Summary
우리는 소설을 설명
Abstract
우리는 성공적으로 통합 이전 intracranially 조직 구조 변화의 직접적인 장기적으로 시각화 할 수있는 새로운 플랫폼을 개발하는 intravital 2 광자 공 초점 현미경을 두개 창 (ICW) 기술 1-4를 설립했다. 실시간 방식으로 단일 셀 해상도의 영상은 조직의 '스냅 샷'크로스 섹션에서 유일하게 보이는 표준 엔드 포인트 학적 분석에서 제공하는 이외의 보충 동적 정보를 제공합니다.
형광 키메라 생쥐에서이 intravital 이미징 기술을 확립, 우리는 동시에 이미지 네 개의 형광 채널을 수 있습니다. 같은 GFP와 같은 + 골수 통합 찬란 세포에 의해, 조직 내에서 자신의 장기 마이그레이션, 통합 및 차별화를 공부 이러한 세포의 운명을 추적 할 수 있습니다. 이러한 mCherry 신경 교종 종양 라인으로 차 기자 셀의 추가 통합 charac 수 있습니다세포 상호 작용 : 세포의 terization. 조직의 미세 구조적 변화는 예를 들어 CD31 태그 항체와 덱스 트란 분자, 내 생명 염료와 항체의 추가를 통해 강조 할 수 있습니다.
더욱이, 우리는 이온화 방사선 투여 후 발생하는 역동적 인 조직 변화를 평가 할 수있는을 통해 플랫폼을 만들고, 정위 방사선을 제공하는 작은 동물 마이크로 조사기 우리의 ICW 이미징 모델의 조합을 설명합니다.
우리 모델의 현재의 한계는 뇌의 등쪽 축에 이미징을 제한, 하위 대뇌 피질의 표면에서 900 μM까지의 깊이로 제한됩니다 현미경의 투과도 있습니다. 두개골 뼈의 존재는 현재 유방 조직과 지방 패드 5-7을 연구하는 데 더 설립 활용 챔버 모델에 비해, ICW 좀 더 도전적인 기술적 인 절차를합니다. 또한, ICW PROVIDE에서 많은 도전 영상을 최적화.
Introduction
각종 병리에 대한 응답으로 뇌의 발생 구조 및 생물 학적 변화 및 치료 개입의 더 나은 이해는 치료 전략 개선을위한 중요합니다. 그러나 특히 두개 내 병변에 대한 이러한 구조 및 생물 학적 변화를 연구의 현재 과제 중 하나는 조직의 어려움과 시간적 진화와 생체 설정의 변경을 동적으로 진행을 연구하는 무능력이다. "창"기술의 세대는 이전 5-7 종양의 개발을 통해 연부 조직의 변화를 조사 성공적으로 입증했다. ICW 모델의 개발은 기술적으로 더 어려운, 기본 뇌 조직에 감염을 선동에 손상없이 두개골 뼈를 제거하는 필요에 의한 것으로 증명한다. 이전 논문 고해상도 명확한 메신저를 생산하는, 그러나 조직 8-10 시각화 두개골을 얇게하려고했습니다두개골 뼈의 나이를 완전 제거가 11이 필요합니다. 장기 영상 (30 일 +)는 최근에 영상 1,11 통해 가능한 옵션이되고있다 반복 이전에 짧은 시간 프레임은 5를 공부하고 있습니다.
지난 10 년간의 주요 목표는 종양의 치료에 대한 새로운 치료 표적을 제공하기 위해, 종양 형성과 진행 님의 질문에 답변 특히, 신 혈관 다음과 같은 병적 인 자극의 기원을 해명하는 것이 었습니다. 많은 논란이 종양 발달 또는 다음 방사선 동안 뇌에서 새로운 혈관의 근원 주위에 남아있다. 전통적으로 혈관은 혈관 신생, 새로운 혈관이 기존 선박 12의 발아에서 형성하는 과정을 통해 발생하는 것으로 간주되었다. 최근의 연구는 그러나 vasculogenesis 이전에 가정 배아 프로세스가 병적 인 혈관의 형성에 더 중요한 역할을 할 수 있습니다하는 것이 좋습니다. 버지니아의sculogenesis 차례로 누른 다음 바로 새로운 혈관 내피 12-14의 형성에 관여하는 골수에서 성인 angioblast 대응의 채용을 포함한다. 증거를 축적하는 내피 전구 세포가 종양 매개 15-17 님의 질문에 새로이 혈관 형성을 시작하기 위해 골수에서 동원을 나타냅니다. 그러나, 이러한 연구 결과는 병적 인 자극과 치료에 18-21에 대한 응답의 종류에 다양한 기여 비율과 혈관 내피 세포에 이러한 골수 유래 세포의 직접적인 기여 (BMDCs)에 대한 모순 된 증거를 제공합니다.
따라서 종양의 혈관에와 치료 님의 질문에 답변 BMDC 통합 과정의 반복 장기 연구 고해상도 intravital 이미징을 허용 재현 실험 방법을 확립하는 것은 매우 유용합니다. 표준 조직 학적 기술은 동적 INFOR을 제공하지mation은 neovasculature을 야기하기 때문에 결정적으로 세포 상호 작용의 메커니즘을 설명 할 수 세포의 장기 생존, 분화 및 통합을 결정해야합니다.
우리는 두개 이온화 방사선 및 종양의 성장을 모두 다음 BMDC 모집의 변화 정도, 그러나 인 채용, 병리 특정 사이트가 아닌 전체 두개 내 조직 11,22의 침공이 우리의 실험 방법을 사용하여 보여 주었다. 우리는 모집 한 동물 11,22의 반복 영상으로 시연 시간에 민감한 패턴을 따르는 것으로 나타났습니다. 찬란 태그 종양 세포가 직접 자신의 내피 세포를 형성하는 종양 세포 분화의 가능성을 강조하기 위해 내피 세포 내 중요한 CD31 항체 군데 추적 할 수 있습니다 약자 마찬가지로 생체 내 이미징 또한 종양 세포의 흉내에 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
우리 모델의 적응성뿐만 아니라, 위에서 언급 한 세포 - 세포 상호 작용을 설명하기 위해, 우리는 약물 세포 상호 작용을 연구 할 수 있었다. 우리는 AMD3100, SDF-1 억제제 및 BMDC 모집 11에 관련된 네트워크를 신호의 역할과 같은 약물 억제제를 살펴 보았다. 마찬가지로 우리는 유전자 GFP 분자에 IRES를 통해 함께 VEGFTrap, VEGF 억제제 25를 표현하는 U87 신경 교종 이종 이식 세포 밖으로 설계했다. RFP + BM을 사용하여 우리는 VEGF가 혈관에 BMDCs의 채용에 미치는 역할을 연구 할 수 있습니다. 가장 최근에 우리는 MEC에서 찾고 약물 동력학을 연구하는 모델을 활용 한세포 수준에서 종양의 윤곽을 약 형광 26 일 뒤에 hanism. 의 사용을 통해 사용자 정의 - 기본 우리가 치료에 종양 BMDCs 모두의 반응을 평가하기 위해 정위 전달 방사선을 통합 할 수있게되었습니다 집 작은 동물 조사기합니다.
우리의 새로운 intravital 이미징 방법을 연구자의 사용을 통해 조직 변화의 많은 기능 및 생물 학적 기능의 해명을 돕고, 각종 병리 및 시스템에서 발생하는 단일 셀의 실시간 변화에 대한 통찰력을 얻게 될 것이다.
Protocol
모든 동물 작업은 동물 보호하에 수행 및 사용 COMMITEE 관련된 모든 지침, 규정 및 규제 기관 준수 프로토콜을 승인하여 실행되었습니다.
문제 해결 참조 표 2.
1. 골수 재구성 (선택 사항) 그림 1 (30 분 준비, 마우스 당 5 분)
모든 수술은 멸균 소독 장비와 엄격한 무균 기술을 사용하여 수행해야합니다.
한 기증자 마우스를 재구성 개의 호스트 쥐됩니다.
- Gammacell 40 '강요하는'조사기의 중심 안쪽에, 머리를 보호하는 납 마취시키다받는 사람 NODscid 마우스 및 위치.
- 2.5 Gy의 전신 방사선 조사 (TBI)과 NODscid 쥐를 조사.
중요한 단계 : TBI의 최적화 인해 충분한 숙주 면역 CE에 필요한 용량의 변화에 필요할 수 있습니다다른 마우스 변종 LL 고갈.
일시 정지 점 : 호스트 마우스를 사전에 조사 할 수 있지만 조사에서 24 시간 이내에 사용하여야한다.
- 기관 동물 관리위원회의 지침에 따라 기증자의 쥐를 안락사. 뒷다리를 청소하고 뼈 (그림 1ai, 1aii)에서 모든 여분의 조직을 벗기는 모두에서 경골과 대퇴골을 제거합니다.
중요한 단계 : 비골 뼈가 매우 좁은 루멘으로 인해 사용 가능한 수 없습니다.
- 네 추출 된 뼈의 양쪽 끝에서 엔드 플레이트를 제거하고 그들이 모양 (그림 1aiii) 흰색 때까지 22 G 바늘 1 ML 멸균 PBS를 사용하여 세척하십시오. 참조 표 2.
- 잘 추출 된 골수 (BM) 현탁액을 혼합 세 27 G 투베르쿨린 주사 바늘에 300 μl를 그립니다. 추출 된 BM은 약 2 × 10 7 세포를 포함하고 있어야합니다3 호스트 마우스 reconstitutions 충분합니다. 참조 표 2.
- 단계 1.1 (그림 1b)로부터 3 이전 조사 NODscid 마우스의 측면 꼬리 정맥에 현탁액을 주입한다. 참조 표 2.
주의 : BM의 불임을 확인하기 위해 우리는 감염을 확인하기 위해 24 시간 동안 나머지 BM과 문화를 도금 추천 주입했다. 이 시점에서 사망의 주요 원인은 새로 재구성 생쥐에 감염이다.
2. 두개 창 생성 - 그림 2 (마우스 당 30 분)
모든 수술은 (그림 2A) 동물을 따뜻하게 유지하기 위해 멸균 멸균 장비 및 열 램프 아래 엄격한 무균 기술을 사용하여 수행해야합니다.
- IACUC 승인 마취, 0.5 Avertin의 IP 주입 마취시키다받는 사람 NODscid 마우스의 머리를 보호하는 납 ㎎ / g와 위치, 중심 내부Gammacell 40 '강요하는'조사기. 두피에서 머리카락을 제거합니다. 또한 각막 탈수를 방지하기 위해 눈물 젤을 적용합니다.
- 다음 베타 딘 용액 및 알코올 우선 깨끗한 두피, 그럼 그냥 눈 위의 귀 중간에서 절개를합니다. 두개골과 두개골 표면의 랜드 마크 (그림 2Bi)을 노출, 두피 3mm 두 번째 절개면을 제거합니다.
- 2 % 리도카인 주사하여 골막을 상승 : 에피네프린 용액을 두개골 표면 (그림 2Bii)에서 멀리 해부하다.
- 2.7 mm 관상 톱 드릴을 사용하여 람다와 브레 그마 사이의 오른쪽 반구의 피질을 통해 두개골의 2.7 mm의 원형을 약화. 드릴 (그림 2Biii)과 뼈를 관통하지 마십시오. 참조 표 2.
중요한 단계 : 드릴 두개골을 통과하면 뇌의 표면은 추가 TRA에 영향을 미치는 결과를 손상 될 수UMA. 또한 과도한 출혈 생성되는 명확한 창을 방지 발생합니다.
- 해부 핀셋 및 치과 후크와 고의적하지만 통제 힘 (그림 2Biii)를 사용하여 약해진 뼈 플랩을 제거합니다.
- 종양의 병리보고 (선택 사항) 단계 2.5에서 생성 된 윈도우의 중앙에 선택한 종양 세포 라인을 (형광 리포터 유전자) 주사.
- 정위 프레임에 세포 현탁액 및로드 바늘로 10 μl를 30 G 해밀턴 주사기를로드합니다.
중요한 단계 : 셀 번호 필요 성장의 이용 및 타임 라인에서 종양 세포에 최적화해야합니다. U87 문화를 위해 우리는 마우스 당 10 μL에 2 × 10 5 세포를 사용합니다. - 디지털 정위 프레임에 마우스를로드하여 생성 된 윈도우의 중앙 지점에 바늘을 맞 춥니 다.
- 그냥 대뇌 피질의 표면을 건 드리면 디지털 좌표를 다시 아래 바늘까지.
- 낮은어는 대뇌 피질의 조직으로 3.2 mm의 바늘과 깊이 3mm에 주입.
- 바늘을 집어 천천히 다음 프레임에서 마우스를 제거합니다.
중요한 단계 : 1 분의 시간을 통해 솔루션을 주입하고 다시 감소 흐름을 보장하는 위치에 따라 주입 바늘을 둡니다.
중요한 단계 : 약간의 출혈이 발생하는 경우 피상적 인 출혈을 멈추게하기 위해 1-5 분 동안 멸균 식염수로 세척하십시오. 다음 단계를 진행합니다.
- 정위 프레임에 세포 현탁액 및로드 바늘로 10 μl를 30 G 해밀턴 주사기를로드합니다.
- 뇌 조직은 관개 유지하기 위해 멸균 PBS의 드롭 뇌의 표면을 적 십니다.
- 생성 된 2.7 mm 창 주위를 완전히 밀봉하는 뇌의 표면에 3 개 mm coverslip에 플로트. 참조 표 2.
- 건조한 주변의 두개골는 두개골 뼈와 장소에 커버 슬립에 봉인 두피 조직에 전체 노출 두개골에 vetbond 적용 뼈. 그것은 유리에서 누출 이미징 가능성을 감소하므로 과잉 적용되지 않습니다.
- 미X 신선한 치과 아크릴 분말 및 솔루션은 약 30 % (W / V), 그리고 vetbond의 맨 위에 적용됩니다. 단단한 물개를 보장하려면 약간 유리 coverslip을 가장자리 (그림 2Biv)에 아크릴을 중복. 참조 표 2.
주의 : 치과 우리는 장갑과 절차 전반에 걸쳐 마스크 사용을 권장 그래서 아크릴은 매우 위험합니다.
중요한 단계 : 치과 아크릴이 좋은 도장을 보장하고 초과 줄이기 위해 성형시 유연한 유지해야합니다. 창에 아크릴 구축 이미지를 흐리게합니다.
- 마우스가 따뜻한 새장에 복구 할 수 있습니다.
3. 정위 방사선 (선택 사항) - 그림 3 (마우스 당 25 분)
변형 사용 등의 최적화가 필요합니다 다른 irradiators에 존재합니다. 우리는 맞춤 설계 조사기를 사용했습니다.
- 쥐를 마취시키다0.5 리터 O 2 분, 그리고 정위 조사기 내부 사용자 정의 머리 고정 장치 위에 위치한다 (그림 3Ai)과 절차 전반에 걸쳐 1.5 % 다음 유도에 대해 4 %의 isoflurane을 사용.
- X-선 튜브 2mm 알루미늄 필터를 통해 40 kVp의 0.05 mA에서 실행하는 360 ° 콘 빔 CT 검사를 얻습니다. 이 등쪽 복부 방향으로 중심이되도록 오른쪽 반구에 방사선 isocentre을 연출, 무대의 움직임을 안내하는 이미지를 사용합니다.
- 반구 겨냥, 8mm X 11mm 블록을 삽입합니다.
중요한 단계 : 콜리메이터은 여러 가지 설정을 위해 설계 할 수 있도록 두뇌의 다른 부분을 포함하거나 제외하도록 개선 할 수 있습니다. 8mm X 11mm은 뇌의 반구 영역을 정의합니다.
- 또한 뇌 아나의 배치를 강화하는 시준기를 통해 최고 (AP)와 바닥 (PA)에서 모두 하나의 CT 직교 이미지를 얻을 수omical 뼈 구조 재현성을 사용할 수 있습니다.
- 환율 0.93 mm 구리 치료를위한 알루미늄 필터는 필터와 X-선 튜브 AP 방향의 상단에서 225 관전압 및 13mA에서 실행하여 원하는 방사선 량의 절반을 관리 할 수 있습니다.
- 아래 위치로 갠트리를 반환하고 X-선 튜브는 225 kVp의 13 석사 형태 PA 방향으로 아래에서 실행 다시 방사선 량의 두 번째 절반을 관리 할 수 있습니다.
중요한 단계 : 그것은 상단과 뇌 조직을 통해 RT 구배를 줄이기 위해 아래 모두에서 조사하는 것이 필수적입니다, 그것은 또한 두뇌의 중심 isocentre의 정렬과 함께 제품.
4 생체 내에서 두 개의 광자 레이저 현미경 -. 그림 3 (세션 당 1-3 시간)
변형 사용 등의 최적화가 필요합니다 다른 현미경에 존재합니다. 우리는 칼 자이스 혈구 LSM510 메타 레이저 스캐닝 Confoc 사용알 현미경.
- IACUC 승인 마취제, 알코올 스프레이를 사용하여 0.5 ㎎ / g와 깨끗한 창에서 Avertin의 IP 주입 쥐를 마취시키다.
- (선택 사항) 이전 이미지에 꼬리 정맥에 앞서 이미징 태그 혈관 염료 5-10 분, 주사. Alexa647 - 덱스 트란은 0.35 μg 0.2 ㎍ / g 이하에서 사용 / g 또는 APC-CD31에 사용됩니다. 표 2를 참조하십시오.
- (선택 사항) 종양을 윤곽을 그리다, 이미징 전에 7.7 ㎎ / ㎏, 5 분의 복용량에 꼬리 정맥을 통해 형광을 주입한다. 참조 표 2.
- 생성 된 키메라 마우스에 사용되는 형광에 의해 결정되는 공 촛점 현미경 설정 채널. 표 1은이 모델에 설명 된 채널을 보여줍니다.
- 움직일 수있는 현미경 스테이지에 마우스를 거꾸로 성형 플라. (그림 3Aii) 참조 표 2 위치에 머리를 고정.
- 첫 번째 채널 레이저의 전원을 켜고 ICW의 중앙에 위치하는 데 사용합니다.
- 배 렌즈를 사용하고 더 높은 해상도의 이미지 맵으로 사용하는 전체 창 이미지를 촬영.
- 이미지는 최상의 이미지 품질을 얻으려면 10X 및 20X '장거리'렌즈를 사용하여 수행해야합니다.
중요한 단계 : 2PLM에 채널과 목표는 그들이 올바른 형광을 강조하기 위해 사전에 생쥐 모델의 이미지를 체외에서 설계 한 세포를 사용하여 설정해야합니다.
| 형광 | CFP | GFP / 형광 / FITC | mCherry / RFP / DsRed를 | APC / 알exa647 | SHG자가 형광 |
| 여기 레이저 | 458 nm의 | 488 nm의 | 543 nm의 | 633 nm의 | 카멜레온 레이저 820 nm의 |
| 컬렉션 필터 | 480-520 nm의 | 500-550 nm의 | 565-615 nm의 | 650-710 nm의 | 390-465 nm의 |
표 1. 사용자에 대한 형광 설치가. 가이드 모델에서 사용할 수있는 각 채널에 사용되는 여기 레이저 및 발광 스펙트럼 수집기를 볼 수 있습니다.
Representative Results
NODscid 생쥐의 BM을 재구성의 선택적 단계 NODscid '호스트'생쥐의 100 % 형광등 '기증자'BM의 80 % 흡수 될한다, TBI의 그러나 최적화는 다른 비의 재구성을 강화해야합니다 - immunocompromsed 변종. 쥐가 성공적으로 재구성하는 경우 그들이 아프면 절차에 따라 신속하게 죽을 것이다, 약화 된 마우스는 추가 음식과 물을 소스가 필요할 수 있습니다.
끝나면 ICW는 그림 2Biv에서 본 것과 같다. 이것이 두개골과 조인에 힘을주기 때문에 유리 커버 슬립을 둘러싼 아크릴 능선을 가지고 이상적입니다. 완벽한 창 재현하고 그들의 세대 (그림 2C)에 따라 최대 8 주까지를 위해 반복적으로 영상을 허용합니다.이 최적의 창문을 통해 생산 이미지는 그림 3Bi에서 본 것과 같이 볼 것이다. 창 생성에 결함이 가난한 이미지를 생성합니다예를 들어 품질, 창 아래에 기포가 몇 군데되는 뷰의 모든 필드를 방지하고, 지역은 공기가 레이저 영상 (그림 3Bii)을 막아줍니다. 어둡게 나타납니다 coverslip을에 여분의 접착제와 아크릴 배경의 높은 수준이 될 것입니다 형광과 먼지가 배경 형광의 창 작은 점에가 유사하면, 그림 3Biii에서와 같이 도말되는 필드의 영역 필드 (그림 3Biv)에서 볼 수 있습니다.
ICW 영상의 성공은 수술 기법의 무결성에 의해 미리 결정하지만, 심지어 최적의 ICWS는 영상 세션 동안 문제가 발생할 수 있습니다. 같은 선명도의 범위와 정도는 그림 3에서 볼 수 생성 된 이미지에 존재합니다. 모든 최적의 경우 그림 3C에서 묘사 출판 품질의 이미지가 발생합니다. 그것은 모든 쥐를 할 수 없습니다 있지만 이미지의 80 %를 기대 가능한 것입니다의는 다음과 같이하기 위해 생성. 현재의 현미경 설정의 주요 결함 중 하나는 거꾸로 레이저를 사용하는 것입니다. 마우스 이미징 동안 호흡을 고심한 흔적으로 이어질 수 과도한 스트레스와 불편 그들의 뒤를이 결과에 위치해야합니다. 호흡이 발생 평균화 방해로이 '늘어선'이미지를 만들어 이미징 동안, 그것에, 각 픽셀 행이 네 번 네의 평균은 최종 이미지에 표시됩니다 군데 있습니다. 호흡, 그림 3D로 볼 수있는 이미지를 선으로 나타납니다 이슈를 생성합니다 수고하여 이러한 것과 평균화하는 동안 움직임이 발생했습니다. 영상 중에 충분히 마취 있습니다 마우스는이 문제가 발생할 수 있습니다. '늘어선'효과가 on으로 평균 이미지를 제한함으로써 감소 될 수있다, 그러나 이것은의 이미지 품질이 저하 설정하고 문제를 제거 할 수 없습니다. 또는 마우스를 재배치하거나 호흡이 정상화 될 때 시도 할 수 있습니다. 사용 O쥐가 '쉬운 위치에'몇 군데 수 있으므로 F 똑바로 2PLM이 문제를 부정한다. 거꾸로 2PLM에 이미지와 추가 문제는 마우스 현미경이며,이 그림 3E에서 볼 수있는 것과 같은 '세그먼트'이미지에 이르게되면 ICW의 위치에 대한 제한된 액세스를 포함합니다. 여기에 레이저와 coverslip에가 서로 수직 위치와 같은 이미징 각도로 발생하지 않습니다. 시야의 측면이 이미지를 만들지 않는 '분할'이미지가 생성됩니다. 이 문제는 쉽게 커버 슬립이 그림의 3Aii에서 볼 마운트 머리에 한 번 완전히 수평이되도록하기 위해 마우스의 위치 조정으로 해결됩니다.
가는데 - 모델은 특히 종양 조직의 혈관에 BMDCs의 역할을 검사하는 데 사용 동시에 세 개의 서로 다른 채널을 사용하는 능력 (Alexa647 및 APC 체리, GFP, 원적외선)를 사용하는 방법을 보여줍니다되었다 여기에 제시g이 특정 이야기 CFP 및 SHG 중복. 우리는 창에 의해 초래되는 부정적인 효과, 단일 세포 수준에서 혈관으로 BM 세포의 모집 및 통합을 공부하고, 최대 8 주까지에 대한 길이 방향으로 이미지를 마우스 수 있었다. 이 모델은 소스와 혈관의 형성 이전에 엔드 포인트 학적 분석을 통해 손실 관심의 다른 세포 유형의 상호 작용에 대한 동적 정보를 수집의 용이성을 보여줍니다.
| 단계 | 문제 | 추리 | 해결 |
| 1.4 | 산산조각 뼈 | 무딘 도구 | 날카롭게 가위 나 신선한 메스 블레이드를 사용하여 새로운 마우스를 형성하는 골수를 수집, 뼈 조각은 TV 주입을 억제합니다 |
| 1.5 | 낮은 추출 (낮은 viscosit을Y) | 뼈 종판은 원심 절단, 가난한 수집 방법 | 뼈로 근위부 가능한 잘라 다시 시작을 방지하기 위해 수집 관 내부의 뼈 수집해야 시간은 최대한주의해서 BM를 추출하기 위해 지출해야한다 1 ML에 필요한 풀 하나 이상의 마우스를 놓으면 |
| 높은 추출 (고점도) | 낮은 수집 버퍼 | 여분의 0.1 % BSA와 솔루션을 희석 마우스 당 최대 500 μL의 세 가지받는 마우스로 분할 | |
| 1.6 | 나쁜 정맥 주사 | 별로 혈관 확장 및 혈관 가시성 | 열 램프와 팽창을 향상시킬 수 있습니다. 액세스를 지원하기 위해 광원에 내장 된 꼬리 정맥 고정 장치에서 개최 마우스 |
| 1 | 아픈 쥐 | 감염 | 기관의 규칙에 따라 마우스를 희생. 꼬리가 사전에 주입 청소 확인하고 불임을 확인문화 추출 BM의 |
| 마우스가 죽을 | 별로 BM의 이해 | 죽은 쥐의 형광 BM 이해의 %를 확인합니다. 사용중인 마우스의 변형에 대한 TBI 최적화 BM 주입 (예 : 두 개의받는 사람 하나를 사용 기증자 마우스)의 양을 증가 | |
| 2.4 | 약간의 출혈 | DURA 시추하는 동안 위반 | 젤 패드와 압력 및 지속적인 멸균 생리 식염수 세척 |
| 주요 출혈 | 뇌는 훈련에 의해 손상 | 기관 지침에 따라 마우스를 희생 | |
| 2.8 | coverslip을 아래에 공기 방울 | 대뇌 피질의 표면과 접촉 불량 적절한 배치를 방지 | coverslip을 제거하고 거품을 제거하기 위해 창에 coverslip을을 떠 여분의 PBS를 추가 |
| 2.10 | 접착 동안 coverslip에의 실수 | ACRylic 질량은 커버 슬립에 압력을 배치, 무겁고 방식 coverslip을 밖으로 이동 | vetbond 아크릴이 적용되는 동안 핀셋이 커버 슬립을 억제하는 데 사용되어야 |
| 4.2 | 나쁜 정맥 주사 | 별로 혈관 확장 및 혈관 가시성 | 열 램프와 팽창을 향상시킬 수 있습니다. 액세스를 지원하기 위해 광원에 내장 된 꼬리 정맥 고정 장치에서 개최 마우스 |
| 4.4 그림 3C | '지어'이미지 | 수고 불규칙한 호흡 | 프레임에서 마우스를 제거하고 복구 할 수 있습니다 마취제 투여 수준을 향상시키고 목을 보장하기 위해 위치를 조정은 지나치게 근육이 수축하거나 호흡을 방지하기 위해 확장되지 않습니다 |
| 그림 3C | '분단'이미지 | 뇌는 목표에 평행하지 않습니다 | 이 평평하기 위해 coverslip을의 위치를 조정 |
| 용기 가시화되지 | 주입 intravascularly 볼 수 없습니다 | 좋은 혈관을 보장하기 위해 대체 꼬리 정맥, 따뜻한 꼬리에 주사를 다시 | |
| 높은 배경 | 더러운 coverslip에, 공기 거품, 아크릴 | 습기 70 % 에탄올 천으로 coverslip을 닦아 아크릴에서 침투 수로 흡수하고 뇌 조직을 손상하지 않습니다 |
표 2. 문제 해결. 절차의 문제 영역에 대한 필요한 시정 단계 지침.
도식 1. 실험 흐름도.이 실험 1-4 단계를 통해 이벤트의 타임 라인을 보여줍니다. 마우스 모델로, 주를 통해 설치할 수 있습니다종양 이식을 보장하기 위해 종양의 하루 7.까지 BM이 제대로 재구성하고, 약물로 치료되지 않도록 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 1. BM 재구성. (A) BM 추출 과정에게 뒷다리 뼈의 전. 해부. 뒷다리에서 II. 해부 대퇴골 및 경골, 청소 및 추출에 대 한 준비입니다. III. 본즈 엔드 플레이트는 흰색 외관을 보여주는 통해 제거 플러시 빈 뼈. (B) 주입을위한 측면 정맥이 꼬리에 배치되는 도식이 보여.
그림 2. ICW 생성. (A) 권장 무균 설치 (B) 나. 노출 두개골 표면은 수술에 필요한 랜드 마크를 보여, ICW는 브레 그마와 LAMDA에서 등거리 오른쪽 반구에 위치해야한다. II. Periostieum는 제거 준비 리도카인 용액을 해제 . III. 드릴 생성 된 뼈 조각의 제거를 위해 필요한 치과 후크. IV는. 치과 아크릴 ICW를 마쳤다. (C) 세 가지 예를 들어 창 방법의 재현성을 보여줍니다.
그림 3. 2PLM 예상 결과. 모든 이미지는 녹색 BM, 빨강 종양, 청색 (의사 컬러까지 레드) 혈관을 보여줍니다. (A) 전.이 작은 동물 조사기 내부 isoflurane을 흐름을 유지 헤드 프레임을 보여줍니다. 8 × 11mm 시준기도 갠트리. II. 마우스를 움직이는 볼 수있는 영상에 필요한 헤드 프레임에 배치 반전, 성형 plastercine 모든 창을 수용 할 수 있도록합니다. 문제의 결과의 (B) 실증 사진 i로부터의 창 세대. 최적의 창 II. coverslip에와 IV를 통해 III 아크릴 유출, 아래에 갇혀있는 공기 방울 창. 창 자체에 먼지가. (C) ICW 나는 성공적으로 세대 다음 영상으로 발생하는 문제를 강조 표시합니다. 최적의 영상 II는 . 호흡 유물생성 '늘어선'이미지 III. coverslip에이 레이저 '세그먼트'이미지를 생성에 수직하지. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 4. 기능을 사용하고 모델의 적응. GFP 이미지가 흰색 다른 세 개의 채널을 오버레이 할 수있는 진정한 CFP 이미지를 나타 내기 위해 CFP 이미지에서 뺀 약자 (A) CFP 후 영상 처리. 녹색 BM, 빨강 종양, 화이트 암줄 기세포, 파랑 (의사 컬러까지 레드) 혈관 (B) SHG로 이미징 할 수있는 콜라겐 섬유의 데모. 그린 덱스 트란, 레드 BM, 시안 콜라겐 (C) 나. vitr의 VEGFTrap 세포VEGFtrap. II로 제작 GFP 신호를 보여 O를. 생체 내 이미징 명확하게 VEGFtrap 세포를 보여주고뿐만 아니라 당신이보고하는 시스템을 설명하기 위해 채널 전환의 용이성을 강조 표시합니다. 녹색 VEGFTRap + 종양, 레드 BM, 청색 (컬러 의사 지금까지 적색) 혈관이. (D) 종양의 기질에 형광의 컬렉션을 보여줍니다 아니라 세포에 직접 빨간색, 종양의 녹색 신호 오버레이의 부족에 의해 표시. 녹색 형광 빨강, 종양. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
Discussion
모든 이미지에 설명 된 세 개의 채널은 지금까지 수많은 종류의 세포와 상호 작용을 볼 수있는 도구의 귀중한 세트를 다른 모델과 잎 연구자의 관심 개의 마커 교환 할 수있다. 계획은 모든 마커와 세포 유형이 성공적으로 별개의 채널 리포터 형광 분자를 통합했습니다 확인하는 데 필요합니다.
여기에 사용되는 표준 3 채널 외에 우리는 또한 네 번째 CFP 채널 (그림 4A)과 SHG 기반의 콜라겐 채널 7 (그림 4B)를 통합 할 수 있었다.이 생체 내에서와뿐만 아니라 세포의 상호 작용보고의 가능성을 확장 할 수 있습니다 사용자가 다른 마커 두 채널을 유지하면서 특정 세포 - 세포 상호 작용을 연구하는 혼합 인구를 수행합니다. 예를 들어, 우리는 그들의 intratum 비교에 관심을 1:3 비율로 종양 세포 (RFP) 및 암 줄기 세포 (CFP)에서 보았다구두 상호 작용 (그림 4A). 우리는 혼합 인구의 7 일 후 주입이 비율이 확정 된 두 세포 집단은 여전히 볼 수있다 것을 관찰했다.
CFP 채널 + 세포가 실제로 GFP +되는 것과 진정한 CFP을 정의하는 게시물 이미지 처리를 필요로 여기 및 발광 스펙트럼 모두와 같은 GFP 채널에 중복으로 인해 기술적 인 문제를 제공합니다. 글 이미징 처리 자이스 혈구 LSM 소프트웨어를 직접 그것에 내장 된 2 광자 현미경에서 수행 할 수 GFP 이미지는 (그림 4A) 남아되는 진정한 CFP 세포에서 발생 CFP 이미지에서 뺍니다. 비 공제의 전제는 동일하게 밝은 이미지에 의존하고 GFP 레이저 (488 nm의) 반면 CFP와 GFP 세포를 모두 형광 CFP 레이저 (458 nm의)에 의한 CFP 세포를 형광 너무 높다. CFP뿐만 아니라 우리는 또한 SHG보고 이전에 출판 된 설정을 사용할 수있게되었습니다수준 등 혈관을 둘러싼 기저막 (그림 4B)를 구성하는 콜라겐 섬유를 묘사.
이 모델의 또 다른 적응 직경 2mm처럼 작은 조직의 섹션을 조사하는 정위 유도 방사선을 사용하는 능력을 가지고 사용자 정의 내장 된 작은 동물 조사기의 장점을 취했습니다. 조사에 창을 대상으로 그것에는 기본 조직에 영향 방사선에 볼 수 있습니다. 우리는 최근 효과 방사선을보고 연구를 발표 한 혈관에 BMDCs의 채용과 관련하여 정상 뇌 조직에 있으며, 게시물 방사선 조직 변화의 역할에 특별히 찾고. 우리는 BMDCs의 채용 시간과 정상 조직 11에 따라 용량을 모두 것으로 나타났습니다.
그것은 마약을 제공하는 치료의 전달과 통합의 메커니즘을 연구하기 위해 가능한 것은 형광 마커로 태그됩니다. 시우리의 연구는 우리가 VEGFTrap의 생산, 생산 25의 지역에있는 모든 VEGF 신호를 차단 항 혈관 약을 추적 할 수 있었다. VEGFtrap 생산 BMDC 상호 작용과 동시에 혈관 (그림 4Cii) : 유전자 EGFP에 IRES와 결합 VEGFtrap 유전자 (그림 4Ci)를 표현하기 위해 종양 세포를 수정하고 RFP '기증자'BM을 사용하여 우리는 이미지 EGFP를 할 수 있었다. 이 모델과 사용 가능한 채널의 다양성을 보여 주었다. 그것은 단일 셀 해상도의 약속으로 인해 약물 동력학 보는 것도 가능하다. 형광 (GFP +)는 최대한 절제는 26 달성하기 위해 수술 중에 종양을 묘사하는 데 사용됩니다. 정맥 동안 영상을 주입하여 그 묘사가 종양 세포 자체에 형광의 적극적인 이해를 통해 NOT 발생하는 것을 입증 할 수 있지만 대신 약물의 컬렉션을 통해 T와 기질 영역에형광 (그림 4D)의 주입에 따라 공동 현지화 10 분의 부족에 의해 볼 IME.
전반적으로 우리의 전략은 동적 세포 상호 작용의 연구에 유리한 독특한 실험 플랫폼을 달성하기 위해 소설과 기존 기술을 결합합니다. 이 전략은 intracranially, 치료에 반응 BMDC, 종양과 정상 뇌 혈류의 고해상도 단일 셀 동적 변화를 조사하기위한 매우 중요한 방법이 될 입증되었습니다. Intravital 이미징 BMDC 채용, 이동 및 분화 두개 내 뇌 종양 혈관에서뿐만 아니라 다른 연구 분야에 적용 할 수 많은 다른 동적 프로세스의 분자 규제의 더 나은 이해를 제공 할 수 있습니다. 다른 치료 전략과 함께 BMDC을 조절 억제 추정 계수는 조합 치료의 정확한 타이밍의 식별 도움이 될 수 있습니다. 또한이 전략은 많은 미래의 홍보에 적용 할 수 있습니다생체 intravital 염색 염료에서뿐만 아니라 활용,뿐만 아니라 작은 분자 억제제 찬란 연구자뿐만 아니라 자신의 반응 속도에 세로 방향으로 보면 더 많은 표적 치료제의 유통 및 이동 패턴을 추적 할 수 있도록 태그 나노 입자 객체들의.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 2Photon 현미경의 채널의 초기 설정에서 자신의 도움을 특히 제임스 Jonkman에, 마가렛 공주 병원에서 고급 광학 현미경 시설을 감사하고 싶습니다. 저자는 방사선 응답 (STTARR) 프로그램 및 계열사 자금 지원 기관의 시공간적 타겟팅 및 증폭을 인정하고 싶습니다. 우리는 VEGFTrap 플라스미드를 공급하고 그들의 원고 수정 및 피드백 박사 피터 Tonge, Dr.Iacovos 마이클과 Dr.Andras 나기 감사합니다. BTRC 직원의 지속적인 지원과 논의 소중한되고 우리는 그의 과학적 입력 Dr.Abhijit Guha을 기념하고 싶습니다. 작품은 CIHR와 NIH 교부금에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
| B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
| ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
| Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
| 2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
| 10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
| CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
| AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
| Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
| Equipment | |||
| Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
| Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
| 22G Needle | BD | 305156 | |
| 27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
| Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| 2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
| 10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
| Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
| Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
| Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
| Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI | |
References
- Kienast, Y. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).
- Holtmaat, A. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation. Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).
- Kherlopian, A. R., et al. A review of imaging techniques for systems biology. BMC Systems Biology. 2, 74 (2008).
- Kedrin, D. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Perentes, J. Y., et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nature Methods. 6, 143-145 (2009).
- Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).
- Marker, D. F., Tremblay, M. -E., Lu, S. -M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).
- Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).
- Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation. PLoS ONE. 7, e38366 (2012).
- Tate, M. C., Aghi, M. K. Biology of angiogenesis and invasion in glioma. NURT. 6, 447-457 (2009).
- Aghi, M., Chiocca, E. A. Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors. Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).
- Nussenbaum, F., Herman, I. M. Tumor angiogenesis: insights and innovations. J. Oncol. 2010, 132641 (2010).
- Zhang, H. -r Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft. J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).
- Du, R., et al. HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).
- Rajantie, I. Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells. Blood. 104, 2084-2086 (2004).
- Shin de Patil, V. R., et al. marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma. Neoplasia. 7, 234-240 (2005).
- Purhonen, S. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).
- Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes. Cancer Research. 66, 9054-9064 (2006).
- Burrell, K., Zadeh, G. Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis. , InTech. (2012).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Tolentino, M. J., et al. Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization. Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).
- Holash, J. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).
- Shinoda, J., et al. Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium. , 1-7 (2003).
