Summary
Wir zeigen hier die
Abstract
Präklinische Forschung in Tiermodellen der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit spielt eine wichtige Rolle bei der Prüfung der Wirksamkeit von Therapeutika entwickelt, um die Mikrozirkulation zu stimulieren. Die Wahl der Versandart für diese Mittel ist wichtig, weil die Art der Verabreichung zutiefst beeinflusst die Bioaktivität und Wirksamkeit dieser Mittel 1,2. In diesem Artikel zeigen wir, wie man vor Ort ein Medikament verabreicht in ischämischen Hinterbeine mit einem katheterisiert osmotische Pumpe. Diese Pumpe kann ein festes Volumen der wässrigen Lösung kontinuierlich liefern für einen vorgegebenen Zeitraum. Wir präsentieren auch unsere Mausmodell der einseitigen hindlimb Ischämie durch Unterbindung der A. femoralis communis proximalen zum Ursprung des profunda femoris und epigastrica Arterien im linken Hinterbein induziert. Schließlich beschreiben wir die in vivo-Kanülen sowie Unterbindung der infrarenalen Bauchaorta und Perfusion des hindlimb Gefäßsystem mit Microfil, ein Silikon radiopaken Casting-Agenten. Microfil können perfundieren und füllen das gesamte Gefäßsystem (arterielle und venöse), und weil wir den größten Gefäßleitung für die Ausreise ligiert haben, kann der Agent in das Gefäßsystem für zukünftige ex-vivo-Bildgebung mit dem Einsatz von kleinen Mikro-CT-Probe 3 beibehalten werden .
Introduction
Periphere arterielle Verschlusskrankheit (pAVK) ist eine Krankheit, die atherosklerotischen unzureichende Blutversorgung in den Beinen 4 verursacht. Es wirkt 8-12.000.000 Amerikaner und aktuellen medizinischen Behandlungen bieten nur begrenzte Linderung 5,6. Neuartige Therapeutika, die Blutzirkulation in den Beinen verbessern würde nicht nur zurückhalten Fortschreiten der Krankheit, sondern auch die Lebensqualität verbessern. Die Inzidenz der PAD ist höher bei Personen im Alter von über 50 Jahren ist so lokale pharmakologische Therapie ein wünschenswerter Behandlungsform, weil die reduzierte Nieren-und Leberfunktion häufig bei älteren Patienten gesehen Arzneimittelstoffwechsel verringern können und erhöhen Nebenwirkungen systemischer Verabreichung.
So haben wir ein Mausmodell der PAD zu prüfen, ob lokal verwaltete Mittel hindlimb Ischämie lindern durch die Förderung der Angiogenese und mikrovaskulären Umbau. Insbesondere haben wir eine katheterisierte osmotische Pumpe kontinuierlich liefern das therapeutische Mittel zurischämischen Oberschenkelmuskel von Mäusen. Mit unserem Delivery-System, waren wir in der Lage, optimale Konzentration des Medikaments in der lokalen Umgebung aufrecht zu erhalten; Dieser Ansatz ermöglicht eine entsprechende medikamentöse Bioaktivität, vermeidet mögliche systemische Nebenwirkungen, und überwindet den Nachteil der begrenzten lokalen Drogen-Zugang mit systemischer Verabreichung verbunden. Zusätzlich zu beurteilen, ob lokal verwaltete Mittel Revaskularisierung zu fördern, haben wir fortschrittliche Gießen und High-Definition-Imaging-Techniken, die die Quantifizierung von Veränderungen in der Mikrozirkulation aktivieren. Zusammengenommen ist die Kombination von Methoden in diesem Artikel verwendeten Video nützlich in präklinischen Studien, um das Verständnis pharmakologisch induzierte Revaskularisation bei pAVK-Patienten 7-9 unterstützen.
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Protocol
1. Priming der osmotischen Pumpe
- Verwenden Sie sterile Techniken (z. B. Handschuhe, Laminarströmungshaube) bei der Herstellung der Pumpen. Entfernen Sie die Pumpe und Durchfluss Moderator aus der Verpackung. Wiegen Sie die Pumpe leer und das Gewicht aufgezeichnet (mg).
- Füllen Sie die Pumpe langsam, um zu vermeiden, Luftblasen, mit einem kleinen 1cc Spritze und stumpfe Spitze 27G Füllrohr. Wenn die Lösung der oben auf der Pumpe erreicht, stoppen Füllung.
- Wischen Sie die überschüssige Lösung und wiegen die Pumpe gefüllt. Für die meisten wässrigen Lösungen ist das Gewicht in mg gleich dem Volumen in ul. Der Unterschied in der leeren gegen gefüllte Gewicht sollte mehr als 90% der angegebenen mittleren Füllvolumen sein. Wenn nicht, räumen die Pumpe mit der Spritze und nachfüllen. Wenn Sie technische Schwierigkeiten haben entnehmen Sie bitte dem Abschnitt zur Fehlerbehebung der Pumpe Anweisungen an http://www.alzet.com/products/guide_to_use/filling.html
- Verwenden Sie eine Pinzette, um den weißen Flansch von der Strömung moderat brechenoder; darauf achten, nicht zu verbiegen oder quetschen Sie das Rohr. Bringen Sie eine P50 Katheter entweder Ende des Moderators, die etwa 3-4 mm. Verwenden Sie eine Spritze, um den Katheter und die angeschlossenen Moderator füllen und lassen Sie die Spritze an dem distalen Teil des Katheters.
- Legen Sie den Fluss Moderator in die Pumpe, bis der Katheter ist bündig mit der Oberfläche Pumpe. Dann entfernen Sie die Spritze aus dem distalen Ende des Katheters. Stellen Sie die Pumpe in einem sterilen 0,9% iger Kochsalzlösung oder PBS Lösung in einem 37 ° C-Inkubator für ein Minimum von 6 Stunden (vorzugsweise O / N) prime die Pumpe vor der Implantation in die Maus. Die Fördermenge der Pumpe variiert mit der Modell-Nummer (dh Modell 1002 = 0,25 ul / h für 14 Tage).
2. Erstellen Einseitige hinteren Gliedmaßen Ischämie in der Maus
- Anesthetize die Mäuse mit Isofluran Satz zwischen 2-4% in 100% O 2 bei einer Flussrate von 0,4 L / min und entfernen die Haare (vorzugsweise am Tag vor der Operation) auf der hinteren Gliedmaßen und Rückenbereich mit einer Wollereparaturflüssigkeitry Sahne.
- Sterilisieren alle chirurgischen Werkzeugen vor der Operation. Platzieren Sie die Maus in der Induktion Anästhesie Kammer. Verwenden Sie die gleichen Narkose Einstellungen im Abschnitt 2.1 beschrieben.
- Warten Sie, bis sich die Maus nicht mehr reagiert auf äußere Reize und dann legen Sie sie in Bauchlage auf dem OP-Tisch mit einer Einbauküche Bugnase, die einen kontinuierlichen Fluss von Isofluran (1,5-2,0%) liefert.
- Injizieren Sie die empfohlene Dosis des Anästhetikums (Bupivacaine; 0,25% (<1 ml / kg)) an der Einstichstelle; behandeln die Haut mit einem Povidonjodlösung um 70% Ethanol. Einen Schnitt 4-6 mm auf der Rückseite (an der Seite der Wirbelsäule, in den Schulterblättern region). Trennen Sie die subkutane Membran mit feinen Pinzette, dann drehen Sie die Maus auf der Rückenlage behandeln die Haut mit einem Povidonjodlösung um 70% Ethanol und machen 0,8-1 cm Schnitt mit mikrochirurgischen Schere über dem Knie in Richtung der medialen Oberschenkel, nach dem Weg der Oberschenkelarterie.
- Tunnel bis dieSeite des Rumpfes mit kleinen Mantel-Schlauch (6-Französisch) aus dem medialen Oberschenkel zum Einschnitt auf der Rückseite.
- Platzieren Sie die Maus in der Bauchlage. Entfernen Sie die grundierte osmotische Pumpe / Katheter aus der PBS-Lösung und führen den Katheter durch die Hülle Schlauch, bis zum Oberschenkel.
- Positionieren Sie die Pumpe in den Rücken und schließen Sie die hintere Schnitt mit 6-0 Prolene Nahtmaterial (behandeln die Haut mit einem Povidonjodlösung um 70% Ethanol). Platzieren Sie die Maus wieder in die Rückenlage, zu entfernen den Mantel Schlauch, so dass der Katheter durch den Schnitt am Oberschenkel ausgesetzt. Sichern Sie das Bein mit Heftpflaster.
- Trennen Sie das subkutane Fettgewebe, um die Gefäße zu offenbaren. Zur besseren Visualisierung des Gefäßsystems, verwenden Sie ein Retraktor, um den Schnitt zu öffnen.
- Pierce die membranöse femoralen Hülle vorsichtig mit feiner Spitze Pinzette, um die Leitbündel zugreifen. Präparieren und trennen Sie die Arteria femoralis aus der Vena femoralis und Nerven in der Nähe der Leiste, kümmert sich nicht um zu bewirken, exübermäßigen Blutungen.
- Platz zwei 8-0 Prolene benachbarten Fäden zu unterbrechen die Arteria femoralis 2-3 mm proximal der Bifurkation femoralis (der Ursprung des profunda femoris und epigastrica Arterien).
- Schneiden Sie den Katheter auf die entsprechende Länge und legen Sie die Spitze auf den anterolateralen Bereich des Oberschenkels, befestigen Sie sie mit einem 6-0 Prolene Naht an der oberflächlichen Faszie gezielte Abgabe des Stoffes zu gewährleisten. Schließen Sie das Bein Schnitt mit einem 6:0-Lauf Naht. Verwalten einer endgültigen subkutane Injektion von Schmerzmittel (Buprenorphin, 0,1 mg / kg), behandeln die Haut mit einem Povidonjodlösung um 70% Ethanol und kehren Sie die Maus auf den Käfig. Verwenden Sie eine Wärmelampe während der Wiederherstellung.
- Nach einem 30-Minuten Erholungsphase, bereiten Sie die Maus für die Laser-Doppler-Bildgebung, um die Erstellung von hindlimb Ischämie bestätigen.
- Überwachen Sie das Tier zweimal täglich für 5 Tage nach der Operation. Mobilität des Tieres wird beobachtet, um Schmerzen zu analysieren, Abfälle in den Käfig wird als indic dienenator des Essens. Auch während dem Monitor Zeitraum festzustellen, ob das Tier Schmerzen oder Beschwerden und geben eine subkutane Injektion von Buprenorphin (0.1mg/kg) zweimal täglich.
3. Imaging Probenvorbereitung
- Anesthetize die Maus, wie in Abschnitt 2.1 angegeben. Übertragen Sie die Maus auf dem OP-Tisch in der Rückenlage. Spritzen 1.000 IE Heparin subkutan zu verhindern Blutgerinnung im Gefäßsystem. Während sich die Maus an den nosecone angebracht ist, einen Einschnitt groß genug, um die Brusthöhle und den unteren Bauch freizulegen. Bewegen Sie die Bauchorgane an der linken Seite des Tieres, um die infrarenalen Bauchaorta (IAA) freizulegen. Sorgfältig trennen die Aorta von der unteren cava Vene.
- Ligieren des proximalen IAA zu Blutungen während der Einführung des Katheters zu reduzieren. Dann machen Sie einen kleinen Schnitt auf der IAA. Legen Sie eine 27 ½ G stumpfen Nadel (an einem P10 Katheter) in die IAA und sichern Sie es mit einem 6-0 Faden.
- Füllen Sie zwei20cc Spritzen mit Heparin Kochsalzlösung und 10% neutral gepuffertem Formalin (NBF). Füllen Sie eine Spritze mit einer 5cc Gegensatz radiopaken Silikonkautschukverbindung. Mischen Sie die drei Bestandteile des MV-Verbindung: MV-Verdünnungsmittel: MV-Härter arbeiten in Verhältnissen von 1:1.25:0.5. Da die Mischung (Microfil) hat nur eine Verarbeitungszeit von 20 min bevor der Agent polymerisiert, wird empfohlen, die MV-Härter bis kurz vor der Injektion fügen in das Gefäßsystem.
- Machen Sie einen Schnitt in den rechten Vorhof und verwalten eine Überdosis Isofluran, Sterbehilfe zu induzieren und für die Entwässerung von überschüssiger Flüssigkeit zu ermöglichen. Befestigen Sie die Kochsalzlösung gefüllte Spritze an der Nadelspitze und beginnen, die Gefäße für 5 min spülen. Achten Sie darauf, alle Blut aus der Gefäße gespült; schalten Sie die Isofluran und trennen Sie das nosecone einmal die Spülung beginnt. Anschließend befestigen Sie die Formalin-Fertigspritze mit dem Katheter zuvor dargelegten (3.2) und Druck perfuse für weitere 5 min. Schließlich perfundiert das letzte Spritze, mit dem KontrastAgenten, langsam in die Maus für 5 min.
- Optional: Fotografieren Sie das Microfil im Gefäßsystem mit einer Kamera, um sicherzustellen, dass nur die arterielle Struktur durchblutet wird.
- Platzieren Sie die Maus in einem Behälter mit 10% NBF und lagern bei 4 ° CO / N für Kontrastmittel gefüllt Polymerisation. Nach 24 Stunden, entfernen Sie die Haut auf die untere Hälfte des Rumpfes (distal der unteren Bauchaorta Ligation) mit Dissektion Werkzeuge, aktualisieren Sie die 10% NBF, und platzieren Sie die Maus zurück in den Behälter für 4 Tage bei RT.
- Sezieren die Gegenseite und ischämische Hinterbeine, und legen Sie die Proben in einer Ameisensäure-Lösung (Cal-Ex II) für 48 Stunden zu Entkalkung des Knochens zu erleichtern. Dann spülen Sie die Proben unter fließendem Wasser für 1 Stunde und Rückkehr zu 10% NBF und fahren Sie mit Faxitron (x-ray Systems verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Knochen entkalkt wird) und Mikro-CT-Bildgebung.
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Representative Results
Die Animation zeigt die osmotische Pumpe Einsetzen und hindlimb Ischämie Chirurgie im Protokoll aufgeführt. Abbildung 1 zeigt Laser-Doppler-Bilder der Perfusion der hinteren Gliedmaßen, bestätigt Ischämie. Nach vaskulären Gießen mit Microfil zeigt eine 3D-Mikro-CT-Bild des vaskulären Netzwerk, Microfil können die Gefäße effektiv zu füllen (Fig. 2A), aber das Diskontinuitäten auftreten (2B) durch verschiedene verfahrenstechnische Faktoren (zB Luftblasen, mangelnde Druck, Viskosität der Microfil).
Zeichentrick-Legende
- Platzieren Sie die Maus in der Bauchlage und einen Einschnitt auf dem Rücken an der Seite der Wirbelsäule.
- Setzen Sie die kleinen Einschnitt zurück.
- Platzieren Sie die Maus in der Rückenlage und machen einen kleinen Schnitt oberhalb des Knies am medialen Oberschenkel.
- Trennen Sie die Haut, setzen Sie das Gefäßsystem, und legen Sie die Mantel-Schlauch an der Seite des Rumpfes mouse an der Rückseite Einschnitt.
- Nehmen Sie die osmotische Pumpe und den Katheter in die Scheide Schlauch.
- Platzieren Sie die Maus in der Rückenlage und führen den Katheter nach unten durch den Schlauch mit dem Einschnitt in den Oberschenkel.
- Platzieren Sie die Maus in der Bauchlage und positionieren Sie die Pumpe auf den Rücken und schließen Sie den Einschnitt.
- Platzieren Sie die Maus in der Rückenlage und nehmen Sie den Mantel Schlauch.
- Ziehen Sie die Haut mit einem Retraktor und mikrochirurgische Werkzeuge verwenden, um die Vene von der Arterie zu trennen. Doppelklicken abzubinden die Arteria femoralis oberhalb der Bifurkation femoralis mit Naht.
- Sichern Sie den Katheter mit dem oberflächlichen Gewebe des Oberschenkels.
- Schließen Sie das Bein Schnitt mit Naht.
Abbildung 1. Bestätigung der hindlimb Ischämie mittels Laser Doppler Perfusion Imager. Der Vertreter Doppler Bilder show die Durchblutung vor und nach chirurgischen Unterbindung der Arteria femoralis in der Maus hindlimb. Ischämie wurde in der linken Hinterbein erstellt (siehe Pfeile).
Abbildung 2. 3D-Micro-CT-Bild hindlimb Gefäßsystem. Vascular Gießen mit Microfil enthüllen ein Netz von Venen und Arterien im ganzen hindlimb (A). Diskontinuität der Microfil kann auch auftreten, (B), wodurch der Visualisierung einer detaillierten Gefäßnetz (siehe Pfeile).
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Discussion
Hier präsentieren wir eine Methode zur osmotischen Medikament / Substanz Lieferung in einem Mausmodell der hinteren Gliedmaßen Ischämie. Darüber hinaus beschreiben wir ein Gießverfahren, bei dem wir Microfil verwendet wurden, um eine 3D-Rekonstruktion für die Analyse des vaskulären Netzwerk herzustellen.
Der Grad oder die Schwere der Ischämie variiert je nachdem, wo die arterielle Ligation / Exzision ist. Wir haben eine doppelte Ligatur in der A. femoralis communis proximal der Ursprung des profunda femoris und epigastrica Arterien; kann dieser Ansatz eine schwere Ischämie im distalen hindlimb produzieren. Achten Sie darauf, die Tiere nach der Operation überwachen und Schmerzlinderung durch lokale Verabreichung von Schmerzmitteln. Zusätzlich kann die Microfil nicht immer vollständig durchströmen Schenkel Gefäßsystem. Daher ist es wichtig, sicherzustellen, dass alle Blut aus der Vaskulatur nach Perfusion des heparinisierten Kochsalzlösung gespült. Gründe für unvollständige Perfusion des Microfil gehören das Fehlen einerngewandte Druck oder falsche Viskosität des Microfil, müssen beide ausreichend sein, um sicherzustellen, dass die Microfil erreicht die meisten distalen Regionen der hinteren Gliedmaßen und damit füllt den gesamten Gefäßsystem. Um diese Probleme anzugehen, um für einheitliche Druck bei 100 mmHg und experimentieren mit der Verbindung: Verdünnungsmittel Verhältnisse für das jeweilige Tier-Anwendung.
Um Arteriogenese (bereits bestehenden Sicherheiten Arterie Wachstum) zu studieren, ist der ideale Ansatz, um die Arteria femoralis unmittelbar distal des Abgangs der tiefen Femoralzweig, um den Blutfluss zu den Kollateralgefäße umleiten abzubinden. Allerdings variiert die Antwort auf diese Verfahren stark zwischen Maus-Stämme, und das Ausmaß der Ischämie kann in einigen Mäusestämmen unzureichend (zB C57BL / 6). Eine weniger schwere ischämische Modell kann nicht eine längere Zeitfenster, um therapeutische Effekte in stark vaskularisierten Mäusestämmen wie C57BL / 6 zu untersuchen. Um diese Probleme zu vermeiden, haben wir hindlimb Ischämie by Abbinden der proximalen Arteria femoralis, die eine schwere Ischämie besser demonstrieren die lokalen Wirkstofffreisetzung Effekte erzeugt, jedoch schließt dieser Ansatz Analyse Arteriogenese in den proximalen tiefe Ast Kollateralgefäße. Somit werden die therapeutischen Effekte insbesondere aus der distalen ischämischen Region, die in Übereinstimmung mit der anatomischen Lage (anterolateral Oberschenkel), wo das Medikament / Stoff freigesetzt wird gezeichnet. Während der Operation ist es entscheidend, nicht auf die zerbrechliche femoralis verletzen, weil lokale Blutungen zu Entzündungen und Ödeme, die sowohl Arteriogenese und Angiogenese beeinflussen führen kann. Wir empfehlen die Verwendung von 8-0 Prolene Fäden, um die Arteria femoralis mit einem geeigneten Knotengleiteigenschaften abzubinden, Ausdehnung, Dehnung oder Ruptur der Arterie zu vermeiden. Darüber hinaus muss Microfil sofort (innerhalb von 20 min) nach dem Mischen der Bestandteile 3 (Verbindung, Verdünnungsmittel und Härter), weil es schnell polymerisiert, die erzeugt technische Schwierigkeiten zur Injektion. Wie zuvor stated, ist nicht immer erfolgreich Microfil versorgen die kleineren Gefäße, aber die Praxis und Verwendung der richtigen Techniken können helfen, diese Einschränkung zu überwinden.
Die Pumpe Füllvolumen müssen mehr als 90% des mittleren Füllvolumen sein, wenn nicht, zusätzliche Luft in der Pumpe verfangen. Weitere technische Informationen befindet sich unter www.alzet.com . Darüber hinaus ist die Microfil Agent muss bei der bevorzugten Viskosität für eine bestimmte Anwendung zu sein, so dass das Verhältnis von Verdünnungsmittel zu Verbindung kann geändert werden müssen.
Die hinteren Gliedmaßen Ischämie-Modell ist in hohem Maße reproduzierbar und ist anwendbar auf PAD 10,11. Die stabile Lieferung von Therapeutika in diesem Modell ist notwendig, um aussagekräftige Resultate zu erhalten 2. Zusammenfassend ist die 3D-Bildgebung Technik, die wir verwendet, um die morphologischen Strukturen visualisieren ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung der Maus Gefäßsystem und bietet ein leistungsfähiges System für studying Gefäßerkrankungen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, keinen Interessenkonflikt. Alle tierischen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Keith Michel des MD Anderson Small Animal Imaging Facility für seine technische Unterstützung bei der Mikro-CT-Bildgebung, Edward TH Yeh, MD, für chirurgische Hilfe, und Rebecca Bartow, PhD danken, für die redaktionelle Unterstützung. Diese Arbeit wurde zum Teil von der American Heart Association unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Surgical tools | Fine Science Tools | Type: Tool | |
| Puritan sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 22-029-499 | Type: Tool |
| Betadine (povidone-iodine) | Fisher Scientific | 19-065534 | Type: Reagent |
| 70% Alcohol pads | Fisher Scientific | NC9926371 | Type: Reagent |
| Phosphate buffered saline | Lonza | 17-516F | Type: Reagent |
| 6-0 prolene suture | Cardinal Health | 8709 | Type: Tool |
| 8-0 prolene suture | Cardinal Health | 2775 | Type: Tool |
| Depilatory cream | Nair | Type: Tool | |
| Osmotic pump |  ALZET |
1002 | Type: Tool, 14 day release |
| Vinyl catheter | ALZET |
7760 | Type: Tool |
| Heparinized saline (0.9%) | Baxter | 2B0944 | Type: Reagent |
| Neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5705 | Type: Reagent |
| Microfil (silicone rubber contrast agent) | Flowtech | MV-112 | Type Reagent, Microfil White |
| Cal-Ex II (formic acid solution) | Fisher Scientific | CS511-1D | Type: Reagent |
| Buprenex | CIII | 7571 | Type: Analgesic |
| Bupivicaine | Hospira, Inc. | 381 | Type: Analgesic |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss Microimaging | Zeiss Stemi 2000-C | Type:Equipment |
| Laser Doppler perfusion imager | Perimed Inc. | Periscan PIM3 | Type:Equipment |
| Micro-CT imaging system | GE Healthcare | Explore Locus SP | Type:Equipment |
References
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