Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Peptide-baserte Identifikasjon av Funksjonelle Motifs og deres Binding Partnere

Published: June 30, 2013 doi: 10.3791/50362
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology, Biochemistry, & Immunology, Morehouse School of Medicine, 2Institute for Systems Biology, 3Advanced Medical & Dental Institute, Universiti Sains Malaysia

Summary

Teknikker for å dissekere mekanismene bak utskillelsen av HIV-1 Nef i exosomes er beskrevet. Spesifikke korte peptider avledet fra Nef protein transfeksjon ble utnyttet for å bestemme strukturen, funksjonen og bindingspartnere av Nef Sekresjon Modification Region. Disse prosedyrene har generell relevans i mange mekanistiske studier.

Abstract

Spesifikke korte peptider avledet fra motiver finnes i full-lengde proteiner; i denne samanheng HIV-1 Nef, ikke bare beholder deres biologiske funksjon, men kan også kompetitivt hemme funksjonen til den full-lengde protein. Et sett med 20 Nef scanning peptider, 20 aminosyrer i lengde med hver overlappende 10 aminosyrer av nabo dets fordeling, ble brukt til å identifisere motivene i Nef ansvarlig for sin induksjon av apoptose. Peptider inneholdende disse apoptotic motivene indusert apoptose på nivåer sammenlignbare til den full-lengde Nef protein. En andre peptid, avledet fra den Sekresjon Modification Region (SMR) av Nef, beholdt muligheten til å samhandle med cellulære proteiner involvert i Nef 's sekresjon i exosomes (exNef). Dette SMRwt peptid ble brukt som den "agn" protein i co-immunoprecipitation eksperimenter for å isolere cellulære proteiner som binder spesifikt til Nef-'s smr motiv. Protein transfeksjon og antistoff hemming ble brukt til å fysisk forstyrre samspillet betWeen Nef og mortalin, ett av de isolerte SMR-bindende proteiner, og den effekten ble målt med et fluorescent-basert exNef sekresjon-analysen. The SMRwt peptid evne til å utkonkurrere full-lengde Nef for cellulære proteiner som binder den SMR motiv, gjøre det den første hemmer av exNef sekresjon. Således, ved anvendelse av de teknikker som er beskrevet her, som drar nytte de unike egenskapene til spesifikke korte peptider avledet fra motiver finnes i full-lengde proteiner, kan det hende man akselerere den identifikasjon av funksjonelle motiva i heile proteiner og den utvikling av peptid-baserte hemmere av patogene-funksjoner.

Introduction

Med den advent av anti-retroviral terapi, har den AIDS epidemien i den vestlige verden blitt bremset, men ikke curtailed, og spredningen av HIV fortsetter å være en stor helse byrde over hele verden. Med unntak av den marginalt effektive RV144 Thai rettssaken, har HIV-vaksiner så langt vist unnlatelse av å beskytte fra infeksjon. Således, er forskning inn i ytterligere, potensielle terapeutiske mål fortsatt hjemlet.

Sammen med CD4 T-celle uttømming, er persistent generalisert immune aktivering et kjennetegn på HIV infeksjon. Denne Kronisk Immune Activation (CIA) fører til øker i celle omsetning, påslåtte og differensiert lymfocytiske subpopulasjoner, cellular utmattelse og senescence, og drapet av T-celler og B-celler via Activation-Induced Cell Death (AICD) 1,2,3, og det er godt etablert som en av de sterkeste prediktorer av sykdom progresjon 4,5,6,7,8,9,10,11,12. Imidlertid, de mekanismene som ligger til grunn CIA og CD4T-celle uttømming hos HIV-infeksjon er fortsatt ikke helt klarlagt.

Bevis fra vår lab og andre førte oss til et modell for sykdom progresjon (Figur 1) hvori den HIV protein Nef (Negativ Regulatory Factor) induserer sin sekresjon i exosomes fra HIV-ett infiserte celler 13,14. Disse Nef-holdige exosomes (exNef) indusere apoptose i et antall av celle slektsnavn inkludert uninfected CD4 T-celler 15,16. Alternativt, i monocytter / makrofager exNef endrer gene expression mønstre, f.eks cytokin uttrykk, og ser ut til å indusere en tilstand av unscheduled immune aktivering. Denne kropp av bevis tyder på en viktig rolle for exNef i CIA og CD4 T-celle uttømming.

Forstå de mekanismene bak Nef evne til å manipulere den exosomal trafficking pathway vil være nyttig seg på engineering romanen hemmere av exNef sekresjon. Hemming av exNef sekresjon bør minske den CD4 T-celle uttømmingog CIA at stasjonen HIV / AIDS patogenesen.

Å samle bevisene som førte til våre modell for HIV / AIDS sykdom progresjon og de påfølgende data som bygde bort på denne modellen, utviklet vi en rekke av romanen reagenser og metodologier som mulig for oss til å analysere de genetikk av exNef sekresjon, og begynne å bestemme den cellulære proteiner involvert. I det innledende arbeidet, fant vi at Nef protein induserer apoptose i tilskuer celler og er utgitt ekstracellulært fra Nef-transfekterte og HIV-infiserte celler 15. Peptider avledet fra SDF-1α (Stromale celle Avledet Factor-1, med alternativ spleising alfa) hadde blitt tidligere er vist å beholde mye av den bindende og signalnettverk aktivitet av den full-lengde molekyl 17.. Vi spekulert i at peptidene fremstilt Nef kanskje vil beholde noen av den apoptose aktivitet av den fulle protein, og at disse peptidene nødvendigvis ville inneholde den Nef-apoptotisk domene (e). Å identifisere disse peptider, og følgelig den Nefapoptotisk domene (s), innhentet vi et sett av 20 HIV-en Nef skanning peptider fra den NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Disse tjue-aa peptider, er hver overlappende 10 aminosyrer av nabo sin, oppkalt med antall av deres siste amino syre, N20 dvs. spenn Nef aminosyrer 1-20, N30 spenn Nef aminosyrer 11-30, 16 etc. Vi fant ut at å utsette t-celler ekstracellulært til spesifikke peptider overlappende to distinkte 10-AA domener i den full-lengde Nef-protein som indusert apoptose i disse cellene. Oppfølgende analyse av disse Nef-deriverte apoptotic peptider avslørt deres evne til å fysisk samhandle med den chemokine reseptoren påvist CXCR4 på overflaten av t-celler, med bindende kinetikk som tillot disse peptidene for å kompetitivt inhibere binding mellom kl CXCR4 og dens naturlige ligand SDF-1α. Til slutt, ble de Nef-deriverte apoptotiske peptider 'interaksjon med CXCR4 funnet å indusere en stress respons i disse T-celler som fører til apoptose. Dette bevis tillatt oss å quickly map Nef 's funksjonelle domener; en prosess som ville ha tatt mye lenger ved hjelp av standard DNA-mutagene teknikker som for eksempel alanine skanning mutagenese. Den viste samtidig at disse korte Nef--deriverte peptider beholdt den biologiske funksjon av de apoptotic domenene i den full-lengde protein.

Etter å ha identifisert en rolle for extracellular Nef, dvs. apoptose av T-celler, søkte vi en bedre forståelse av hvordan Nef ble secreted fra celler. Ved hjelp av en serie av muterte NEF-konstruerer, vi kartlagt svært konservert Nef protein motivene i de N-terminale regioner av både HIV Nef, og dens Rhesus macaque ekvivalent SIV mac (Simian Immunodeficiency Virus) Nef, at er kritiske for exNef sekresjon 13.. En av disse motivene, den Sekresjon Modification Region (SMR; 66VGFPV70), var spesielt kritisk, som alanin utskifting av en hvilken som helst av sine fem aminosyrer enten sterkt redusert eller avskaffet exNef sekresjon. Når den leveres til celler via Active Motif 's Chariot Protein Delivery Reagent, et peptid inneholdende smr festet til en FLAG peptid sekvens (SMRwt) ble funnet å hemme exNef sekresjon fra både Nef-transfekterte og HIV-smittet celler 18.. Basert på vår forrige erfaring med peptider, besluttet vi å bruke denne peptid til å belyse de molekyler og mekanismer ligger til grunn for Nef SMR 's rolle i exNef sekresjon.

Ved hjelp den SMRwt peptid som vår "agn protein", vi co-immunutfelt cellulære bindende partnere av den SMR fra uinfiserte T-celle lysates atten. The FLAG peptid rekkefølgen de er angitt en praktisk håndtak for å fange den SMRwt peptid ved hjelp av anti-FLAG affinitet resin. Vår forrige funn at en enkelt valine til alanin mutasjon i den SMRwt peptid var tilstrekkelig for avskaffe sin hemming av exNef sekresjon identifisert en praktisk, svært spesifikk kontroll peptid (SMRmut) at vi pleide å utelukke co-immunutfelt proteiner ikke spesifikke for den SMR. Ved hjelp av en peptid med den specific domenet av interesse snarere enn den fulle-lengde protein tillatt oss til å omgå den screening av dusinvis av cellulære faktorer som binder seg til andre domener i Nef 19..

Når vi identifisert de SMR-bindende partnere, et logisk neste skritt var å vise at de identifiserte mobilnettet bindende partnere er viktige for det biologiske funksjon 18. Den standard prosedyre for å oppnå dette er å knockdown protein nivåer ved hjelp av mål protein-spesifikk miRNA eller siRNA, og senere assay den effekt på den biologiske funksjon. Vi utførte miRNA knockdown, noe som hindrer translasjon av målet-mRNA, noe som reduserer produksjonen av av målet, med i dette tilfellet en smr-bindende protein. Denne reduksjon av målet protein er en indirekte effekt, og muligens har en tidsforskjøvet utslag for biologiske funksjonen den målrettet proteinet spiller en rolle i. Følgelig, vi også knyttet den mindre vanlige antistoff hemming teknikk for for å fastslå om direkte forstyrre den aktiviteten avmålet protein reduserer eller eliminerer den biologiske funksjon. I denne prosedyren, antistoffer dyrket mot den målrettet proteinet blir transfektert inn i cellen ved hjelp av Chariot Reagent, og samhandle direkte med målet protein enten sequestering den fra sin stedet av funksjon, eller blokkere dens relevant bindende domene. Inhibering av målet protein gjennom denne prosedyre direkte forstyrrer til funksjon, og kan utfylle RNA-knockdown prosedyrer ved å noe bekrefter viktigheten av målet protein til den biologiske funksjon.

Mens Chariot Reagent er effektiv på å levere peptider og proteiner inn i celler; denne prosessen er tidkrevende og begrenser hvilke typer eksperimenter, f.eks forlenget eller gjentatt eksponeringer og in vivo dyrestudier som kan utføres. Følgelig, lagt til vi en celle-gjennomtrengende peptid (CPP)-sekvens til SMRwt peptid (SMRwt-CPP) 18 til å generere et peptid som kunne bli tatt opp av celler passivtfra de kulturmedier. Denne versjonen var like effektivt som det tidligere ved hemme exNef sekresjon.

Beviset fra disse publiserte eksperimentene demonstrerer den evne av små peptider inneholdende spesifikke funksjonelle motiv som kan antagonize funksjonen til den full-lengde protein gjennom kompetitiv hemming, og for å isolere de proteiner som binder til desse motiva. En ville forvente at disse teknikkene bør være nyttig i mange eksperimentelle protokoller. De bør også være effektive seg på engineering romanen peptid hemmere av mange cellulære prosesser; en funksjon som kan bli ytterligere forbedret ved linkage til CPP sekvenser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I. Bruk av Short Peptider i Biological Analysis

I.1. Fargetilordning Biologisk Funksjonelle Motifs Bruke Peptides

  1. Treating celler med Nef skannebehov peptider
    1. Fremskaffe et sett av peptider skanning regionen av interesse. For våre eksperimenter, -20 mer peptider, med ti aminosyre overlapping, som spenner over den hele HIV-1 Nef protein (205 aa), ble innhentet fra den AIDS Reagent Program. De peptider er assayed individuelt som følger:
    2. Tilsett 10 ng / ml av peptid til cellen kultur medium.
    3. Tilsett 10 ml dyrkningsmedium pr plate til Jurkat-celle-kulturer.
    4. Inkuber kulturer for 24 hr ved 37 ° C.
  2. Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediert dUTP biotin Nick End Labeling (TUNEL) assay av apoptose
    1. Vask celler med 1X PBS, og fikse for 30 min ved romtemperatur med fire% paraformaldehyde i 1X PBS, 7.4 pH.
    2. Vask med 1X PBS, og permeabilize med 0,1% Triton X-100 for timin ved romtemperatur.
    3. Skyll cellene to ganger med 1X PBS.
    4. Telle fargede celler ved å epifluorescence på en datamaskin-styrt mikroskopi system.

I.2. Konkurransedyktig Hemming Analysis ved hjelp av Peptides

  1. Co-transfeksjon av Peptides ved hjelp av Chariot Protein Delivery Reagent Kit
    1. Per transfeksjon reaksjonsblanding, fortynne 1 ug av wtNef-GFP plasmid DNA og 100 ng av enten villtype med peptider avledet fra smr domenet, for eller peptider inneholdende alanin-replacement av individuelle aminosyrer i smr motiv, til en sluttvolum på 100 pl med 1X PBS.
    2. Fortynn seks pl av en 1/10 fortynning av Chariot Reagent til en sluttvolum på 100 ul med sterilt vann, noe og kombinere med den fortynnede-DNA-peptid mix.
    3. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter for å tillate dannelsen av vognen / DNA-peptid-komplekset.
    4. Trepelletskaminer Anmeldelser for 3. x 10 fem Jurkat-celler ved sentrifugering ved 600 xg i 5 min.
    5. Vask celler to ganger med 1X PBS, og resuspender i den Chariot / DNA-peptid kompleks.
    6. Legg 400 mL av serum-free RPMI 1640-medium til suspensjonen og inkuber cellene i kultur plater ved 37 ° C i 2 hr.
    7. Tilsett 1 ml frisk RPMI 1640-medium inneholdende 10% FBS til hver plate, og inkuberes cellene i 48 timer ved 37 ° C.
    8. Harvest celler og avgjør transfeksjon effektiviteten ved å fluorescerende mikroskopi.
  2. Nef-GFP sekresjon fluorescerende plateavleseren analysen av peptid hemming
    1. Samle rommene i celle-frie kondisjonerte media fra blir høstede cellene, og overføre 100 mL til individuelle brønner på en 96-vel svart microtiter plate.
    2. Measure GFP fluorescens i de media på en Tecan GENEios fluorimeter med eksitasjon bølgelengde 485 nm og utslipp bølgelengde 515 nm i relative fluorescerende enheter.
    3. Definer nivået på GFP fluorescens i kontrollen (media fra celler ko-transfektert med Nef-GFP og en omkastet peptid) Ved 100%.
    4. Sammenlign dette til nivået av GFP fluorescens i de media fra cellene ko-transfektert med ulike SMR peptider å oppfatte endringer i Nef-GFP sekresjon.

I.3. Isolating Motif Binding Partners Bruke Peptider som Bait

  1. Co-immunoprecipitation med SMR peptider
    1. Grow Jurkat-celler i RPMI 1640-medium inneholdende 10% FBS ved 37 ° C i en-T-syttifem vev kultur kolbe, og pelletskaminer-celler ved sentrifugering ved 1,000 xg i tjue min ved 4 ° C. Bestem transfeksjon effektivitet, ved å plassere den tallerkenen under fluorescenrende mikroskop, ta bilder, og senere telle det totale antallet og merket celler og bestemme de prosentvise merket celler.
    2. Cellepelleten suspenderes i 1 ml 1X PBS, og overføre den til en 1,5 ml Eppendorf tube. Mikrosentrifuge ved 1.000 xg i 1 min. Resuspender pelleten in 1 ml α-FLAG Lysis buffer ved forsiktig pipettering. Lyseringsbuffer: Bland 50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM natrium-chltetraklorid [NaCl], 1 mM EDTA, og 1% Triton X-100, med 1 mM phenylmethylsulfonyl fluor [PMSF], og ti xl / pr ml Protease Inhibitor Cocktail for bruk sammen med pattedyrcelle-og vevs-ekstrakter [PIC; Sigma]. Gjøre umiddelbart før du bruker.
    3. Differentially mikrosentrifuge de suspensjoner ved totusen xg i 5 min, og ved 13.000 xg i 10 minutter for å pelletere celle rusk og DNA, henholdsvis. Utlevering den supernatanten (heretter referert til som de "lysate").
    4. Tilsett 1 mg av-lysat protein og en ug av enten den SMRwt eller SMRmut peptid til 20 mL av anti-FLAG M2 Affinity Gel (heretter kalt "harpiks"; Sigma). Merk at både SMRwt og SMRmut brukt her har FLAG tag sekvens innebygd i peptider. Bring den blandingen til en endelig volum på 1 ml i Co-IP--buffer (α-FLAG Lysis-buffer minus PMSF og PIC). Inkuber den blandingen ved 4 ° C over natten med ende-over--ende-rotasjon. Som en negativ kontroll, inkuber den lysatet med harpiksen i fravær av enten peptid.
    5. Pellet den harpiksen ved microcentrifugation ved 5000 - 8,000 xg i 30 sek. Tillate resin å bosette for 2 min før du håndterer prøven og deretter aspirer supernatanten. Fjern supernatanten med en smal-end pipette tip, eller en Hamilton sprøyte, å være forsiktig for ikke å overføre noen harpiks. Narrow-end pipettespisser kan gjøres ved hjelp forceps å klype åpningen av en plast pipette tip inntil det er halfstengt. Vask den harpiks fire ganger med 500 mL av vaskebufferen (50 mM Tris • HCl, pH 7,4, og 150 mM NaCl) ble. Eluere de bundne cellulære proteiner med 15 pg av 3X FLAG peptid (Sigma) i 50 mL av vaskebuffer og inkuber på rocker / ryster i 30 min ved romtemperatur.
    6. Konsentrer eluatene ved aceton nedbør, etterfulgt av kokende i Laemmli prøvebuffer (Bio-Rad). Skill de proteiner ved SDS-PAGE på en 4-20% Tris-HCl Criterion precast gel (Bio-Rad). Stain den gel med Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Merk: for massespektrometriteknikker identifikasjon eksperimenter (
  2. Co-immunoprecipitation med Nef-GFP protein
    1. Bland 50 mL av Dynabeads protein B magnetiske perler (Invitrogen) med 2 mikrogram av murint monoklonalt anti-GFP i 1 ml av 1X PBS med 0,02% Tween 20. (PBS-T). Inkuber av blandingen med ende-over--ende-rotasjon i et 1,5-ml Eppendorf-tube for 1 hr ved 4 ° C.
    2. Skill de perlene til fra bufferen ved å plassere den tube på et rangeringssystem fra 1.5-ml MagnaSphere Technology Magnetisk Separation stativ (Promega Corp, Madison, Wis) å tillate magnetisk pulldown, fulgt av fjernelse av supernatanten. Vask de anti-GFP belagt perler med 1 ml av PBS-T ved å hjelp skånsom pipettering.
    3. Lyse Nef-GFP transfekterte Jurkat celler med ett ml av 1X RIPA + buffer ved forsiktig pipettering og inkubering for femten mi på is. RIPA-+ buffer: 10X RIPA Lysis Buffer, pH 7,4 [Millipore, Bedford, MA] fortynnede 1:10 i sterilt vann, noe 0.02% natrium--azid [Sigma], og 0,1% natriumdodecylsulfat [SDS], med 1 mM PMSF og 10 pl / ml PIC lagt umiddelbart før du bruker.
    4. Pellet den celleavfall ved å microcentrifugation ved 2,000 xg i 10 min. Utlevering den supernatanten (heretter referert til som de "lysate").
    5. Tilsett 1 mg av-lysat protein til de anti-GFP belagt perler, bringe den endelige volumet til 1 ml med 1X RIPA-+ buffer, og inkuber av blandingen med ende-over--ende-rotasjon for 1 hr ved 4 ° C. Merk: For peptid konkurransemyndigheter studier, kan det hende 1 mg av Lysate protein være pre-inkubert med 2 mikrogram av SMRwt eller SMRmut peptid in 1 ml av 1X RIPA + buffer, før å blir lagt til de anti-GFP belagt perler.
    6. Vask perlene gjennom resuspensjon i 1 ml av vaskebufferen (femti mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, og 0,1% Tween 20). Inkuber med ende-over--ende-rotasjon i 5 min ved 4 ° C. Separer den perler from den wash ved hjelp den Magnetic Separation Stand. Vask perlene en andre og tredje tid med vask buffere som inneholder 250 mM og 300 mM NaCl, henholdsvis.
    7. Resuspender perlene inn 200 ul av PBS, overføre av blandingen for å et rent rør, og skiller de perlene fra vaske på den magnetiske standen. Kok perlene inn 50 mL av Laemmli prøvebuffer 5 min ved 95 ° C, at blandingen skal sette kjøles ned i 10 min ved romtemperatur, og deretter legg blandingen på den magnetisk stativet, for separering, og samle inn supernatants («eluatene") .
    8. Skill de proteiner av eluatet ved hjelp av SDS-PAGE on en 8-16% Tris-HCl Criterion forhåndsstøpt gel.
  3. Mass spectrometry
    1. Avgiftsdirektoratet proteinbåndene av interesse fra Coomassie-fargede geler.
    2. Redusere prøvene i ti mM 1,4-ditiotreitol (dtt) i 45 min ved 37 ° C.
    3. Alkylat-prøvene hos 55 mM jodacetamid i 45 min ved 25 ° C.
    4. Fordøye prøvene over natten med sekvensering grade prøvepsin (Promega) ved 37 ° C.
    5. Avsalte prøven peptider med C-18 ZipTip (Millipore). Bland prøven peptider med alfa-CHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), og få øye på dem på en MTP målramme III (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA).
    6. Utfør tandem matrix-assistert laser desorpsjon / ionisering tid of-flight (Maldi-TOF/TOF basert masse spektrometri) massespektrometri analyse ved hjelp av en Bruker Daltonics Ultraflex III TOF / TOF.
    7. Sammenligne MS / MS data til NCBI ikke-redundante og Swiss-Prot databaser ved å bruke Mascot algoritmen ( www.matrixscience.com ).
  4. Immunoblotanalyse
    1. Skille protein prøvene ved SDS-PAGE på 4-20% eller 8-16% Tris-HCl Criterion prefabrikerte gels (Bio-Rad). Overfør bandene elektroforetisk til en nitrocellulose membran.
    2. Vask membranen i Tris-bufret saltvann (TBS, Bio-Rad) i 5 min. Blokker med 5% fettfri melk i TTBS (TBS med 0,1% Tween 20) i 1 time ved rysting ved romtemperatur.
    3. Prosess membranen for immunoblotting ved hjelp av et spesifikt primært antistoff i 5% fettfri melk med risting ved 4 ° C over natten. Vask i TTBS i 20 min etterfulgt av en sekundær HRP-konjugert IgG (H + L) antistoff i 5% fettfri melk i 1 time ved romtemperatur. Vask i TTBS i 30-60 min.
    4. Oppdage proteinbåndene av Western Blotting Luminol Reagens (Santa Cruz Bioteknologi, Inc., Santa Cruz, California). Utsett filter til fotografisk film. Merk: I noen eksperimenter, ble en stripping reagens brukes til å stripe membranen (Pierce, Rockford, IL) med påfølgende hybridisering med en annen primær og sekundær antistoff.
    5. Skanne X-ray filmer i Adobe Photoshop 5.0.2. Utfør densitometry analyse ved hjelp ImageJ programvare (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

II. Bruk av Antistoff Hemming i Functional Analysis

II.1. Co-transfeksjon av antistoffertallet ved hjelp av Chariot Protein Delivery reagenssett

  1. Per transfeksjon reaksjonsblandingen, fortynn 1 ug wtNef-GFP plasmid-DNA og 1 pg av enten anti-mortalin antistoff eller anti-α-tubulin-antistoff, til et sluttvolum på 100 ul med 1X PBS. Merk: Det ble tidligere funnet at ko-transfeksjon av anti-α-tubulin antistoffet ikke har noen påviselig effekt på exNef sekresjon, og tjener således til det som en effektiv negativ kontroll i disse eksperimentene.
  2. Fortynn 6 pl ufortynnet vogn reagens til et sluttvolum på 100 mL med sterilt vann, og kombineres med den fortynnede DNA-antistoff-blanding.
  3. Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter for å tillate dannelsen av vognen / DNA-antistoff-komplekset.
  4. Trepelletskaminer Anmeldelser for 3. x 10 fem Jurkat-celler ved sentrifugering ved 600 xg i 5 min.
  5. Vask cellene to ganger med 1X PBS, og resuspender i Chariot / DNA-antistoff kompleks.
  6. Tilsett 400 pl av serum-fritt RPMI 1640-medium til suspensjonen og inkubere den calen i kultur plater ved 37 ° C i 2 timer.
  7. Tilsett 1 ml frisk RPMI 1640-medium inneholdende 10% FBS til hver plate, og inkuberes cellene i 48 timer ved 37 ° C.

II.2. Nef-GFP Secretion Fluorescent Plate Reader analysen av antistoff Hemming

  1. Samle rommene i celle-frie kondisjonerte media fra blir høstede cellene, og overføre 100 mL til individuelle brønner på en 96-vel svart microtiter plate.
  2. Measure GFP fluorescens i de media på en Tecan GENEios fluorimeter med eksitasjon bølgelengde 485 nm og utslipp bølgelengde 515 nm i relative fluorescerende enheter.
  3. Sett nivået av GFP fluorescens i kontrollen (media fra celler ko-transfektert med Nef-GFP og anti-α-tubulin antistoff) på 100%.
  4. Sammenlign denne til nivået av GFP fluorescens i media fra celler ko-transfektert med anti-mortalin antistoff for å bestemme endringer i Nef-GFP sekresjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kartlegging biologisk funksjonelle motiver hjelp Peptider. To regioner ble identifisert på NEF-proteiner som induserer apoptose. Peptid-drevet apoptose ble observert (Figur 2) begynner med peptid N50 (AA30-50), med en topp på N60 (aa40-60) og N70 (aa50-70), og reduseres til bakgrunnsnivået på peptid N100 (aa80-100). Den store Motiv 1 (M1) topp, sentrert om aa50-60, induserer> 80% av de apoptotiske nivåer av full-lengde Nef-protein. En annen, mindre apoptose Toppen ble observert spenner peptider N180 (aa160-180) og N190 (aa170-190). Det mindre Motiv 2 (M2) topp, sentrert på aa170-180, induserer ~ 30% av de apoptotiske nivåer av full-lengde Nef-protein 16.

Konkurransedyktige Hemming Analyse bruker Peptider. I figur 3, peptider som inneholder en intakt SMR vesentlig hemmet exNef sekresjon. Dette var sant om motivet var plassert på N-terminalen (WildtyPE-1) eller middels (villtype-2) av peptidet, eller ble duplisert i peptidet (villtype-3). Alternativt alanin-substitusjon av en hvilken som helst aminosyre av motivet, uavhengig av motivet stilling eller nummer i peptidet, abrogated peptidet funksjon 18.. En 11-amino-syre kryptert versjon av Nef apoptotisk Motiv 1 (SM1), som tidligere beskrevet 14 og oppnådd fra Sigma Genosys, ble brukt som en negativ kontroll og hadde ingen effekt på exNef sekresjon. Se tabell 1 for en liste over de peptidsekvensene.

Isolere Motif Binding Partners Bruke Peptider som agn. Figur 4A viser den ko-immunoutfelling av fire proteiner ved SMRwt peptid (60, 65, 75, og 250 kDa). Den negative kontroll SMRmut peptid ikke fange disse proteinene, og disse proteinene ikke ikke-spesifikt samhandle med affinitet harpiks i fravær av peptid, noe som tyder på at de ko-immunoutfelte proteinene var samspillspesielt med SMR motiver av SMRwt peptid. Disse proteinene ble senere identifisert av MALDI-TOF tandem massespektrometri (se Figur 4B for et representativt utvalg), og verifisert av immunoblotanalyse 18.

Bruk av Antistoff Hemming i Functional Analysis. Hemming med anti-mortalin antistoff fullstendig avskaffet exNef sekresjon (figur 5). Dette bekreftet at en intakt Nef / mortalin interaksjon er nødvendig for exNef sekresjon. Videre antyder det sterkeste at mekanismen som SMRwt peptid hemmer exNef sekresjon er gjennom forstyrrelse av denne interaksjonen ved direkte konkurranse om mortalin 18.

Tabell 1
Tabell 1. Panel av SMR peptider utviklet og testet for sin effekt på Nef-indusert exNef sekresjon. Denne kategorienle ble opprinnelig publisert i Shelton et al., JVI, 2012 18. I tidligere studier alanin-utskifting av enkelt aminosyrer av SMR motiv betydelig redusert eller opphevet, Nef-indusert sekresjon 18.. Virus isolert fra en langsiktig nonprogressor uttrykte en variant av Nef med en isoleucin i stedet for V66;. En av de få rapporterte variasjoner i den svært bevart SMR motiv 20 Klikk her for å se større tabell .

Figur 1
Figur 1. Effekter av Nef exosomes på store immun celletyper. Denne modellen viser exNef løslatt fra infiserte celler, og det er spådd effekter på monocyttisk celler og lymfatisk celler som ville føre til AIDSpatogenese. AICD, aktivering indusert celledød. I. infisert celle utgivelser virus, normale exosomes, og exNef. exNef aktiverer unactivated, friske monocytter (B). Aktivering av monocytter (C) resulterer i endringer i genuttrykk som fører til økning i inflammatorisk tilstand og resultere i aktivering og utmattelse av CD4 + og CD8 + T-celler. II. Infisert celle utgivelser virus, normale exosomes, og exNef. exNef aktiverer unactivated, friske lymfocytter (D). De aktiverte lymfocytter (E) gjennomgå genuttrykk endringer som resulterer i AICD resulterer i en apoptotiske celle (F). Klikk her for å se større figur .

Figur 2
Figur 2. Peptide skanning analyse av HIV-1-Nef-protein for apoptotisk motiv (e). Et sett med -20 mer peptider, hver med 10 aminosyre-overlapping, som spenner over de 205 aminosyrer av Nef-protein KNFS, ble erholdt fra AIDS Reagent Program og brukt i kartleggingen av NEF-apoptotiske domener. Dette tallet ble opprinnelig publisert i Huang et al., JVI, 2004 13. Y-aksen viser prosentandelen av celler som er TUNEL merket, og X-aksen angir behandling tilstand. Full Nef protein [Nef], ubehandlede celler [UT], eller peptider som starter med AA1-20 [N20], og slutter med aa190-205 [N205]. Feilfelt betegne standard målefeilen, og resultatene er en sammenstilling av minst tre uavhengige eksperimenter. Toppene av apoptose er merket med Motif 1 og Motif 2.

Figur 3
Figur 3. SMRwt peptid hemmer exNef. Peptider som inneholderen eller flere hvete Nef SMR sekvens motiver hemmet utskillelsen av exNef, mens alanin-erstatning av Animo syre i denne regionen sterkt redusert peptid effektivitet. Dette tallet ble opprinnelig publisert i Shelton et al., JVI, 2012 15. Kultur media fra Jurkat T-celler, co-transfektert med en Nef-GFP klone og diverse SMR peptider, ble analysert for exNef sekresjon. Mengden av GFP fluorescens målt tilsvarer mengden av exNef-GFP i de ekstracellulære medier. Statistisk signifikans ble bestemt ved hjelp av en uparet t-test. Virkningen på exNef sekresjon av forskjellige peptider ble sammenlignet med den av en tilfeldig kodede peptid kontroll (SM1, * p-verdi <0,05; ** p-verdi <0,01; *** p-verdi <0,001).

Figur 4
Figur 4. Den SMRwt peptid samhandler spesielt med vertscellen proteiner, inkludert mor Talin. (A) Proteiner fra Jurkat T-celler ble co-immunutfelt med enten SMRwt eller SMRmut peptider ved hjelp av anti-FLAG M2 antistoff-koblet affinitet harpiks. Merk at både SMRwt og SMRmut brukt her har FLAG tag sekvens innebygd i peptider. Dette tallet ble opprinnelig publisert i Shelton et al., JVI, 201215. Denne prosedyren ble gjentatt i fravær av enten peptid som en kontroll for ikke-spesifikke interaksjoner med affinitet harpiks. Den Coomassie blå farget gel avbildet viser proteiner med molekylvekter på 60, 65, 75, og 250 kDa (pilhoder) trukket ned av SMRwt som ikke ble trukket ned av SMRmut peptid eller uten peptid. (B) 75-kDa-båndet ble skåret ut fra gelen, trypsin-spaltet og analysert ved hjelp av MALDI-TOF tandem massespektrometri. MS / MS Ion Søk identifiserte 75-kDa som mortalin. Piler betegner sekvensene til de tilsvarende peptider.large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur

Figur 5
Figur 5. Mortalin antistoff hemming blokker exosome sekresjon. Ekstracellulære kultur media fra Jurkat celler, co-transfektert med en Nef-GFP klone og antistoffer mot enten mortalin eller α-tubulin, ble analysert for exNef sekresjon. Når sammenlignet med virkningen av et antistoff mot et protein som ikke er involvert i exNef sekresjon (α-tubulin), forstyrrelser i mortalin aktivitet av antistoff dens resulterte i fullstendig opphevelse av exNef sekresjon. Statistisk signifikans ble bestemt ved uparet t-test for sammenligning exNef sekresjon i nærvær av mortalin antistoff mot α-tubulin antistoff (*** p-verdi <0,001). Dette tallet ble opprinnelig publisert i Shelton et al., JVI, 2012 18.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forstå de mekanismene bak Nef evne til å manipulere den exosomal trafficking pathway vil være nyttig seg på engineering romanen hemmere av exNef sekresjon. Hemming av exNef sekresjon bør redusere CD4 T-celle uttømming og CIA som driver HIV / AIDS patogenesen. Mot dette målet, har vi utviklet en rekke nye reagenser og metoder som tillater oss å analysere genetikk av exNef sekresjon, og begynne å bestemme cellulære proteiner involvert. Denne tilnærmingen førte også til utviklingen av den første inhibitor til direkte rettet exNef sekresjon, den SMRwt peptid.

En viktig oppdagelse av vårt arbeid er at bestemte korte peptider avledet fra motiver finnes i full-lengde proteiner, i vårt tilfelle HIV-1 Nef, ikke bare å beholde sin biologiske funksjon, men kan også kompetitivt hemme funksjonen til den full-lengde protein. Fordi disse peptidene beholder deres biologiske funksjon, kan de brukes for å identifisere funksjonelle domeneri den full-lengde protein. To ting kreves: generering av peptider som skanner for proteinet av interesse, enten i sin hele lengde eller en region av proteinet som antas å inneholde den funksjonelle domene, og en analyse for testing av biologisk aktuelle funksjonen. Siden vi manglet opplysninger som ville tillate oss begrense vår søken etter apoptose-induserende motivene til bestemte regioner i Nef, brukte vi et sett av peptider skanning hele sin lengde. Mens denne prosessen ble gjort enklere ved Nef relativt liten størrelse, har vi også brukt denne tilnærmingen til større (> 75 kDa) proteiner. En vel etablert assay for måling av apoptose (TUNEL) ble anvendt for å identifisere peptider som beholder den biologiske funksjon av interesse, i dette tilfellet, Nef-indusert apoptose av CD4 T-celler. Interessant nok viste det påfølgende analyse i det opprinnelige papir som de identifiserte apoptotiske peptider beholdt> 80% av den biologiske aktivitet av full-lengde Nef-protein, og kompetitivt inhibert CXCR4 bindendeav sin naturlige ligand SDF-1α.

Tilsvarende beholdt en kort peptid som inneholder SMR motiv av Nef sin biologiske evne til å samhandle med mobilnettet proteiner involvert i exNef sekresjon. Imidlertid, i dette tilfellet retensjon av aktivitet ikke føre til etterligning av et Nef-funksjon, slik tilfellet var med apoptose-induksjon, men ledes i stedet for hemming. Fordi SMRwt peptid effektivt bundet SMR-bindende områder av disse cellulære proteiner, forstyrret det deres samhandling med Nef, og dermed forhindret Nef sekresjon i exosomes. Som Nef motiv av interesse var kjent fra tidligere genetiske kartlegging studiene, var vi i stand til å begrense peptid utvikling til variasjoner av SMR. I stedet for å identifisere nye funksjonelle motiver, benyttet vi disse peptidene, og et tidligere utviklet fluorescens-basert assay for å måle exNef sekresjon, for å demonstrere at SMR rolle i exNef sekresjon ble knyttet direkte til sine spesifikke primære sekvensen.

HIV-1, viser Menneskelig Protein Interaction Database mer enn 60 cellulære proteiner som samhandler direkte med Nef og muligens så mange som 200 som kommuniserer direkte eller indirekte 19. Ved å begrense sekvensen av vår agn protein til motivet av interesse, vi unngår å måtte sortere gjennom dusinvis av proteiner som ville ha vært co-immunutfelt av full-lengde Nef protein. De fleste av disse proteinene, mens spesifikk for Nef, ikke ville være bindingspartnere for Nef SMR, og vil således utgjøre bakgrunn / støy. En konservativ beregning er at vi redusert støy ved 15x (60/4). I hovedsak vår tilnærming effektivt økte signal-til-støy-forhold ved å minimere bakgrunnen på grunn av off-site, eller i vårt tilfelle off-motiv binding, slik at vi kan identify proteiner som spesifikt binder SMR. Imidlertid er det mulig at ved å bruke denne metoden, har vi klart å fange opp alle SMR-bindende cellulære proteiner, spesielt de som krever interaksjon med både SMR og et andre motiv for å binde Nef, eller de hvis binding er avhengig av sekundære eller tertiær struktur.

Mortalin, en mobil protein co-immunutfelt av SMRwt peptid, viste seg å være nødvendig for exNef sekresjon av miRNA knockdown og antistoff hemming. Førstnevnte er en veletablert teknikk som reduserer eller eliminerer ekspresjon av den målrettede proteiner. Motsatt betyr antistoff hemming ikke påvirke protein ekspresjonsnivåer, men i stedet fysisk hemmer målrettet protein interaksjon med andre proteiner. Vi brukte denne andre metoden for å vise betydningen av Nef-mortalin samhandling for exNef sekresjon. Antistoff hemming er en rett-frem prosedyre som krever en metode for innføring av antistoffetinn i cellen, og en analyse for å teste dets virkning på den biologiske funksjon aktuelle. Vi brukte vogn Protein Delivery Reagens til frakting av anti-mortalin antistoffer inn i cellen, og nevnte fluorescens-basert assay for å måle endringer i exNef sekresjon. Som de fleste antistoff-baserte prosedyrer, blir effektiviteten av antistoff-hemming begrenset av affinitet og spesifisitet til antistoffet for målrettet protein.

Et hovedmål for HIV-forskning er utvikling av nye behandlingsformer og identifisering av potensielle mål for terapi. Fremgangsmåtene som er beskrevet her utnytter spesifikke korte peptider, som beholder sin biologiske funksjon og kan kompetitivt hemme funksjonen av full-lengde proteiner, for å akselerere denne prosessen. Selv om forsøkene som er beskrevet var rettet mot å forstå en nøkkel HIV-funksjonen, de teknikker som anvendes være anvendelig til studiet av protein-protein interaksjoner og utvikling av peptid-basertehemmere i flere felt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIGMS / MBRS (Grant 58268), NIH / NCRR / RCMI (Grant G12-RR03034), Georgia Forskning Alliance finansiering stipend GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA stipend F31AI091484, Emory CFAR stipend P30 A1050409. Denne undersøkelsen ble gjennomført i et anlegg bygget med støtte fra Research anlegg forbedring Grant # C06 RR18386 fra NIH / NCRR. De Jurkat-celler, settet av 20 HIV-1 Nef peptider, samt kanin-anti-HIV-1 Nef-antiserum ble oppnådd fra NIH AIDS Research & Reference Reagent Program, (Rockville, MD).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20mer peptide set with 10 amino acid overlap NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 4641
TUNEL Assay Roche 11 684 809 910
Chariot Protein Delivery Reagent Active Motif 30100
Tecan GENEios fluorimeter (Tecan Group, Switzerland)
96-well black microtiter plate Corning 3792
anti-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
Dynabeads Protein G magnetic beads Invitrogen 100.03D
MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position) Promega Corp., Madison, WI Z5332
C-18 ZipTip Millipore ZTC18S096 C18 Resin (0.6 μl or 0.2 μl bed volumes). Oligonucleotides or small (<50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution
MALDI TOF/TOF Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forsman, A., Weiss, R. A. Why is HIV a pathogen? Trends Microbiol. 16 (12), 555-560 (2008).
  2. Moir, S., Chun, T. W., Fauci, A. S. Pathogenic mechanisms of HIV disease. Annu. Rev. Pathol. 6, 223-248 (2011).
  3. Smith, S. M. The pathogenesis of HIV infection: Stupid may not be so dumb after all. Retrovirology. 3 (1), 60 (2006).
  4. Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value. Clin. Exp. Immunol. 90 (3), 376-382 (1992).
  5. Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study. J. Acquir. Immune. Defic. Syndr. 6 (8), 904-912 (1993).
  6. Bofill, M., Mocroft, A., Lipman, M., Medina, E., Borthwick, N. J., Sabin, C. A., Timms, A., Winter, M., Baptista, L., Johnson, M. A., Lee, C. A., Phillips, A. N., Janossy, G. Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients. AIDS. 10 (8), 827-834 (1996).
  7. Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression. J Acquir. Immune. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. 16 (2), 83-92 (1997).
  8. Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS. Annu. Rev. Med. 60, 471-484 (2009).
  9. Roberts, L., Passmore, J. A., Williamson, C., Little, F., Bebell, L. M., Mlisana, K., Burgers, W. A., et al. Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression. AIDS. 24 (6), 819-831 (2010).
  10. Mueller, Y. M., Petrovas, C., Bojczuk, P. M., Dimitriou, I. D., Beer, B., Silvera, P., Villinger, F., Cairns, J. S., Gracely, E. J., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. Interleukin-15 increases effector memory CD8+ t cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques. J. Virol. 79 (8), 4877-4885 (2005).
  11. Picker, L. J., Reed-Inderbitzin, E. F., Hagen, S. I., Edgar, J. B., Hansen, S. G., Legasse, A., Planer, S., Piatak, M., Lifson, J. D., Maino, V. C., Axthelm, M. K., Villinger, F. IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates. J. Clin. Invest. 116 (6), 1514-1524 (2006).
  12. Mueller, Y. M., Do, D. H., Altork, S. R., Artlett, C. M., Gracely, E. J., Katsetos, C. D., Legido, A., Villinger, F., Altman, J. D., Brown, C. R., Lewis, M. G., Katsikis, P. D. IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses. J. Immunol. 180 (1), 350-360 (2008).
  13. Ali, S. A., Huang, M. B., Campbell, P. E., Roth, W. W., Campbell, T., Khan, M., Newman, G., Powell, F., Powell, M. D., Bond, V. C. Genetic Characterization of HIV Type 1 Nef-Induced Vesicle Secretion. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 26 (2), 173-192 (2010).
  14. Raymond, A. D., Campbell-Sims, T. C., Khan, M., Lang, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals. AIDS. 27 (2), 167-178 (2011).
  15. James, C. O., Huang, M. -B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors. J. Virol. 78 (6), 3099-3109 (2004).
  16. Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction. J. Virol. 78 (20), 11084-11096 (2004).
  17. Heveker, N., Montes, M., Germeroth, L., Amara, A., Trautmann, A., Alizon, M., Schneider-Mergener, J. Dissociation of the signalling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Curr. Biol. 8 (7), 369-376 (1998).
  18. Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S. A., Powell, M. D., Bond, V. C. SMR-derived peptide disrupts HIV-1 Nef's interaction with mortalin and blocks virus and Nef exosome release. J. Virol. 86 (1), 406-419 (2012).
  19. Ptak, R. G., Fu, W., Sanders-Beer, B. E., Dickerson, J. E., Pinney, J. W., Robertson, D. L., Rozanov, M. N., Katz, K. S., Maglott, D. R., Pruitt, K. D., Dieffenbach, C. W. Cataloguing the HIV type 1 human protein interaction network. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 24 (12), 1497-1502 (2008).
  20. Shugars, D. C., Smith, M. S., Glueck, D. H., Nantermet, P. V., Seillier-Moiseiwitsch, F., Swanstrom, R. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 nef gene sequences present in vivo. J. Virol. 67 (8), 4639-4650 (1993).

Tags

Virologi biokjemi immunologi infeksjon Infectious Diseases molekylærbiologi medisin genetikk mikrobiologi genomikk proteiner Exosomes HIV peptider exocytosis protein trafficking sekresjon HIV-1 NEF sekresjon Modification Region SMR peptid AIDS analysen
Peptide-baserte Identifikasjon av Funksjonelle Motifs og deres Binding Partnere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali,… More

Shelton, M. N., Huang, M. B., Ali, S., Johnson, K., Roth, W., Powell, M., Bond, V. Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners. J. Vis. Exp. (76), e50362, doi:10.3791/50362 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter