Summary
אנו מתארים רומן
Abstract
יש לנו בהצלחה המשולב הוקם בעבר חלון (ICW) טכנולוגיה תוך גולגולתי 1-4 עם intravital מיקרוסקופיה confocal 2 פוטונים לפיתוח פלטפורמה חדשנית המאפשרת להדמיה לטווח ארוך ישירה של שינויים במבנה רקמות intracranially. הדמיה ברזולוציה תא בודד באופנה בזמן אמת מספקת מידע דינמי משלים מעבר לזה הניתן על ידי ניתוח היסטולוגית נקודת סיום סטנדרטי, שנראה אך ורק בחתכים "Snap-shot" של רקמת גוף.
הקמת טכניקת ההדמיה intravital זה בעכברי chimeric ניאון, אנו מסוגלים לתמונת ארבעה ערוצים בו זמנית ניאון. על ידי תאים שכותרתו fluorescently המשלבים, כגון ה-GFP + מח עצם, ניתן לעקוב אחר גורלם של תאים אלה הלומדים לטווח ארוך ההגירה, האינטגרציה והבידול שלהם בתוך רקמה. שילוב נוסף של תא עיתונאי המשני, כגון קו גידול glioma mCherry, מאפשר למאפייניםterization של תא: אינטראקציות תא. יכולים להיות מודגשים שינויים מבניים בmicroenvironment הרקמות באמצעות התוספת של צבעים ונוגדני התוך חיוניים, למשל CD31 נוגדנים מתויגים ומולקולות dextran.
יתר על כן, אנו מתארים את השילוב של מודל ההדמיה ICW שלנו עם בעלי החיים מייקר irradiator קטן המספק הקרנת stereotactic, יצירת פלטפורמה שדרכו ניתן להעריך את השינויים ברקמות הדינמיים המתרחשים בעקבות הממשל של קרינה מייננת.
מגבלות הנוכחיות של המודל שלנו כוללות penetrance של המיקרוסקופ, אשר מוגבלת לעומק של עד 900 מיקרומטר ממשטח קליפת המוח המשנה, להגביל הדמיה לציר הגבי של המוח. נוכחותו של עצם הגולגולת הופכת ICW הליך טכני מאתגר יותר, בהשוואה למודלים המבוססים יותר ומנוצלים קאמריים המשמשים כיום ללמוד רקמת שד ורפידות שומן 5-7. בנוסף, prov ICWאידו אתגרים רבים בעת מיטוב ההדמיה.
Introduction
הבנה טובה יותר של שינויים המבניים וביולוגיים המתעוררים במוח בתגובה לפתולוגיות שונות, והתערבויות טיפוליות היא קריטית לשיפור אסטרטגיות טיפול. עם זאת, אחד האתגרים הנוכחיים בחקר שינויים מבניים וביולוגיים אלה, במיוחד בנוגע לפתולוגיות תוך גולגולתי, הוא הנגישות של הרקמות וחוסר היכולת ללמוד את האבולוציה של הזמן וההתקדמות דינמית של שינויים בהגדרה בvivo. הדור של הטכנולוגיה "החלון" הוכיח בעבר בהצלחה בבחינת שינויים ברקמות רכות באמצעות התפתחות גידול 5-7. פיתוח המודלים ICW מוכיח להיות מאתגרת יותר מבחינה טכנית, בשל ההכרח להסיר את עצם הגולגולת מבלי לפגוע בייזום דלקת ברקמת המוח הבסיסית. מאמרים קודמים ניסו לדלל את הגולגולת כדי להמחיש את 8-10 הרקמות לעומת זאת, כדי לייצר im ברור ברזולוציה הגבוהההסרת מלאה של גילים עצם הגולגולת נדרש 11. חזור לטווח ארוך הדמיה (30 ימים +) רק לאחרונה הפכה לאופציה אפשרית באמצעות הדמיה 1,11, מסגרות זמן קצרות יותר בעבר נחקרו 5.
במהלך העשור האחרון מטרה עיקרית הייתה להבהיר את המקור של הגירויים פתולוגיים הבאים הניאו כלי דם, במיוחד בתגובה להיווצרות והתקדמות גידול, כדי לספק מטרות טיפוליות חדשניות לטיפול בגידולים. מחלוקת הרבה נשארה סביב המקור של כלי דם חדשים במוח במהלך התפתחות גידול או ההקרנות הבאות. באופן מסורתי כלי דם נחשב ללהתרחש באמצעות אנגיוגנזה, תהליך שבו יוצרים כלי דם חדשים מההנבטה של קיימים כלי 12. מחקרים מאוחרים יותר לעומת זאת, מצביעים על כך שהתהליך העוברי הניח בעבר של vasculogenesis ניתן לשחק תפקיד משמעותי יותר בהיווצרות כלי דם פתולוגי. Vasculogenesis כרוך הגיוס של עמיתי angioblast בוגרים ממח העצם אשר בתורו ואז הם מעורבים באופן ישיר ביצירת כלי חדש האנדותל 12-14. צבירת ראיות מצביעה על כך שתאי האנדותל מבשר מגויסים ממח העצם ליזום היווצרות כלי נובו דה בתגובה למתווכים שעור 15-17. עם זאת, מחקרים אלה מספקים ראיות סותרות לתרומה הישירה של תאים במח עצם אלה נגזרים (BMDCs) להאנדותל כלי עם תרומת שיעור משתנה עם הסוג של גירוי ותגובה לטיפול 18-21 פתולוגי.
לכן, הקמת שיטות ניסיוניות לשחזור המאפשרות הדמיה intravital ברזולוציה גבוהה למחקר ארוך טווח חוזר ונשנה של תהליך האינטגרציה BMDC לכלי דם של גידול ובתגובה לטיפול לא תסולא בפז. טכניקות היסטולוגית סטנדרטיות אינן מספקות אינפור הדינמיmation נדרש על מנת לקבוע את ההישרדות לטווח ארוך, גזירה והאינטגרציה של התאים המקנים neovasculature ולכן לא ניתן להוכיח בודאות את המנגנונים של אינטראקציה תא.
הראנו באמצעות הגישה הניסויית שלנו, כי יש מידה שונה של גיוס BMDC בעקבות שניהם קרינה מייננת תוך גולגולתי וגידול, כי גיוס הוא לעומת זאת, אתר הפתולוגיה ספציפי ולא פלישה של הרקמה 11,22 כולו תוך גולגולתי. אנחנו הראינו כי הגיוס כדלקמן דפוס זמן רגיש הודגם על ידי ההדמיה החוזרת ונשנית של חיה אחת 11,22. בדומה לכך, בתחום ההדמיה vivo גם יכול לספק תובנות רבות ערך לחיקוי לפיה תאי גידול יכולים להיות צילמו תאים סרטניים מתויגים fluorescently ומעקב עם CD31 נוגדן התוך חיוני לתאי האנדותל כדי להדגיש את האפשרות של transdifferentiation תאים הסרטני כדי ליצור האנדותל שלה באופן ישיר.
כדי להדגים את יכולת ההתאמה של המודל שלנו, כמו גם את תאי תאי אינטראקציות שהוזכרו לעיל, היינו מסוגל ללמוד אינטראקציות סמים סלולריים. יש לנו הסתכלנו מעכבי סמים כמו AMD3100, מעכב SDF-1, ותפקידה באיתות הרשתות מעורבות בגיוס BMDC 11. כמו כן יש לנו הנדסה גנטית מתוך תאי U87 xenografts glioma להביע VEGFTrap, מעכב VEGF 25, בשיתוף באמצעות כ IRES למולקולת ה-GFP. באמצעות RFP + בע"מ אנו מסוגלים ללמוד את התפקיד יש VEGF על גיוס BMDCs לכלי הדם. לאחרונה יש לנו מנוצלים המודל ללמוד קינטיקה סמים מסתכל MEChanism מאחורי תרופת 26 העמסת גידולים המגדיר, ברמה תאית. באמצעות השימוש מותאם אישית שנבנה בirradiator חיה הקטן הבית הצלחנו לשלב קרינה מועברת stereotactic כדי להעריך את התגובה של שניהם וגידול BMDCs לטיפול.
באמצעות השימוש בשיטת ההדמיה חוקרי intravital הרומן שלנו לקבל תובנות לגבי השינויים בזמן אמת התא בודד המתרחשים בפתולוגיות ומערכות שונות, סיוע להבהרה של תכונות פונקציונליות וביולוגיות רבות של שינויים ברקמות.
Protocol
כל עבודת חיה כבר בוצעה תחת טיפול בבעלי חי COMMITEE שימוש פרוטוקול מאושר והוצא להורג בעמידה בכל הנחיות רלוונטיות, תקינה ורשויות רגולטוריות.
לפתרון בעיות טבלת עזר 2.
1. כינונה מחדש מח עצם (אופציונלי) איור 1 (30 דקות הכנות, 5 דקות לכל עכבר)
כל הניתוח צריכה להתבצע באמצעות טכניקת aseptic קפדנית עם ציוד סטרילי autoclaved.
עכבר תורם אחד יהיה שלושה עכברים מארחים מחדש.
- לטשטש נמען עכברים ומצבה NODscid, בעופרת כדי להגן על הראש, בתוך מרכז irradiator Gammacell 40 'exactor'.
- מכשיר את עכברי NODscid עם 2.5 Gy הקרנת גוף כולל (TBI).
שלב קריטי: אופטימיזציה של TBI עשוי להיות נחוץ בשל שינוי במינון הדרוש למארח חיסונית מספיק לספירהדלדול LL בזנים שונים עכבר.
נקודה השהה: יכולים להיות מוקרן עכברי מארח מראש אך יש להשתמש תוך 24 שעות של הקרנה.
- להרדים עכברים תורמים בהתאם להנחיות הוועדה לטיפול בבעלי החיים מוסדיות. נקה את hindlimbs ולהסיר את עצם השוק והירך משני, מפשיט את כל הרקמה העודפת מהעצמות (איורים 1ai, 1aii).
שלב קריטי: עצמות שוקיתי הן לא ברת קיימא לשימוש בשל לום צר מאוד.
- הסר צלחות קצה משני הקצוות של ארבע חולצו עצמות ולשטוף אותם בעזרת מחט 22 G ו1 מיליליטר סטרילי PBS עד שהם לבנים במראה (איור 1aiii). עיון בלוח 2.
- מערבבים את מח עצם ההשעיה חולצה (ע) טוב ולצייר 300 μl לשלוש 27 מחטי טוברקולין גרם. BM חילוץ צריך להכיל כ 2 x 10 7 תאים וזה מספיק עבור 3 reconstitutions עכברים מארחים. עיון בלוח 2.
- הזרק את ההשעיה לוריד הזנב לרוחב של שלושה עכברי NODscid הוקרנו בעבר מהשלב 1.1 (איור 1 ב). עיון בלוח 2.
זהירות: כדי לבדוק סטריליות של בע"מ הזריק אנו ממליצים ציפוי בע"מ והתרבות שנותרה למשך 24 שעות כדי לבדוק לזיהום. גורם עיקרי למוות בשלב זה הוא זיהום בעכברים חדש המשוחזרים.
2. דור חלון תוך גולגולתי - איור 2 (30 דקות לכל עכבר)
כל הניתוח צריכה להתבצע באמצעות טכניקת aseptic קפדנית עם ציוד סטרילי autoclaved ותחת מנורת חום כדי לשמור על בעלי חיים חמים (איור 2 א).
- עכברים לטשטש נמען NODscid עם IACUC המאושר הרדמה, הזרקת ה-IP Avertin ברמה של 0.5 מ"ג / g ועמדה, בעופרת כדי להגן על הראש, בתוך המרכזirradiator Gammacell 40 'exactor'. להסיר שיער מהקרקפת. בנוסף יחול ג'ל המדמיע על מנת למנוע התייבשות של הקרנית.
- קרקפת נקיות ראשונה עם תמיסת פולידין ולאחר מכן עם אלכוהול, ולאחר מכן לבצע חתך מנקודת האמצע של האוזניים ממש מעל לעיניים. הסר מ"מ 3 קרקפת שני צדי החתך הראשון, חושף גולגולת וציוני הדרך של פני השטח (איור 2Bi הגולגולת).
- לרומם את periosteum על ידי הזרקה של 2% לידוקאין: אפינפרין פתרון ולנתח ממשטח גולגולת (איור 2Bii).
- שימוש במקדחת מקדחת 2.7 מ"מ, להחליש את מעגל מ"מ 2.7 של הגולגולת על הקליפה של האונה הימנית בין מבדה וגבחת. לא חודר לעצמות עם המקדחה (איור 2Biii). עיון בלוח 2.
שלב קריטי: אם הקידוח עובר דרך גולגולת משטח המוח יהיה פגום תוצאות המשפיעות עם טרה נוספתאומה. בנוסף דימום מוגזם יתרחש מניעת חלון ברור שמנוצר.
- הסר את דש העצם המוחלש באמצעות פינצטה לנתיחה ווו שיניים וכוח מכוון אך מבוקר (איור 2Biii).
- (אופציונלי) אם מסתכל על פתולוגיה גידול, להזריק שורות תאים סרטניים שנבחרו (עם גן כתב ניאון) למרכז החלון שנוצר בשלב 2.5.
- טען 10 מזרק μl 30 G המילטון עם השעיה תא ומחט עומס לתוך מסגרת stereotactic.
שלב קריטי: מספר תא צריך להיות מותאם לתאי גידול בשימוש וציר זמן של הצמיחה הנדרשת. לU87 תרבויות אנו משתמשים 2 x 10 5 תאים ב10 μl לכל עכבר. - לטעון את העכבר על גבי מסגרת הדיגיטלית stereotactic ליישר את המחט לנקודת מרכז החלון שנוצר.
- מחט נמוכה עד שזה נוגע רק את פני השטח של קליפת המוח ולאפס את הקואורדינטות דיגיטליות.
- נמוךאה מחט 3.2 מ"מ לתוך רקמת קליפת המוח ולהזריק ב3 מ"מ עמוק.
- לחזור בו מחט לאט ולאחר מכן להסיר את העכבר מהמסגרת.
שלב קריטי: הזרק פתרון על משך הזמן של 1 דקות ולהשאיר את המחט בהזרקה בעקבות עמדה כדי להבטיח זרימה מופחתת בחזרה.
שלב קריטי: אם דימום קטין נתקל להשקות עם תמיסת מלח סטרילית ל1-5 דקות כדי לעצור את הדימום שטחי. להמשיך בשלבים הבאים.
- טען 10 מזרק μl 30 G המילטון עם השעיה תא ומחט עומס לתוך מסגרת stereotactic.
- לצנן את משטח מוח עם ירידה של PBS סטרילי כדי לשמור על רקמת המוח מושקה.
- לצוף coverslip 3 מ"מ על גבי משטח מוח כדי לחתום באופן מלא סביב חלון מ"מ 2.7 שנוצר. עיון בלוח 2.
- אז גולגולת מסביב יבש עצם להחיל Vetbond לגולגולת החשוף כולו לרקמת קרקפת reseal לעצם הגולגולת וcoverslip במקום. אינו חלים עודפת כפי שהוא ידלוף מתחת לזכוכית ולהקטין את פוטנציאל ההדמיה.
- מיx אבקת אקריליק שיניים טרי ופתרון, בערך 30% (w / v), ולהחיל על החלק העליון של Vetbond. על מנת להבטיח חותם חזק החפיפה אקריליק מעט על קצה coverslip הזכוכית (איור 2Biv). עיון בלוח 2.
זהירות: שיניים אקריליק הוא מסוכן ביותר ולכן אנו ממליצים על שימוש בכפפות ומסכה בכל הליכים.
שלב קריטי: אקריליק שיניים צריכה להישאר גמיש בדפוס על מנת להבטיח חותם טוב ולהפחית את העודף. הצטברות של אקריליק על החלון תהיה לטשטש תמונות.
- לאפשר עכברים להתאושש בכלוב חם.
3. קרינת Stereotactic (אופציונלי) - איור 3 (25 דקות לכל עכבר)
וריאציות תהיה קיימות בלהקרין השונים המשמשים וכאופטימיזציה כזה תידרש. אנחנו השתמשנו irradiator מעוצב אישית.
- לטשטש עכבריםבאמצעות Isoflurane ב 4% לזירוז ואחרי 1.5-2% לאורך כל ההליך עם 0.5-1 ליטר O 2 דק ', ומקום על מנהג הראש עוצר בתוך irradiator stereotactic (איור 3Ai).
- השג 360 ° קונוס קורה הבדיקה CT עם צינור רנטגן לפעול בשעה 40 וkVp 0.05 mA דרך מסנן אלומיניום 2 מ"מ. השתמש בתמונה כדי להדריך את התנועה של הבמה, בימוי isocentre הקרינה לאונה הימנית להבטיח את זה הוא מרכזי בכיוון הגחון הגבי.
- הכנס את collimator חצי המוח, לחסום מ"מ x 11 8.
שלב קריטי: Collimators יכול להיות מיועד למערכים רבים ושונים ולכן יכול להיות משופר כדי לכלול או לא לכלול חלקים שונים של המוח. מ"מ 8 מ"מ x 11 מגדיר אזור חצאים מוח של המוח.
- להשיג תמונות מאונך בודדות CT הן מלמעלה (AP) ותחתון (הרשות הפלסטינית) באמצעות collimator כדי לשפר את המיקום של המוח, ענת נוספתמבני עצם omical יכולים לשמש לשחזור.
- חילופי מסנן האלומיניום לטיפול נחושת 0.93 מ"מ לסנן ולנהל מחצית ממינון הקרינה הרצויה עם צינור רנטגן פועל ב 225 kVp ו13 תואר שני מלמעלה בכיוון סוכנות ידיעות AP.
- לחזור gantry לעמדה התחתונה ולנהל את המחצית השנייה של מינון הקרינה שוב עם צינור רנטגן פועל ב 225 kVp ו13 mA צורה התחתונה בכיוון הרשות הפלסטינית.
שלב קריטי: זה חיוני כדי להקרין גם מהחלק העליון והחלק התחתון כדי להפחית את שיפוע RT דרך רקמת המוח, הוא גם מסייע ביישור של isocentre למרכז המוח.
4 בvivo שני פוטונים מיקרוסקופית לייזר -. איור 3 (1-3 שעות בכל הפעלה)
וריאציות תהיה קיימות במיקרוסקופים השונים המשמשים וכאופטימיזציה כזה תידרש. אנחנו השתמשנו Carl Zeiss LSM510 META סריקת לייזר Confocמיקרוסקופ אל.
- לטשטש עכברים עם IACUC המאושר הרדמה, הזרקת ה-IP בחלון Avertin 0.5 מ"ג / g ונקי באמצעות ספריי אלכוהול.
- (אופציונלי) להזריק מתויגות דקות כלי דם לצבוע 5-10 לפני ההדמיה, לוריד הזנב לפני ההדמיה. Alexa647-dextran שימוש ב0.35 מיקרוגרם / g או APC-CD31 המשמש ב0.2 מיקרוגרם / גרם. ראה טבלה 2.
- (אופציונלי) להזריק העמסה דרך וריד הזנב במינון של מ"ג / ק"ג, 5 דקות 7.7 לפני ההדמיה, כדי להתוות גידול. עיון בלוח 2.
- ערוצי התקנה במיקרוסקופ confocal כפי שנקבע על ידי fluorochrome בשימוש בעכבר chimeric שנוצר. טבלת 1 מדגים את הערוצים המתוארים במודל זה.
- הפוך את העכבר על הבמה מיקרוסקופ ניד ולייצב את הראש בעמדה עם פלסטלינה. (איור 3Aii) טבלת עזר moldable 2.
- הפעל לייזר הערוץ הראשון ולהשתמש בו כדי למקם במרכז ICW.
- השתמש בעדשת 5x ולקחת תמונה של כל החלון שישמש כמפה לתמונות נוספות ברזולוציה גבוהה יותר.
- צריכה להתבצע באמצעות הדמיה 10X ועדשות 20X 'הטווח הארוך' כדי לקבל את איכות התמונה הטובה ביותר.
שלב קריטי: ערוצים ויעדים על 2PLM יש להגדיר באמצעות תאים מהונדסים במבחנה לפני ההדמיה של מודלים Murine כדי להבטיח שהם מדגישים את fluorochrome הנכון.
| Fluorochrome | CFP | GFP / העמסה / FITC | mCherry / RFP / DsRed | APC / אלexa647 | SHG autofluorescence |
| לייזר עירור | 458 ננומטר | 488 ננומטר | 543 ננומטר | 633 ננומטר | זיקית לייזר 820 ננומטר |
| אוסף מסנן | 480-520 ננומטר | 500-550 ננומטר | 565-615 ננומטר | 650-710 ננומטר | 390-465 ננומטר |
טבלת מס '1. ההתקנה fluorochrome. מדריכים למשתמש לראות את לייזר העירור ואספן ספקטרום פליטה המשמש עבור כל אחד מהערוצים הזמינים במודל.
Representative Results
הצעד האופציונלי של בנייה מחדש בע"מ עכברי NODscid צריך לגרום לספיגה 80% מ'התורם 'הניאון בע"מ ב100% מעכברי NODscid "מארח", לעומת זאת אופטימיזציה של TBI תידרש כדי לשפר את הכינון מחדש בלא אחר זנים-immunocompromsed. אם עכברים ללא הצלחתם מחדש הם יהיו חולים ולמות במהירות לאחר הטיפול, עכברים מוחלשים עשויים לדרוש תוספת מזון ומקורות מים.
ICW סיים פעם אחת צריך להיראות כמו שניתן לראות באיור 2Biv. הוא אידיאלי ליש רכס של אקריליק המקיף את coverslip הזכוכית כמו זה נותן כוח לצירוף עם הגולגולת. חלונות מושלמים הם שחזור ולאפשר הדמיה חזר לתקופה של עד 8 שבועות לאחר דורם (איור 2 ג). תמונות המיוצרות באמצעות Windows האופטימלית אלה ייראו כמו אלו שנראו ב3Bi הדמות. פגמים בייצור החלון יהיה להפיק תמונות של ענייםאיכות למשל, בועות אוויר מתחת לחלון תמנע שדות שלמים של נוף שצלם, האזורים כהים יופיעו כאוויר מונע הדמיה לייזר (איור 3Bii). עם דבק עודף ואקריליק על coverslip יהיו רמה גבוהה של רקע הקרינה ואזורים בתחום שמחק את כפי שניתן לראות באיור 3Biii, באופן דומה, אם יש לכלוך על הנקודות הקטנות של הקרינה רקע החלון יהיו גלויות בשדה (איור 3Biv).
הצלחה של ICW הדמיה שנקבעה מראש על ידי השלמות של הטכניקה כירורגית, עם זאת, גם ICWs האופטימלי יכולה להיתקל בבעיות במהלך פגישת ההדמיה. ככזה, מגוון ומידת הבהירות קיימת בתמונות שנוצרו כפי שניתן לראות באיור 3. איכות התמונה בפרסום מוצגת באיור 3 ג מתרחשת כאשר הכל אופטימלי. למרות שזה לא אפשרי עבור כל העכברים, זה אינו ריאלי לצפות 80% מהתמונהים שנוצר כדי להיראות כך. אחד הפגמים העיקריים בהתקנת מיקרוסקופיה הנוכחית הוא השימוש בלייזרים הפוכים. עכברים צריכים להיות ממוקמים על גבם וזה גורם מתח מוגזם ואי נוחות שעלולה להוביל לנשימה מאומצת במהלך ההדמיה. זה מייצר דימוי "מרופד" כנשימה מפריעה למיצוע המתרחש במהלך ההדמיה, לפיה, כל שורת פיקסל היא הדמיה ארבע פעמים והממוצעות של ארבעה מוצג בתמונה הסופית. כל תנועה במיצוע, כמו שנגרמת על ידי נשימה מאומצת, ייצור חפץ שמופיע כקו על התמונה, כפי שניתן לראות באיור 3D. עכברים כי הם מספיק מורדמים במהלך ההדמיה עלולים להיתקל בבעיה זו גם. האפקט "המרופד" יכול להיות ירידה על ידי הגבלת התמונה לממוצע ב, אולם זה יהיה בתורו להפחית את איכות התמונה ולא יכול לחסל את הבעיה. לחלופין ניתן למקמו מחדש עכברים או retried כאשר נשימתו תקין. השימוש of כ 2PLM זקוף הייתי לשלול את הבעיה הזאת יכולים להיות צילמו עכברים "במצב פגיע". בעיה נוספת עם הדמיה ב2PLM הפוכה כוללת נגישות המוגבלת למיצוב ICW פעם אחת על העכבר הוא על המיקרוסקופ, וזה מוביל לתמונות "מפולחות", כמו אלה שראו ב3E הדמות. הנה לייזר וcoverslip לא בניצב לזה וכהדמיה כזו מתרחשת בזווית. התוצאה הוא הדור של תמונה "מפולחת" שבו הצדדים של שדה הראייה לא צילמו. הבעיה נפתרה בקלות עם מיקום מחדש של העכבר על מנת להבטיח את coverslip היא אופקית לחלוטין פעם אחת על ראש ההר כפי שניתן לראות באיור 3Aii.
המודל המוצג כאן היה בשימוש במיוחד כדי לבחון את התפקיד של BMDCs בכלי הדם של רקמת גידול ומדגים את היכולת להשתמש בשלושה ערוצים שונים בו זמנית (שרי, GFP, רחוק אדום - Alexa647 וAPC) מאקיןגרם CFP ומיותר SHG לסיפור המסוים הזה. הצלחנו עכברי תמונת longitudinally לתקופה של עד 8 שבועות, לומד את הגיוס ושילוב של תאי BM לתוך כלי הדם ברמת תא בודד, ללא השפעות מזיקות שנגרמו על ידי החלון. דגם זה מדגים את הקלות של איסוף מידע דינמי על המקור והיווצרות של כלי דם ואת האינטראקציה של סוגים שונים של תאים של עניין, שאבדו בעבר באמצעות ניתוח היסטולוגית נקודת סיום.
| שלב | בעיה | הנמקה | פתרון |
| 1.4 | עצם לנפץ | כלים קהים | לאסוף מח עצם בצורת עכבר טרי באמצעות מספריים מושחזים או להב אזמל טרי, שברי עצמות ימנעו הזרקת טלוויזיה |
| 1.5 | מיצוי נמוך (נמוך viscosity) | endplates העצם לחתוך מדי distally; שיטת איסוף עניים | עצמות יש לחתוך כproximally ככל האפשר ואספו עם העצם בתוך צינור איסוף למניעת התזה בחזרה זמן צריך להיות בילה כדי לחלץ בע"מ מקסימאלי ועם טיפול אם עכבר של בריכת יש צורך יותר מפעם אחת למ"ל 1 |
| הפקה גבוהה (צמיגות גבוהה) | חיץ אוסף נמוך | לדלל את הפתרון עם תוספת 0.1% BSA, התפצל לשלושה עכברי נמען עד 500 μl למקסימום עכבר | |
| 1.6 | הזרקה תוך ורידי רעה | התרחבות עניים וראות כלי | שפר את התרחבות עם מנורת חום. מקום עכבר בעוצר וריד זנב מובנה עם מקור אור כדי לסייע לגישה |
| 1 | עכברים חולים | זיהום | להקריב את העכברים על פי כללי מוסד. ודא זנבות מנוקים לפני הזריקה ולבדוק עקרותשל BM חולץ בתרבות |
| עכברים מתים | ספיגה לקויה בע"מ | בדקו% מספיגה בע"מ ניאון של עכבר מת. לייעל TBI לזן של עכברים בשימוש הגדל את כמות ההזרקה בע"מ (למשל להשתמש בעכבר תורם אחד לשני נמענים) | |
| 2.4 | דימום קטין | דורה נפרצה במהלך הקידוח | לחץ עם רפידות ג'ל ולשטוף ומלח סטרילית רציף |
| דימום סרן | המוח נפגע על ידי קידוח | להקריב את העכבר על פי הנחיות מוסד | |
| 2.8 | בועות אוויר תחת coverslip | קשר גרוע עם משטח קליפת המוח מונע מיקום נכון | הסר coverslip ולהוסיף תוספת PBS לצוף coverslip לחלון כדי להסיר בועות |
| 2.10 | זליגה של coverslip במהלך ההדבקה | ACRמסת ylic היא כבדה, הצבת לחץ על coverslip ומעבירה את coverslip מהדרך | פינצטה צריכה לשמש כדי להחזיק coverslip למטה תוך Vetbond ואקריליק מיושמים |
| 4.2 | הזרקה תוך ורידי רעה | התרחבות עניים וראות כלי | שפר את התרחבות עם מנורת חום. מקום עכבר בעוצר וריד זנב מובנה עם מקור אור כדי לסייע לגישה |
| 4.4 איור 3 ג | תמונות של אנשים בשורה " | עמל או נשימה לא סדירה | הסר את העכבר מהמסגרת ולאפשר להתאושש להגדיל את הרמה של חומר ההרדמה מנוהלת ולהתאים את המצב כדי להבטיח צוואר אינו מכווץ יתר על המידה או הוארך כדי למנוע נשימה |
| איור 3 ג | דימוי מקוטע ' | המוח אינו מקביל למטרות | להתאים את המיקום של coverslip כדי להבטיח שהוא שטוח |
| כלי השיט לא דמיין | הזרקה לא ראתה intravascularly | לעשות שוב זריקה לתוך וריד זנב חלופי, זנב חם כדי להבטיח התרחבות טובה | |
| רקע גבוה | Coverslip המלוכלכת, בועות אוויר, אקריליק | נגב coverslip עם מטלית לחה אתנול 70%, לא להשרות כעלולות לחדור מתחת אקריליק ולגרום נזק לרקמת המוח |
טבלת 2. פתרון בעיות. קו מנחה לפעולות מתקנות הנדרשות לאזורים בעייתיים של ההליכים.
1 סכימות. תרשים זרימה ניסויי. זה מדגים את ציר הזמן של אירועים באמצעות צעדים ניסיוניים 1-4. מודלים עכבר הם הגדרה יותר משבוע, כדי להבטיח בע"מ reconstitutes כראוי, ואינם מטופלים בתרופה עד שהיום 7 של גידול על מנת להבטיח את השתלים הסרטניים. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 1. הכינון בע"מ. () הליך מיצוי BM אני. Dissection של עצמות הגפיים האחוריות. השני. עצם ירך ועצם שוק גזורים מהגפיים האחוריות, ניקה ומוכן להפקה. III. עצמות עם סוף הצלחת הוסר וסמוק דרך, מדגים את המראה הלבן של העצמות הריקות. (ב ') שבו סכמות הוכחת ורידים לרוחב להזרקה ממוקמים בזנב.
מספר עמודים = "תמיד"> 
איור 2. דור ICW. () התקנת אספטי מומלצת (ב ') ט. פני גולגולת חשופה חושפת את ציוני הדרך הנדרשות לניתוח, צריך להיות ממוקם ICW באונה הימנית במרחק שווה מגבחת ומדא. השני. Periostieum הרים עם פתרון לידוקאין, מוכן להסרת . ג. וו שיניים הנדרש להסרת רסיס העצם שנוצר עם המקדחה. IV. סיים ICW עם אקריליק שיניים. (ג) שלושה חלונות להפגין דוגמא שחזור של השיטה.
איור 3. 2PLM תוצאות חזויות. את כל התמונות מראות ירוק בע"מ, גידול אדום, כלי דם כחולים (פסאודו בצבע אדום רחוק). () ט. מדגימה את מסגרת הראש ששומרת על זרימת isoflurane בתוך irradiator החיה הקטן. ניתן גם לראות collimator 8 מ"מ x 11 מסתובבים דרך gantry. השני. מאוס בהפוכות ממוקם במסגרת הראש הדרושה להדמיה, plastercine moldable מבטיחה ניתן לאכלס את כל החלונות. (ב ') תמונות הפגנתיות של התוצאות של בעיות עם הדור מהחלון אני. חלון אופטימלי, השני. חלון עם בועות אוויר שנלכדו מתחת, שפיכת אקריליק III על coverslip וIV. לכלוך על החלון עצמו. (ג) מדגיש את הבעיות שמתרחשות עם הדמיה בעקבות דור המוצלח של ICW. אופטימלי הדמיה השנייה חפצים. נשימהליצור תמונה 'מרופדת' ג. coverslip לא בניצב לליזר לייצר תמונה "מפולחת". לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. שימושים פונקציונליים והתאמות של המודל. () עיבוד ההדמיה CFP הודעה לפיה תמונת GFP יורד מתמונת CFP כדי לחשוף את התמונה האמיתית CFP שניתן overlayed שלושת ערוצים האחרים בלבן. ירוק בע"מ, גידול אדום, הלבן CSCS, כחולים (פסאודו בצבע אדום רחוק) כלי דם (ב ') הפגנה של סיבי קולגן שניתן הדמיה עם SHG. ירוק Dextran, אדום בע"מ, ציאן קולגן (ג) ט. תאי VEGFTrap בvitro להדגים את אות ה-GFP מיוצרת עם VEGFtrap. השני. in vivo ההדמיה מדגימה באופן ברור את תאי VEGFtrap ובנוסף מדגישה את הקלות של מיתוג ערוצים כדי להדגים את המערכת שאתה מסתכל. VEGFTRap הירוק + גידול, אדום בע"מ, כחול (פסאודו צבעוני הרבה אדום) כלי דם. (ד ') מדגים אוסף של העמסה בסטרומה של גידול ולא בתאים באופן ישיר, שמוצג על ידי חוסר כיסוי אות ירוק עם גידול אדום. גרין והעמסת, גידול אדום. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
Discussion
השלושה הערוצים המתוארים בכל התמונות עד כה הם מתחלפים לשלושה סמני עניין בדגמים אחרים וחוקרים יוצא עם סט של כלים רב ערך ל, ייראו סוגי תאים רבים ואינטראקציות. תכנון נדרש כדי להבטיח את כל הסמנים וסוגי תאים שילבו מולקולת הקרינה כתב בהצלחה בערוץ נפרד.
בנוסף לשלושת הערוצים הסטנדרטיים המשמשים כאן היינו גם יכולים לשלב את ערוץ CFP רביעי (איור 4 א) וקולגן מבוסס SHG ערוץ 7 (איור 4). זו מרחיבה את האפשרות להסתכל על אינטראקציות הסלולר in vivo, ובנוסף מאפשר לי משתמש מתחייב אוכלוסיית ערבוב ללמוד תאי תאי אינטראקציות ספציפיות תוך שמירה על שני ערוצים לסמנים אחרים. לדוגמה, יש לנו הסתכלנו תאים סרטניים (RFP) ותאי גזע סרטניים (CFP) ביחס של 1:03 בעניין בהשוואת intratumאינטראקציות אוראליות (איור 4 א). הבחנו כי 7 ימים לאחר ההשתלה של האוכלוסייה המעורבת היחס היה אישר ושתי אוכלוסיות התאים עדיין אפשר היו לראות.
ערוץ CFP מספק בעיות טכניות בשל החפיפה עם ערוץ ה-GFP בשניהם ספקטרום עירור ופליטה ובתור שכזו דורשת עיבוד הדמיה הפוסט להגדיר CFP האמיתי + תאים מאלה שהם למעשה ה-GFP +. עיבוד הדמיה הודעה יכול להתבצע על המיקרוסקופים 2 הפוטון שנבנו בתוכנת Zeiss LSM ישירות לפיו, את דמותו של GFP יורד מתמונת CFP וכתוצאה מכך תאי CFP האמיתיים נשאר מאחור (איור 4 א). הנחת היסוד ליחס החיסור תלויה בתמונות לא פחות בהירות ובשל לייזר CFP (458 ננומטר) fluorescing שניהם CFP ותאי GFP תוך לייזר GFP (488 ננומטר) הוא גבוהה מדי לתאים לזרוח CFP. בנוסף לCFP יש לנו גם היו מסוגלים להשתמש במערכים שפורסמו בעבר להסתכל על SHGרמות וכך מתארים את סיבי הקולגן המרכיבים את הקרום במרתף סביב כלי דם, (איור 4).
התאמה נוספת של מודל זה לקחה את היתרון של irradiator חיה מותאם אישית שנבנה קטן שבו יש את היכולת להשתמש בקרינה מודרכת stereotactic כדי להקרין קטעים של רקמה קטנה כמו 2 מ"מ קוטר. על ידי מיקוד החלון עם הקרנה אפשר להסתכל על ההשפעה שיש קרינה על הרקמה הבסיסית. יש לנו לאחרונה פרסמתי מחקר מסתכל על ההשפעה שיש קרינה על רקמת מוח נורמלית ביחס לגיוס של BMDCs לכלי הדם, מחפש במיוחד בתפקידם בשינויי רקמות קרינת פוסט. מצאנו כי הגיוס של BMDCs היה גם זמן ומינון תלוי ברקמה נורמלית 11.
זה אפשרי ללמוד את המכניזם של אספקה ואינטגרציה של תרופות במתן התרופה מתויג עם סמן פלואורסצנטי. במהלךהמחקר שלנו הצלחנו לעקוב אחר ייצור של VEGFTrap, תרופה אנטי angiogenic אשר חוסמת כל איתות VEGF באזור המקומי של ייצור 25. באמצעות שינוי גנטי בתאים הסרטניים שלנו להביע את גן VEGFtrap יחד עם IRES לEGFP (איור 4Ci) ובאמצעות "התורם" RFP BM הצלחנו תמונה EGFP: ייצור VEGFtrap, אינטראקציה וכלי דם בו זמנית (איור 4Cii) BMDC. זה הוכיח את הרבגוניות של המודל וערוצים זמינים. זה גם אפשרי להסתכל על קינטיקה של התרופה בשל ההבטחה של רזולוציה תא בודד. העמסה (GFP +) משמשת כדי לשרטט גידולים במהלך ניתוח על מנת להבטיח כריתה מקסימלי מושגת 26. על ידי הזרקה לוריד תוך הדמיה ניתן להוכיח כי התיחום מתרחש לא דרך הספיגה הפעילה של ההעמסה לתוך התאים הסרטניים עצמם, אלא דרך האוסף של התרופה לאזור סטרומה עם לאIME, נתפס על ידי חוסר שיתוף לוקליזציה 10 דקות לאחר ההזרקה של ההעמסה (איור 4D).
בסך הכל האסטרטגיה שלנו משלבת טכניקות חדשניות וקיימות כדי להשיג פלטפורמה ניסיונית ייחודית, וזה יתרון במחקר של אינטראקציות הסלולר דינמיות. אסטרטגיה זו הוכיחה להיות גישה לא יסולא בפז לבחינת התפתחות דינמית תא בודד ברזולוציה הגבוהה של BMDC, כלי דם במוח וגידול נורמלי בתגובה לטיפול, intracranially. Intravital הדמיה יכולה לספק הבנה טובה יותר של הרגולטורים המולקולריים של BMDC גיוס, הגירה ובידול בכלי דם תוך גולגולתי גידול במוח, כמו גם רבים אחרים תהליכים דינמיים וישימה לתחומי מחקר אחרים. גורמים המשוערת עיכוב המווסתים BMDC בשילוב עם אסטרטגיות טיפוליות אחרות יכולים לסייע בזיהוי העיתוי המדויק של טיפולים קומבינטורית. יתר על כן, אסטרטגיה זו יכולה להיות מותאמת ליחסי ציבור רבים בעתידojects ניצול לא רק בצבעים מכתים intravital vivo, אלא גם מעכבים מולקולריים קטנים וחלקיקים שהם מתויגים fluorescently ומאפשר לחוקרים להתחקות אחר דפוסי נדידה והפצה של תרופות ממוקדות יותר, כמו גם להסתכל longitudinally בקינטיקה שלהם.
Disclosures
יש מחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות למתקן מיקרוסקופיה האופטי מתקדם בנסיכת מרגרט החולים, בפרט ג'יימס Jonkman על עזרתם בהגדרה הראשונית של ערוצים במיקרוסקופ 2Photon. המחברים מבקשים להודות מיקוד מרחב ובזמן וההגברה של קרינת תכנית תגובה (STTARR) וסוכנויות המימון הקשורות אליה. אנו מודים לד"ר פיטר טונג, Dr.Iacovos מיכאל וDr.Andras נאגי לאספקת פלסמידים VEGFTrap והתיקונים לכתב היד שלהם ומשוב. המשך התמיכה והדיון מהצוות בBTRC כבר לא יסולא בפז ושהיינו רוצה לציון Dr.Abhijit גוהה לקלטו המדעי. עבודה מומנה על ידי NIH מענקי CIHR ו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
| B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
| ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
| Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
| 2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
| 10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
| CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
| AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
| Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
| Equipment | |||
| Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
| Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
| 22G Needle | BD | 305156 | |
| 27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
| Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| 2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
| 10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
| Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
| Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
| Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
| Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI | |
References
- Kienast, Y. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).
- Holtmaat, A. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation. Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).
- Kherlopian, A. R., et al. A review of imaging techniques for systems biology. BMC Systems Biology. 2, 74 (2008).
- Kedrin, D. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Perentes, J. Y., et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nature Methods. 6, 143-145 (2009).
- Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).
- Marker, D. F., Tremblay, M. -E., Lu, S. -M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).
- Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).
- Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation. PLoS ONE. 7, e38366 (2012).
- Tate, M. C., Aghi, M. K. Biology of angiogenesis and invasion in glioma. NURT. 6, 447-457 (2009).
- Aghi, M., Chiocca, E. A. Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors. Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).
- Nussenbaum, F., Herman, I. M. Tumor angiogenesis: insights and innovations. J. Oncol. 2010, 132641 (2010).
- Zhang, H. -r Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft. J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).
- Du, R., et al. HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).
- Rajantie, I. Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells. Blood. 104, 2084-2086 (2004).
- Shin de Patil, V. R., et al. marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma. Neoplasia. 7, 234-240 (2005).
- Purhonen, S. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).
- Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes. Cancer Research. 66, 9054-9064 (2006).
- Burrell, K., Zadeh, G. Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis. , InTech. (2012).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Tolentino, M. J., et al. Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization. Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).
- Holash, J. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).
- Shinoda, J., et al. Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium. , 1-7 (2003).
