Summary
細胞プロセスのシステム·レベルの理解を達成することは、現代の細胞生物学の目標です。我々はここでゲノム規模のRNAiライブラリーを用いた遺伝子の機能を調べるために、様々な細胞機能のエンドポイントのルシフェラーゼレポーターを多重化するための戦略について説明します。
Abstract
RNA干渉（RNAi）を使用して、遺伝子機能のゲノムスケールの尋問は、化学的に扱いやすい癌細胞の脆弱性の迅速な同定のための途方もない可能性を秘めています。この技術の可能性を制限することで、迅速に結果の表現型の基本メカニズムを描くため、分子標的治療戦略の開発を知らせることができないことである。私たちは、ここで重要な癌細胞関連のプロセスを監視できるように多重化されたレポーターシステムを用いた標的RNAiによる遺伝子によって誘導される細胞の表現型を解体するためのメソッドの概要を示します。このハイコンテントスクリーニング方法は汎用性があり、容易に大規模な分子ライブラリの他のタイプのスクリーニングに適合させることができる。
Introduction
細胞生物学的プロセスの多様な配列を監視するためのルシフェラーゼに基づくレポーターの様々な市販されている。これらのDNAの大部分は、特定の細胞の刺激や摂動によって発現するように誘導されているルシフェラーゼタンパク質をコードする構築。最も堅牢な転写基づい記者は生理学的に関連する転写イベント1,2の報告では、その信頼性のために十分に確立された合成エンハンサーエレメントまたは遺伝子プロモーター領域の制御下にルシフェラーゼ酵素の発現を配置。ルシフェラーゼタンパク質の発現を駆動するためGAL4-UASを利用するトランス - ルシフェラーゼレポーターシステムも存在する。 GAL4は、酵母転写活性化因子であり、UASは、Gal4のは、特にそれ3の下流に配置された遺伝子配列の転写を活性化するために結合するエンハンサーである。ルシフェラーゼこれらのタイプのシステムは、典型的には、2つのDNAプラスミドに支持されている - オンはregulatoに融合GAL4タンパク質をコードするリュー目的のタンパク質の部分と、第二は、1つまたは複数のUAS配列の制御下に置かれたルシフェラーゼタンパク質をコードする。したがって、セルラルシフェラーゼシグナルは目的のタンパク質の活性レベルを反映する。ルシフェラーゼベースのレポーターの別の一般的な用途は、目的のタンパク質がルシフェラーゼ酵素4に融合させたタンパク質の安定性を監視するためのものです。一つはよく尋問されたため、任意のレポーターの特異性を仮定することはできませんように関係なく、レポーターのタイプの、買い主の危険負担は、ここで注目される。したがって、デューデリジェンスは、任意の研究戦略における新たなレポーター構築の組み込みが必要になります。
ルシフェラーゼ酵素読み出しの選択は、その発現を制御するDNAエレメントの信頼性と同じくらい重要になることがあります。ホタルルシフェラーゼ（FL）は、市販の構成要素の中で最も一般的に使用される酵素であるのに対し、（場合のようにATPを必要としない新しいルシフェラーゼレポーターシステムの出現FLベースの反応）またはより強いシグナルを発する組み込むより安定した酵素は、この研究プラットフォームの効率と信頼性を向上させることを約束します。その化学研究でルシフェラーゼレポーターの選択に関する重要な注意事項は、虚偽の報告を生じさせる可能性があり、化学阻害にFLの感受性である。我々の経験では、そのようなウミや基質としてセレンテラジンを利用ガウルシフェラーゼ（それぞれRLとGL、）のような他の酵素が少なく容易に小分子5によって阻害される。
多重化ルシフェラーゼリードアウトのための最も一般的な形式は、主に単一のサンプルから順次に酵素活性を測定する機能を簡単に使用できるキットの利用可能性を与えFLとRLの使用を伴う。ほとんどのキットにおいて、サンプルは、最初に同時にseconを得セレンテラジンを用いて堆積される消光用試薬が続くFL活性のレベルを明らかにするルシフェリンにさらされているDARY RL信号。例えばウミホタルルシフェラーゼ（CL）のようなさらに別の基板GL、またはその用途として分泌され得る他のルシフェラーゼを添加して、ルシフェラーゼを用いた高コンテンツデータを生成する可能性がより多くの数が浮上している。この技術を用いたゲノムワイドRNAiスクリーニングが6ここで見つけることができた例。これらの技術的進歩は、順番に、クロストーク7を制限するために、ルシフェラーゼ酵素の各タイプをクエンチするために特定のメカニズムの開発に拍車をかけた。私たちの手で、私たちはそのようなGLやCLなどの分泌ルシフェラーゼと、 "エッジ効果"（高力価の培養プレートのエッジに関連する細胞活動の不可解な傾向）の大きい周波数に注意してください。それらは、細胞生存率をadulteratingずに信号サンプリングを可能にするように、その一方で分泌ルシフェラーゼ、運動アッセイに有用である。
ここで紹介する私たちの研究では、我々は同時に3癌関連のアクティビティを監視します細胞プロセス：p53を、Krasの、及びWntシグナル伝達経路。 、、我々の研究に組み込まれた記者はクロンテックからPP53-TA-リュックFLレポーター（以下のp53-FL記者と呼ぶ）8、Elk1-GAL4/UAS-CLレポーター系（アジレント以後エルク-1レポーター）であるおよびT細胞因子（またはのTCF）9-11として知られるWnt経路転写調節因子によって認識され、複数の合成エンハンサー要素を取り入れ8X TCF RLレポーター。
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Protocol
プロトコル全体は約4日かかります。
1。のsiRNAとレポータートランスフェクションのための細胞の調製
我々はここで例示の目的のためにゲノムワイドなsiRNAライブラリからsiRNAの小さなセット（単一遺伝子を標的とする4倍のsiRNAから成る各プールで、96ウェルフォーマットで384の異なるsiRNAのプール·アレイ）を使用したsiRNAライブラリーを尋問するためのプロトコルを紹介します。この特定の研究のために、我々はHCT116逸脱WntシグナルとKrasのシグナルを示す細胞、p53活性を活用します。関心のある他の細胞プロセスに問い合わせを目的とした研究において、適切な細胞株は同定され、同様の方法で評価されなければならない。
- トリプシン処理ソリューション/プレートを1mlを用いてトリプシン処理によって収穫細胞は、2％のFEを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）10mlで中和した後、PBSで80〜90％コンフルエントHCT116細胞を5×10 cm 2とプレートを洗うタルウシ血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシン/プレート。
- DMEM / 2％FBS / 1％ペニシリン/ストレプトマイシンを10ml、50 mlコニカルチューブに細胞懸濁液を移し、5分間〜130×gで遠心分離し、上清を除去し、再懸濁細胞ペレット。
- セルカウンターで細胞数をカウントした後、10 5細胞/ mlの細胞溶液を行い、次のステップを150ミリリットルの細胞懸濁液を維持する。マルチドロップ自動液体ディスペンサー（以下、マルチドロップ）を用いて96ウェル細胞培養プレートの各ウェルのプレート10 4細胞（100μl）を。細胞懸濁液は、めっき12×96ウェルプレートで、この場合には十分であるべきである。
- トランスフェクション混合物を準備しながら、5％CO 2で37℃で細胞とプレート°インキュベーターでCをインキュベートする。
2。レポーターコンストラクトストック溶液を調製
- 分離し、高品質な記者は、標準的なミディプレップキット（NucleoBondエクストラミディが生産で使用してDNAを構築とクロンテック）は各レポーターのために1 mg / mlの最終濃度にDNAを希釈。
- 記者のp53-FL30μlの、8X TCF-RL、Elk1-Gal4の30μlの、6μlのUAS-CLとでDNAミックスを達成するためのH 2 O 4μlの30μlのを組み合わせることにより、原液を構築100μlのを準備記者の最終1:1:1:0.2比率。このDNAミックス原液の最終DNA濃度は、0.3 mg / mlのです。
3。 siRNAを/ DNAトランスフェミックスの準備
プロトコルのこの部分では、12×96ウェルプレートをトランスフェクトするために十分であるsiRNAを/ DNAトランスフェクションミックスを準備します。 siRNAの4×96ウェルプレートのこのテストライブラリのために、我々は三重にそれぞれのsiRNAプールをトランスフェクトされます。我々が使用するトランスフェクション試薬は、のEffectene（キアゲン）と呼ばれています。我々の手では、これは培養細胞へのsiRNAやDNAの同時配信のために働くだけ試薬である。
- リポーターコンストラクト株式ゾルの80μlの希釈3μgの/ mlの最終濃度でDNA溶液を達成するために、EC緩衝液（キットのEffectene）8mlのでution。一般的には、すぐに使用するために十分なDNA溶液ミックスを調製する。
- 96 /ウェルプレートの各ウェルに、このDNA溶液を20μlのプレート。 96ウェルプレートの数は、siRNAプールがテストされますどのように多くに依存します。たとえば、この場合には、我々は384の異なるsiRNAのプールを評価するために4×96ウェルプレートが必要になります。
- テストするsiRNAは、5μMのストック濃度になっているはず。ていない場合は、レプリカプレートし、各ライブラリに関連付けられた推奨される希釈液を使用して、この濃度に希釈することができる。
- BIOMEK自動液体ハンドラーで希釈したDNAストックを含むPCRプレートの対応するウェルに各5μMのsiRNAストック2μlのを転送します。調査の規模に応じて、マルチチャネルピペットで十分である。
- 今、私たちは、DNA / siRNAのPLAの各ウェルにエンハンサー溶液（のEffecteneキット）を1μlを追加しますTE。これは、再び自動液体ハンドラまたはマルチチャンネルピペッターのいずれかを達成することができます。
- その後、各ウェルにのEffecteneトランスフェクション試薬の3μLを加え、さらに10分間室温でインキュベートエンハンサー反応は5分間室温で発生することができます。
- トランスフェクション複合体形成を停止するには、PCRプレートの各ウェルに10μlのDMEM / 2％FBS / 1％ペニシリン/ストレプトマイシンを追加します。
- 細胞（細胞インキュベーターから取得）を含む96ウェルプレートの各ウェルにトランスフェクション混合物10μlを移す。各トランスフェクションは、トリプリケートで実施されるように、同一の組合せは、細胞を含む2つの付加的な96ウェルプレートに適用される。
- 36時間、5％CO 2を含む加湿環境下で37℃で添加し、トランスフェクション混合物で細胞をインキュベートする。
4。細胞サンプルからのルシフェラーゼ活性を決定
36時間後、ルシフェラーゼ活性は、測定のための準備が整いましたトランスフェクションされた細胞である。エンドポイントごとの実験に基づいて決定されるべきである。我々の研究では、36時間のインキュベーション時間は、以前に結果決定を意味するために十分に堅牢な信号が得られていた。本研究では、複数の記者（培養培地中に分泌一つであり、細胞質で発現している2つの他の人）が内蔵されたように、我々は、培養培地と同様、細胞溶解物の両方からの測定値を取得します。
- 培養培地中のCL活性の検出：
- 培地20μlのは、白色不透明な96ウェルプレート（どちらBIOMEK液体ハンドラまたはマルチチャンネルピペッターを使用して）でレプリカメッキです。
- 各ウェルにCLアッセイ緩衝液20μlを（システムのターゲット）を追加します。
- 各ウェルにウミホタルルシフェリン基質（システムをターゲット）を10μlを加え、ルミノメーター（例えばBMGによって生成Pherastarプレートリーダー）を使用して、CL活性を検出。
- FLとRL活性の検出：
- Cを溶解し第培地を除去することによってエルボ。これは、逆さまにプレートを回して、シンクに培地を投げることによって、急速に行うことができます。残りの培地を穏やかにペーパータオル上にプレート逆さまをタップして削除することができます。プラットフォームロッカーにマルチドロップと場所を用いて細胞の各ウェルに1Xパッシブ溶解バッファー（Promega社）を30μl加え、室温で5分間程度の速度を設定します（ベルコは、これらが行う一つの会社です。）
- ルミノメーターを用いたマルチドロップし、直ちに測定FLアクティビティを使用してルシフェラーゼアッセイ試薬II（プロメガデュアルルシフェラーゼキットの一部）の20μlのを追加します。次に、ストップ＆FL活動をクエンチとRL活性の測定が可能になりますグロ試薬（Promega）を追加します。注：拡張信号の長さを（例えばプロメガからデュアルグロルシフェラーゼキットなど）を許可基板ミックスを使用している場合を除き、フラッシュキットの使用は、基質添加時の迅速な測定（5分以内）が必要です。
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Representative Results
大規模なゲノム配列の取り組み12-14を使用して、様々な癌の変異風景をマッピングにおける進歩にもかかわらず、我々はまだ場所に介入戦略にこれらの観察を翻訳するための体系的なアプローチを持っていません。結腸直腸癌（CRC）は、3つの細胞プロセスのコンポーネントに影響することが予測されている変異 - / Wntシグナルβ-カテニン、p53の、そしてKrasのシグナリングは - 彼らは腸内細胞の形質転換の主な要因である示唆すべての腫瘍の99％で発見されてい13。したがって、がんゲノムデータセットはおそらくプロセスを促進する共通分母癌を支える遺伝子が濃縮されており、そのは、癌細胞の脆弱性の迅速な同定のために悪用される可能性があります。この仮説を調べるために、我々は、/ Wntシグナルβ-カテニン、p53の、そしてKrasのシグナリングに対する遺伝子機能のハイスループット尋問に従順な戦略を考案した。我々は最初のシングルreporte内の各レポーター系の特異性を実証rの試験（ 図1）、その後、これらの記者は、これらの3つの重要な細胞プロセス（ 図2）の遺伝子活性の同時測定のために一緒に使用することができるという証拠を提供する。
図1。哺乳動物細胞における/ Wntシグナルβ-カテニン、p53およびKrasの/ ERK経路の状態を監視するためのハイスループットルシフェラーゼに基づくアッセイ。つの異なるスクリーニングプラットフォームの堅牢性を個別に十分に確立された経路成分を対象としたコントロールsiRNAを用いて多重化する前に評価した。大腸癌細胞株は8X TCF、PP53-TA-リュック、またはエルク-1ホタルルシフェラーゼをコードする記者がそれぞれ、β-カテニン、p53の、またはKrasのをターゲットにしたsiRNAのプールと一緒に構築物でトランスフェクトした示した。 Pathwa各細胞株のためのy関連する遺伝子型が示されている。各スクリーニングプラットフォームの強度は、関連するシグナル伝達経路上のこれらのsiRNAによって誘導される効果の再現性によって評価した。 β-カテニンsiRNAはDLD-1、APC経路抑制タンパク質でそれぞれ欠損しており、β-カテニンの活性化された形を表現HCT-116細胞とは対照的にRKO細胞において8X TCFレポーター活性に影響を与えません。 ここをクリックする大きい数字を表示する 。
図2。遺伝子機能の高含量、細胞解析のためにルシフェラーゼに基づくレポーターを多重化。同時にWntシグナル/β-猫を監視するための戦略のA.概略図 ENIN、p53の、そしてKrasの経路活動。 FL =ホタルルシフェラーゼ、RL = シイタケルシフェラーゼ、CL = ウミホタルルシフェラーゼ（分泌酵素）。溶解物中のFLとRL活動はルシフェリンとセレンテラジン基板を用いて決定される。培養培地中のCL活性は、オキシルシフェリンを用いて測定される。 *他のレポーターシステムは、各実験の含有量を増加させるために、このプロトコルに組み込むことができる。例えば、CytoTox小麦粉アッセイは培養培地中に放出され、細胞内プロテアーゼのレベルをサンプリングすることにより細胞毒性を監視するために使用することができる。 CytoToxアッセイ試薬の追加は、CLの記者の活動に影響を与えない。、RNAiを用いた経路特定の脆弱性のB.の識別。細胞機能を遺伝子献身を定量化するために "A"に記載されて多重化ルシフェラーゼ系の能力が示されたsiRNAのプールを用いて試験した。NK ">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
初めてのハイスループットスクリーンを楽しま人のために便利にオンラインリソースを提供ルシフェラーゼベースのレポーターシステムのいくつかの御用達（例えば、プロメガ、ターゲットシステム、New England Biolabs社、及びサーモフィッシャーなど）があります。また、遺伝子の発見と方法のRNAiベースのスクリーニング結果は、他の-オミクスベースのデータセットを統合することができるためのハイスループットスクリーニングの使用を最適化に関する優れたレビューの数が役に立つ15,16でなければなりません。ハイスループットスクリーニングから "ヒット"を選択するための方法は、本報告書の範囲を超えて別の議論の主題である。このトピックに関するいくつかのレビューは17,18可能です。しかし、転写活性化レポーターの使用に基づいて画面から選択したヒットを検証するための重要な基準は、測定されたRT-PCR、定量PCRを使用して検証標的遺伝子上の同じ効果を誘導するために、同じperturbagen（RNAiを化学的又はベース）のための能力である、またはマイクロアレイ分析。また、記者によって測定されるよう応答の大きさが一般的に成功した合成記者の特徴は堅牢な信号を提供することであることを考えると内因記者の誘導よりも高くなることに留意してください。最後に、この同時トランスフェクション戦略の利点は、一方が急速に細胞活性の所望のセットを監視するための異なるレポーターカクテルを組み立てることができる容易さである。より労働集約的であるが、安定して記者を保有する細胞株の使用可能性が高い応答の変動所与の信号対雑音比を増加させると、すぐに単独でのsiRNAのトランスフェクション効率は、主に制限される。
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Disclosures
OKとLL多重ルシフェラーゼ技術に関連する特許出願中で著者がある。
Acknowledgments
我々はCPRIT（RP100119）とウェルチ財団（I-1665）からの資金支援を認める。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 | |
References
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