mortalin Antikörper gegen die α-Tubulin-Antikörper (*** p-Wert <0,001). Diese Figur wurde ursprünglich in Shelton et al., JVI, 2012 18 veröffentlicht.

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Discussion

Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen Nef die Fähigkeit zu manipulieren die exosomalen Menschenhandel Weg wird in der Technik neuartige Inhibitoren der exNef Sekretion nützlich. Hemmung der Sekretion exNef sollte vermindern die CD4 T-Zell-Depletion und CIA, die Fahrt HIV / AIDS Pathogenese. Mit diesem Ziel haben wir eine Reihe von neuartigen Reagenzien und Methoden, die uns die Genetik der exNef Sekretion analysieren und damit beginnen, die zelluläre Proteine ​​beteiligt zu bestimmen erlaubt. Dieser Ansatz auch auf die Entwicklung des ersten Inhibitor, das direkt auf exNef Sekretion, die SMRwt Peptid führte.

Eine wichtige Erkenntnis unserer Arbeit ist, dass bestimmte kurze Peptide von Motiven in voller Länge Proteinen abgeleitet sind, in unserem Fall HIV-1 Nef, nicht nur behalten ihre biologische Funktion, kann aber auch kompetitiv hemmen die Funktion des Protein voller Länge. Da diese Peptide ihre biologische Funktion beibehalten, können sie verwendet werden, um funktionelle Domänen zu identifizierenin dem Protein voller Länge. Zwei Dinge erforderlich: die Erzeugung von Peptiden, die das Protein von Interesse, entweder seine gesamte Länge oder einen Bereich des Proteins scannen gedacht, um die funktionelle Domäne enthalten, und einen Assay zum Testen der biologischen Funktion in Frage. Da wir Informationen, die es uns ermöglichen, unsere Suche nach einzugrenzen apoptoseinduzierende Motive auf bestimmte Regionen Nef würde fehlte, haben wir eine Reihe von Peptiden Scannen seiner gesamten Länge. Während dieser Prozess wurde vereinfacht durch relativ kleine Größe Nef ist, haben wir auch diesen Ansatz zu größeren (> 75 kDa) Proteine ​​angewendet. Ein etablierter Assay zur Messung der Apoptose (TUNEL) wurde verwendet, um Peptide welches die biologische Funktion von Interesse zu identifizieren, in diesem Fall Nef-induzierten Apoptose von CD4 T-Zellen. Interessanterweise zeigte folgende Analyse in der Papierfilter, dass die identifizierten Peptide apoptotischen> 80% der biologischen Aktivität des Volllängen-Nef-Proteins beibehalten und kompetitiv gehemmt CXCR4 Bindungseiner natürlichen Liganden SDF-1α.

Ebenso erhalten einen kurzen Peptid, das die SMR-Motiv von Nef seine biologische Fähigkeit, mit zellulären Proteinen in exNef Sekretion beteiligt interagieren. Allerdings hat in diesem Fall Beibehaltung der Aktivität nicht dazu führen, dass von einer Nef-Funktion Mimikry, wie es der Fall mit Apoptose-Induktion, sondern führte stattdessen zu einer Hemmung. Da die SMRwt Peptid wirksam die SMR-Bindungsstellen dieser zellulären Proteine ​​gebunden, gestört ist ihre Wechselwirkungen mit Nef und folglich verhindert Nef-Sekretionssystem in exosomes. Da die Nef-Motiv von Interesse aus früheren genetischen Kartierung Studien bekannt war, konnten wir Peptid Entwicklung von Schwankungen des SMR begrenzen. Statt Identifizierung neuartiger funktioneller Motive, nutzten wir diese Peptide, und eine zuvor entwickelte Fluoreszenz-basierten Assay zur Messung exNef Sekretion, zu zeigen, dass der SMR Rolle in exNef Sekretion wurde direkt auf seine spezifischen primären Sequenz.

HIV-1, listet Human Protein Interaction Database mehr als 60 zelluläre Proteine, die direkte Interaktion mit Nef und möglicherweise mehr als 200, die direkt oder indirekt interagieren 19. Durch die Beschränkung der Reihenfolge der Köder-Protein auf das Motiv von Interesse, vermieden wir mit den durch die Dutzende von Proteinen, wurden würde durch die Volllängen-Nef-Protein co-immunpräzipitiert sortieren. Die Mehrzahl dieser Proteine, während die spezifisch für Nef, würde nicht Bindungspartner für Nef die SMR und würde somit bilden Hintergrund / Lärm. Eine konservative Berechnung ist, dass wir den Lärm reduziert von 15x (60/4). Im Kern unseres Ansatzes effektiv erhöht das Signal-zu-Rausch-Verhältnis durch die Minimierung Hintergrund aufgrund off-site, oder in unserem Fall off-Motiv Bindung, so dass wir identify Proteine, die spezifisch an die SMR. Allerdings ist es möglich, dass mit dieser Methode haben wir es versäumt, alle SMR-Bindung zellulärer Proteine, insbesondere solche, die Interaktion erfordern sowohl mit dem SMR und einem zweiten Motiv auf Nef binden, oder diejenigen, deren Bindung ist abhängig von sekundären oder erfassen Tertiärstruktur.

Mortalin, ein zelluläres Protein, das vom SMRwt Peptid Zusammenarbeit immunpräzipitiert, wurde gezeigt, dass für exNef Sekretion durch miRNA Knockdown und Antikörper Hemmung erforderlich. Ersteres ist eine gut etablierte Technik, verringert oder beseitigt die Expression des Zielproteins. Umgekehrt bedeutet Antikörper Hemmung nicht auf Protein Expression, sondern physisch hemmt das Zielprotein die Interaktion mit anderen Proteinen. Wir nutzten diese zweite Methode, um die Bedeutung des Nef-Interaktion für Mortalin exNef Sekretion demonstrieren. Antikörper Hemmung ist eine geradlinige Verfahren, das ein Verfahren zum Einführen des Antikörpers erfordertin die Zelle und einem Assay zum Testen der Wirkung auf die biologische Funktion in Frage. Wir nutzten die Chariot Protein Lieferung Reagenz zu Shuttle anti-Mortalin Antikörpern in die Zelle, und der genannten Fluoreszenz-basierten Assay auf Veränderungen in exNef Sekretion messen. Wie die meisten Antikörper-basierten Verfahren wird die Wirksamkeit des Antikörpers Hemmung durch die Affinität und Spezifität des Antikörpers für das Zielprotein begrenzt.

Ein wichtiges Ziel der HIV-Forschung ist die Entwicklung neuartiger Therapeutika und die Identifizierung von potenziellen Zielen für die Therapie. Die hier beschriebenen Verfahren nutzen bestimmte kurze Peptide, die ihre biologische Funktion beibehalten und kann kompetitiv hemmen die Funktion der Proteine ​​in voller Länge, um diesen Prozess zu beschleunigen. Während die beschriebenen Versuche zu verstehen eine wichtige Funktion HIV gerichtet waren, sollten die Techniken verwendet werden, für die Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen und die Entwicklung von Peptid-basiertenInhibitoren in verschiedenen Bereichen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde vom NIH / NIGMS / MBRS (Zuschuss 58268), NIH / NCRR / RCMI (Zuschuss G12-RR03034), Georgia Research Alliance Finanzierung Zuschuss GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA Zuschuss F31AI091484, Emory CFAR Zuschuss P30 unterstützt A1050409. Diese Untersuchung wurde in einer Anlage mit Unterstützung von Forschungseinrichtungen Improvement Grant # C06 RR18386 von NIH / NCRR konstruiert durchgeführt. Die Jurkat-Zellen, die Menge von 20 HIV-1 Nef Peptide sowie die Kaninchen-Anti-HIV-1 Nef Antiserum aus dem NIH AIDS Research & Reference Reagent Program (Rockville, MD) erhalten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20mer peptide set with 10 amino acid overlap NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 4641
TUNEL Assay Roche 11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent Active Motif 30100
Tecan GENEios fluorimeter (Tecan Group, Switzerland)
96-well black microtiter plate Corning 3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
Dynabeads Protein G magnetic beads Invitrogen 100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) Promega Corp., Madison, WI Z5332
C-18 ZipTip Millipore ZTC18S096 C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution
MALDI TOF/TOF Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF

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References

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