Summary
Достижение понимания систем уровня клеточных процессов является целью современной клеточной биологии. Мы описываем здесь стратегий для мультиплексирования люциферазе журналистам различных клеточных функций конечными точками, чтобы допросить использованием функции гена генома РНК-интерференции масштабе библиотек.
Abstract
Геном масштаба допроса функции гена использованием РНК-интерференции (РНК-интерференции) обещают стать для быстрой идентификации химически послушный уязвимостей раковой клетки. Ограничение потенциал этой технологии является невозможность быстро очертить механистической основе фенотипических результаты и таким образом учтены при разработке молекулярно целевых терапевтических стратегий. Мы выделяем здесь методы деконструировать сотовой фенотипа индуцированных РНК-интерференции-опосредованного генного таргетинга использованием мультиплексированных репортер системы, которые позволяют мониторинг основных раковых клеток-связанные с ним процессы. Это высокое содержание методологии скрининга является универсальным и может быть легко адаптирована для скрининга других типов больших молекулярных библиотек.
Introduction
Разнообразие люциферазы на основе репортеров для мониторинга разнообразных клеточных биологических процессов являются коммерчески доступными. Большинство из этих конструкций ДНК, кодирующих люциферазы белки, которые индуцируют экспрессию на специфические стимулы клетки или возмущений. Самые надежные транскрипционно основе репортеров поместить выражение фермента люциферазы под контролем синтетического элементов или энхансер промотора гена областей хорошо установленных для их надежности в сообщении об физиологически значимых транскрипционный 1,2 события. Есть также транс-репортер люциферазы системы, которые используют GAL4-UAS ездить экспрессию люциферазы белка. Gal4 является дрожжевая активатора транскрипции и UAS представляет собой усилитель с Gal4 который специфически связывается с активируют транскрипцию последовательности гена размещенный ниже по течению от него 3. Эти типы люциферазы системы, как правило, поддерживают две плазмиды ДНК - один кодирует белок GAL4, слитый с регулирующимры часть белка, представляющего интерес, а второй кодирует протеин люциферазы под контролем одного или нескольких UAS последовательностей. Таким образом, сотовый люциферазы сигнала отражает уровень активности белка. Другой способ использования люциферазы на основе репортеров для контроля стабильности белка посредством чего интерес белок, слитый с фермента люциферазы 4. Независимо от типа репортером, пусть покупатель будет бдителен отмечается здесь как никто не может предположить специфику любого репортера, чтобы были хорошо допросили. Таким образом, должной осмотрительности требуется внедрение новых конструкций репортер в любой стратегии исследования.
Выбор фермента люциферазы считывания может быть столь же важным, как надежность элементы ДНК, которые контролируют его выражения. В то время как люциферазы светлячка (Флорида) является наиболее широко используемый фермент в коммерчески доступных конструкций, появление новых систем репортер люциферазы, которые не требуют АТФ (как в случаеФЗ на основе реакции) или которые включают более стабильной ферменты, которые излучают сильные сигналы обещают улучшить эффективность и надежность этой исследовательской платформы. Важное замечание по выбору люциферазе журналистам в химических исследований является восприимчивость к химическим FL торможения, что может привести к ложных сообщений. По нашему опыту, другие ферменты, такие как Renilla или Gaussia люциферазы (RL и GL, соответственно), которые используют коэлентеразин качестве субстрата менее легко подавляется малых молекул 5.
Наиболее общий формат для мультиплексирования люциферазы чтения выходы влечет за собой использование ПЛС и ОЛС в значительной степени учитывая наличие простого в использовании наборов с возможностью последовательного измерения ферментативной активности из одного образца. В большинстве наборов, образцы первого воздействию люциферин выявить уровни FL активность последующей закалкой реагент, который одновременно хранение целентеразин с образованием вторичныхДары RL сигнала. С добавлением других люциферазы, которые могут быть секретируемых таких как GL или что использование еще одной подложке, такой как Cypridina люциферазы (CL), большее количество возможностей для генерации данных с высоким содержанием использованием люциферазы появились. Примером генома РНК-интерференции экране с помощью этой техники можно найти здесь 6. Этот технологический прогресс, в свою очередь стимулировало развитие конкретных механизмов, чтобы утолить каждого типа фермента люциферазы, чтобы ограничить перекрестное 7. В наших руках, мы отмечаем большую частоту "краевых эффектов" (необъяснимое тенденции в клеточной активности, связанный с краю пластины высокой культуры титр) с выделяемый люцифераз таких как GL или CL. С другой стороны, такие секретируемые люциферазы полезны для кинетического анализа, поскольку они позволяют выборки сигнала без фальсификации жизнеспособности клеток.
Для нашего исследования, представленные здесь, мы будем одновременно контролировать активность трех рак соответствующихклеточные процессы: p53, Крас и Wnt пути передачи сигнала. Журналистам включены в нашем исследовании РР53-TA-Люк FL репортер из Clontech (далее называемый p53-ФЗ репортер) 8, Elk1-GAL4/UAS-CL системы репортер (далее Elk-1 репортера; Agilent), и 8-кратным ФТС RL репортеру, что включает в себя несколько синтетических элементов усилителя признан Wnt пути транскрипционных регуляторов известный как Т-клеточного фактора (или TCFs) 9-11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Весь протокол занимает около 4 дней.
1. Подготовка клеток для трансфекции миРНК и Репортер
Мы представим здесь протокол допроса миРНК библиотеки, используя небольшой набор киРНК (384 бассейнов различных миРНК массиве в 96 формате с каждым бассейном, состоящий из 4х киРНК На одного гена) из генома миРНК библиотекой в иллюстративных целях. Для данного конкретного исследования, мы будем использовать НСТ116, которые демонстрируют девиантное Wnt и Крас сигнализацией, а активность р53. Соответствующую клеточную линию в исследований, направленных на допроса других клеточных процессов интерес должны быть определены и оценены в аналогичным образом.
- Мытье 5 х 10 см 2 пластины 80-90% сплошности НСТ116 с PBS, затем клетки урожай обработкой трипсином с использованием 1 мл раствора трипсином / пластина с последующей нейтрализацией 10 мл модифицированной Дульбекко по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), содержащей 2% Feтал бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина / пластине.
- Передача суспендированные клетки в 50 мл коническую пробирку и центрифугировать при ~ 130 мкг в течение 5 мин, удалить супернатант, и повторно приостанавливать осадок клеток в 10 мл среды DMEM / 2% FBS / 1% пенициллина / стрептомицина.
- Подсчитайте количество клеток с сотовым счетчика, а затем сделать ячейки решение с 10 5 клеток / мл, 150 мл держать клеточной суспензии для следующего шага. Пластина 10 4 клеток (100 мкл) в каждую лунку в 96-луночный планшет для культивирования клеток с использованием многоточечного автоматизированный дозатор жидкости (в дальнейшем многоточечного). Суспензию клеток должно быть достаточным в этом случае для покрытия 12 х 96-луночных планшетах.
- Инкубируйте пластины с клетками при 37 ° С в инкубаторе с 5% CO 2 при подготовке трансфекции смеси.
2. Подготовка со Репортер Construct решения
- Изолировать высококачественных репортер построить ДНК с использованием стандартных наборов midiprep (NucleoBond Xtra Midi производстваClontech) и разбавленной ДНК до конечной концентрации 1 мг / мл для каждого репортера.
- Подготовьте 100 мкл репортерной конструкции маточного раствора путем объединения 30 мкл 53-FL, 30 мкл 8-кратным TCF-RL 30 мкл Elk1-Gal4, 6 мкл UAS-CL и 4 мкл H 2 O для достижения ДНК смешивают с Окончательный 1:1:1:0.2 отношение журналистов. Конечная концентрация ДНК этого исходного раствора смеси ДНК составляет 0,3 мг / мл.
3. Подготовка миРНК / ДНК смесь для трансфекции
В этой части протокола, мы будем готовить миРНК / трансфекции ДНК смесей, которые будут достаточными для трансфекции 12 х 96-луночных планшетах. Для этого теста библиотеке 4 х 96-луночный планшет из киРНК, мы трансфекции миРНК каждого бассейна в трех экземплярах. Реагента для трансфекции мы будем использовать, называется Effectene (Qiagen). В наших руках это единственный реагент, который работает для одновременной доставки миРНК и ДНК в культивируемых клетках.
- Развести 80 мкл репортера конструкция со Solution в 8 мл буфера EC (Effectene Kit) для получения раствора ДНК с конечной концентрации 3 мкг / мл. В общем, достаточно подготовить смесь ДНК решение к немедленному использованию.
- Пластина 20 мкл этого раствора ДНК в каждую лунку 96-луночного / пластине. Количество 96-луночных планшетах будет зависеть от того, сколько миРНК бассейны будут проверены. Например, в этом случае нам нужно будет 4 х 96-луночные планшеты для оценки 384 различных бассейнов миРНК.
- SiРНК, для тестирования должно быть исходной концентрации 5 мкМ. Если нет, то они могут быть реплика была помещена и разводили в концентрации, с использованием рекомендованных буфером для разведения, связанные с каждой библиотеки.
- Передача 2 мкл каждого 5 мкМ миРНК акции в соответствующую лунку планшета ПЦР, содержащий разбавленный запас ДНК с Biomek Автоматизированный обработчик жидкости. В зависимости от масштаба исследования, многоканальные пипетки может быть достаточно.
- Теперь, мы добавим 1 мкл Enhancer решение (Effectene Kit) в каждую лунку ДНК / миРНК плаТе. Это снова может быть выполнена с помощью автоматизированной обработчик жидкость или многоканальные пипетки.
- Оставляют реакционную Enhancer происходить при комнатной температуре в течение 5 мин, затем добавляют 3 мкл реактива Effectene трансфекции в каждую лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение дополнительных 10 мин.
- Чтобы остановить трансфекции образование комплекса, добавляют 10 мкл DMEM / 2% FBS / 1% пенициллина / стрептомицина в каждую лунку пластины ПЦР.
- Передача 10 мкл трансфекции смеси в каждую лунку 96-луночного планшета, содержащего клеток (полученных из клетки инкубатор). В каждой трансфекции будет выполнена в трех экземплярах, та же смесь будет применен к двум дополнительным 96-луночные планшеты, содержащие клетки.
- Инкубируйте клетки с трансфекцией смеси добавляли при 37 ° С во влажной среде с 5% CO 2 в течение 36 час.
4. Определите Люциферазы деятельности от образцов клеток
После 36 часов, люциферазы деятельности готовы к измерениюв трансфицированных клетках. Конечная точка должна быть определена для каждого эксперимента основе. В нашем исследовании 36 ч инкубации время ранее дали достаточно устойчивым сигналом для определения означает результат. В данном исследовании включает в себя несколько репортеров (один секретируемых в культуральную среду, а два других выражены в цитоплазме клеток), получим измерений с обеих культуральной среде, а также клеточный лизат.
- Обнаружение CL активности в культуральной среде:
- 20 мкл культуральной среды является репликой покрытием в белой непрозрачной 96-луночный планшет (либо с помощью обработчика Biomek Жидкость или многоканальной пипетки).
- Добавить 20 мкл буфера для анализа CL (Targeting Systems) в каждую лунку.
- Добавить 10 мкл Cypridina люциферином подложке (целеуказания) в каждую лунку и выявления CL деятельности с помощью фотометра (читатель Pherastar пластины производства BMG например).
- Обнаружение FL и RL деятельности:
- Лизируйте Cлоктя на первом удаления культуральной среды. Это можно сделать быстро, повернув вверх дном, и бросающий среды в раковину. Оставшуюся среду могут быть удалены аккуратным постукиванием перевернутого планшета на бумажные полотенца. Добавить 30 мкл 1X Пассивный буфера для лизиса (Promega) в каждую лунку клеток с использованием многоточечного и место на платформе рокер (Bellco одна компания, которая делает эти) установила средней скорости в течение 5 минут при комнатной температуре.
- Добавить 20 мкл реагента люцифераза Assay II (часть Promega двойной Комплект люциферазы) с использованием многоточечного и сразу измерять FL активности с использованием фотометра. Затем добавьте Стоп & Glo реагент (Promega), которые утолят FL деятельности и позволяют измерять активность RL. Примечание: если вы не используете подложки смесей, которые позволяют продолжительных сигнала (например, Dual-Glo Люциферазы комплекты от Promega), использование вспышки комплекты требует быстрого измерения на подложку того (в течение 5 мин).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Несмотря на успехи в отображении мутационные пейзаж различных видов рака используя огромное секвенирование генома усилий 12-14, мы все еще не иметь в наличии системного подхода к переводу этих наблюдений в стратегии вмешательства. В колоректальный рак (CRC), мутации, которые, по прогнозам, влияют три компоненты клеточных процессов - Wnt / β-катенина, p53 и Крас сигнализация - встречаются в 99% всех опухолей предполагая, что они являются ключевыми факторами трансформации клеток в кишечнике 13. Таким образом, наборы данных генома рака, вероятно, обогащенные для генов, которые поддерживают общий знаменатель рака содействие процессам, и которые могут быть использованы для быстрой идентификации уязвимостей раковой клетки. Чтобы проверить эту гипотезу, мы разработали стратегию поддаются высокой пропускной допроса функции гена по отношению к Wnt / β-катенина, p53 и Крас сигнализации. Мы сначала продемонстрировать специфику каждого репортера системы в отдельных REPORTEр испытаний (рис. 1), а затем предоставить доказательства того, что эти репортеры могут быть использованы вместе для одновременного измерения активности генов этих трех важных клеточных процессов (рис. 2).
Рисунок 1. Высокопроизводительный люциферазы основе анализов для мониторинга Wnt / β-катенина, p53 и Крас / Erk пути статус в клетках млекопитающих. Устойчивость три различных платформ скрининге были индивидуально оценивали до мультиплексирование с использованием контрольных миРНК ориентации хорошо установленных компонентов пути. Указанные клеточные линии колоректального рака трансфецировали 8X ФТС, РР53-TA-Люк или Elk-1 люциферазы светляков-кодирование репортер строит вместе с бассейнами киРНК ориентации β-катенина, p53, или Крас, соответственно. Pathwaу-соответствующих генотипов для каждой клеточной линии обозначены. Сила каждой платформы скрининга оценивали по воспроизводимости этих миРНК-индуцированные эффекты на соответствующих пути передачи сигнала. Β-катенина киРНК не имеют никакого влияния на 8X деятельности репортера ФТС в клетках РКО в отличие от DLD-1 и НСТ-116 клеток, которые являются соответственно дефицитным по пути APC супрессоров белка и выразить активированная форма β-катенина. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Мультиплексирование на основе люциферазы репортеров высокого содержания клеточный анализ функции генов. А. Схематическое изображение стратегии для одновременного мониторинга Wnt / β-кошка ЭНИН, p53, а также мероприятия Крас пути. FL = люциферазы светляков, RL = Renilla люциферазы, CL = Cypridina люциферазы (секретируемый фермент). FL и RL деятельности в лизат определяются с использованием люциферином и коэлентеразин субстратов. CL активности в культуральной среды измеряется с помощью оксилюциферин. * Другие системы репортер может быть включен в этот протокол для увеличения содержания каждого эксперимента. Например, анализ CytoTox мука может быть использована для контроля клеточной токсичности путем отбора проб уровней внутриклеточных протеаз высвобождается в культуральную среду. Добавление реагента CytoTox анализа не влияет на деятельность CL репортера. B. Определение пути конкретных уязвимостей использованием РНК-интерференции. Способность мультиплексированными люциферазы системы, описанной в "А" для количественного гена преданность клеточной функции была протестирована с помощью указанных бассейнов миРНК.НК "> Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Есть несколько поставщиков люциферазы системы на основе репортера (например, Promega, целеуказания, New England Biolabs и Thermo Fisher), которые обеспечивают полезные он-лайн ресурсы для тех, развлекательные высокой пропускной экране в первый раз. Кроме того, множество отличных отзывов относительно оптимизации использования высокой пропускной экраны для обнаружения генов и как РНК-интерференции на основе результатов обследования может быть интегрирована с другими-омик основе наборов данных должны быть полезны 15,16. Методы отбора "хитов" от высокой пропускной экранов являются предметом отдельного разговора, что выходит за рамки настоящего доклада. Несколько отзывов на эту тему доступны 17,18. Тем не менее, важным критерием для проверки выбранных хитов с экранов основано на использовании транскрипционно активирован журналистам это возможность для тех же perturbagen (РНК-интерференции или химически основе), чтобы вызвать такое же влияние на гены-мишени подтверждены при измерении с использованием RT-PCR, кПЦРИли анализа микрочипов. Кроме того, имейте в виду, что величина ответа как измерено репортер, как правило, выше, чем индукция эндогенных репортер, учитывая, что особенностью успешно синтетических репортер является обеспечение четкого сигнала. Наконец, преимуществом этого ко-трансфекции стратегии является легкость, с которой можно быстро собирать различные коктейли репортер для мониторинга желаемый набор клеточных активностей. Хотя более трудоемким, использование клеточных линий, несущих стабильно репортеров, скорее всего, увеличить отношение сигнал-шум учитывая изменчивость ответ в настоящее время в основном ограничивается миРНК эффективность трансфекции в покое.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ОК и LL являются авторами на запатентованную касающиеся мультиплексированными люциферазе технологии.
Acknowledgments
Мы признаем финансовой поддержке CPRIT (RP100119) и Фонд Уэлч (I-1665).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 | |
References
- Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays. Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).
- Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).
- Smirnova, N. A., et al. Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators. Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).
- Tang, W., et al. A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).
- Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems. United States patent. Lum, L. D., Kulak, O. , (2012).
- Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes. Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).
- DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway. Science. 308, 826-833 (2005).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Korinek, V., et al. Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse. Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).
- Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487, 330-337 (2012).
- Koboldt, D. C., et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. , (2012).
- Wood, L. D., et al. The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens. Science Signaling. 2, pt4 (2009).
- Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide. Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).
- Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. Analysis of cell-based RNAi screens. Genome Biology. 7, R66 (2006).
- Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS ONE. 6, e28338 (2011).
