En Multiplex Luciferas screening plattform för Förhöra cancer-associerade Signaltransduktion i odlade celler

Summary

Att uppnå en systemnivå förståelse av cellulära processer är ett mål i dagens cellbiologi. Vi beskriver här strategier för multiplexing luciferasenheter reportrar av olika cellfunktioner slutpunkter att förhöra geners funktion med hjälp av genomet skala RNAi biblioteken.

Abstract

Genome-skala förhör av geners funktion med hjälp av RNA-interferens (RNAi) är en stark kandidat för snabb identifiering av kemiskt tractable sårbarheter cancercell. Att begränsa möjligheterna för denna teknik är oförmågan att snabbt avgränsa mekanistiska grunden för fenotypiska utfall och därmed informera om utvecklingen av molekylärt riktade terapeutiska strategier. Vi skisserar här metoder för att dekonstruera cellulära fenotyper inducerade av RNAi-medierad genmålinriktning använda multiplexade reporter system som tillåter övervakning av nyckel cancercell-associerade processer. Denna höga halt screening metodiken är mångsidig och kan lätt anpassas för screening av andra typer av stora molekylära bibliotek.

Introduction

En mängd av luciferas-baserade reportrar för övervakning av en mångfald av cellbiologiska processer är kommersiellt tillgängliga. Majoriteten av dessa DNA-konstruktioner kodar luciferasenheter proteiner som induceras att uttrycka med specifika celler stimuli eller perturbationer. Den mest robusta transkriptionellt baserade reportrar placera ett uttryck för en luciferasenzym under kontroll av syntetiska enhancerelement eller gen promotorregioner väl etablerade för sin tillförlitlighet i rapporteringen en fysiologiskt relevant transkriptionell händelsen ^1,2. Det finns också trans-reporter luciferas system som använder GAL4-UAS att driva luciferasprotein uttryck. Gal4 är en jäst transkriptionell aktivator och UAS är en förstärkare till vilken Gal4 specifikt binder till aktivera transkriptionen av gensekvenser placerade nedströms av det ^3. Dessa typer av luciferas system typiskt stöds av två DNA-plasmider - en kodar för GAL4-proteinet sammansmält med reglerandery del av ett protein av intresse, och den andra kodar en luciferasprotein placeras under kontroll av en eller flera UAS sekvenser. Således speglar den cellulära luciferas signalen aktivitetsnivån av proteinet av intresse. En annan vanlig användning av luciferas-baserade reportrar är för övervakning proteinstabilitet varigenom ett protein av intresse är sammansmält med en luciferasenzym ^4. Oavsett vilken typ av reportern, är en varning emptor noteras här som man inte kan ta på specificitet någon reporter att ha väl förhörts. Således är due diligence krävs i införlivandet av nya reporterkonstruktioner i någon forskningsstrategi.

Valet av luciferasenzymet utläsning kan vara lika viktig som tillförlitligheten hos de DNA-element som kontrollerar dess expression. I eldflugeluciferas (FL) är den mest använda enzym i kommersiellt tillgängliga konstruktioner, tillkomsten av nya luciferas reporter system som inte kräver ATP (som i falletav FL-baserade reaktioner) eller att införliva mer stabila enzymer som sänder starkare signaler lovar att förbättra effektiviteten och tillförlitligheten i denna forskningsplattform. En viktig anmärkning om urvalet av luciferas reportrar i kemiska studier är mottagligheten för FL till kemisk hämning som kan ge upphov till falska rapporter. Enligt vår erfarenhet, andra enzymer såsom Renilla eller Gaussia luciferas (RL och GL, respektive) som utnyttjar coelenterazin som ett substrat är mindre lätt inhiberas av små molekyler ^5.

Det vanligaste formatet för multiplexing luciferasenheter avläsningar innebär användning av FL och RL stor del med tanke på tillgången på lätt-till-använda kit med förmågan att sekventiellt mäta enzymatiska aktiviteter från ett enda prov. I de flesta kit, prover först utsätts för luciferin att avslöja nivåer av FL aktivitet följt av en släckningsreagens som samtidigt är deponerade hos coelenterazin att ge en SeconDary RL signal. Med tillägg av andra luciferaser som kan utsöndras såsom GL eller att använda ännu ett substrat såsom Cypridina luciferas (CL), ett större antal möjligheter för att generera höga innehåll data med luciferaser har uppstått. Ett exempel på en genomet hela RNAi skärm med den här tekniken kan hittas här ^6. Dessa tekniska framsteg har i sin tur drivit på utvecklingen av särskilda mekanismer för att släcka varje typ av luciferasenzym för att begränsa överhörning ^7. I våra händer, noterar vi en ökad frekvens av "kanteffekter" (oförklarliga trender i cellulär aktivitet associerad med kanten på höga tallrikar titer kultur), med utsöndrade luciferaser såsom GL eller CL. Å andra sidan, sådana utsöndrade luciferaser är användbara för kinetiska analyser eftersom de möjliggör signalsampling utan förvanskande cellviabilitet.

För vår studie som presenteras här, kommer vi att följa samtidigt aktiviteten av tre cancer-relevantcellulära processer: p53, Kras, och Wnt signalvägar transduktion. De reportrar som ingår i vår studie är den pp53-TA-Luc FL reporter från Clontech (hädanefter kallat p53-FL reporter) ^8, ett Elk1-GAL4/UAS-CL reportersystem (hädanefter Elk-1 reporter, Agilent), och 8X TCF RL reporter som innehåller flera syntetiska enhancerelement erkänns av den Wnt banan transkriptionsregulatorer kallas T-cell-faktorer (eller TCFS) ^9-11.

Protocol

Hela protokollet tar cirka 4 dagar.

Ett. Beredning av celler för siRNA och Reporter Transfection

Vi kommer att presentera här ett protokoll för förhör siRNA-bibliotek med hjälp av en liten uppsättning av siRNA (384 olika siRNA pooler array i 96 väl format med varje pool bestående av 4x siRNA riktade en enda gen) från en genomet hela siRNA-bibliotek är illustrativ. För denna studie kommer vi att utnyttja HCT116 celler som uppvisar avvikande Wnt och Kras signalering, och p53 aktivitet. Den lämplig cellinje i studier som syftar till att förhöra andra cellulära processer av intresse måste identifieras och utvärderas på ett liknande sätt.

1. Tvätta 5 x 10 cm ² plattor av 80-90% konfluenta HCT116-celler med PBS och skörda celler genom trypsinisering med en ml trypsinisering lösning / platta följt av neutralisering med 10 ml Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) innehållande 2% Fetal bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin / platta.
2. Överför suspenderade celler till ett 50 ml koniskt rör och centrifugat vid ~ 130 xg under 5 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml DMEM / 2% FBS / 1% penicillin / streptomycin.
3. Räkna antalet celler med en cell disk, och sedan göra en cell lösning med 10 ⁵ celler / ml, hålla 150 fjädring ml cell för nästa steg. Plate 10 ^4-celler (100 | il) i varje brunn i en 96 väl cellodling plattan med hjälp av en Multidrop automatiserad vätskeframmatare (hädanefter Multidrop). Cellsuspensionen bör vara tillräcklig i detta fall för plätering 12 x 96 brunnars plattor.
4. Inkubera plattorna med cellerna vid 37 ° C i en inkubator med 5% _CO2 vid utarbetandet av transfektionsblandningen.

2. Förbereda Reporter Solution Construct Stock

1. Isolera högkvalitativ reporter konstruera DNA med standard Midiprep kit (NucleoBond Xtra Midi producerad avClontech) och späd ut DNA till en slutlig koncentration av 1 mg / ml för varje reporter.
2. Bered 100 pl av reporterkonstrukt stamlösning genom att kombinera 30 ul av p53-FL, 30 pl av 8X TCF-RL, 30 pl av Elk1-Gal4, 6 | il UAS-CL och 4 | il av _H2O för att uppnå en DNA-blandning med en slutlig 1:1:1:0.2 förhållande av reportrarna. Slutlig DNA-koncentration av detta DNA mix stamlösning är 0,3 mg / ml.

Tre. Förbereda siRNA / DNA-transfektion Mix

I denna del av protokollet, kommer vi att förbereda siRNA / DNA-transfektion mixar som kommer att vara tillräcklig för transfektion 12 x 96 brunnar. För detta test bibliotek av 4 x 96 brunnar av siRNA, kommer vi transfektera varje siRNA pool i tre exemplar. Den transfektionsreagens vi kommer använda kallas Effectene (Qiagen). I våra händer detta är det enda reagens som fungerar för samtidig tillförsel av siRNA och DNA i odlade celler.

1. Späd 80 ^ reporterkonstruktion lager solmepannor i 8 ml EG buffert (Effectene Kit) för att uppnå en DNA-lösning med en slutlig koncentration av 3 ug / ml. I allmänhet, förbereda tillräckligt mix DNA-lösning för omedelbar användning.
2. Plate 20 pl av denna DNA-lösning till varje brunn i en 96 brunn / platta. Antalet 96 brunnar kommer att bero på hur många siRNA pooler kommer att testas. Till exempel, i det här fallet kommer vi att behöva 4 x 96 brunnar att värdera 384 olika siRNA pooler.
3. De siRNA som ska testas bör vara ett lager koncentration av 5 iM. Om inte, kan de vara replika pläterades och späddes till denna koncentration med användning av den rekommenderade spädningsbuffert associerad med varje bibliotek.
4. Överför 2 pl av vardera 5 iM siRNA lager till motsvarande brunn i PCR-platta innehållande den utspädda DNA lager med en Biomek Automated Liquid Handler. Beroende på omfattningen av studien, kan en flerkanalig pipett räcker.
5. Nu ska vi lägga 1 pl Enhancer lösning (Effectene kit) till varje brunn av DNA / siRNA PLAte. Detta igen kan åstadkommas antingen med en automatiserad vätskehanterare eller flerkanalspipett.
6. Låt Enhancer reaktionen ska ske vid RT i 5 min och tillsätt sedan 3 il Effectene transfektion reagens till varje brunn och inkubera vid RT under ytterligare 10 min.
7. För att stoppa transfektion komplexbildning, tillsätt 10 | il DMEM / 2% FBS / 1% penicillin / streptomycin till varje brunn i PCR-plattan.
8. Överför 10 ul av transfektionsblandning till varje brunn i plattan med 96 brunnar innehållande cellerna (hämtade från cellen inkubator). Eftersom varje transfektion kommer att utföras i tre exemplar, kommer samma mix appliceras på två ytterligare 96 brunnsplattor innehållande celler.
9. Inkubera cellerna med transfektion blandningar tillsatta vid 37 ° C i en fuktig miljö med 5% _CO2 under 36 timmar.

4. Bestäm luciferasaktiviteter från cellprover

Efter 36 timmar, luciferasaktiviteter är klar för mätningi transfekterade celler. Slutpunkten bör fastställas på en per-experiment basis. I vår studie, hade en 36 hr inkubationstid gav tidigare ett tillräckligt robust signal för vilket utfall beslutsamhet. Eftersom denna studie innehåller flera reportrar (en utsöndras i odlingsmedium, och två andra uttrycks i cellen cytoplasma), kommer vi att få mätningar från både odlingsmedium samt en cellulär lysat.

1. Detektering av CL aktivitet i odlingsmediet:
   1. 20 pl odlingsmedium är replika-klädd i en vit ogenomskinlig 96 brunnar (antingen använda Biomek Liquid Handler eller multikanalspipett).
   2. Tillsätt 20 pl av CL analysbuffert (Targeting Systems) till varje brunn.
   3. Tillsätt 10 pl av Cypridina luciferinsubstrat (Targeting Systems) till varje brunn och detektera CL aktivitet med användning av en luminometer (den PHERAstar plattläsare producerad av BMG till exempel).
2. Upptäckt av FL och RL aktivitet:
   1. Lysera cells genom att först avlägsna odlingsmediet. Detta kan åstadkommas snabbt genom att vända plattan upp och ner och kasta medium i ett handfat. Kvarvarande mediet kan avlägsnas genom att försiktigt knacka den upp och ned plattan på hushållspapper. Lägg 30 pl 1X Passive Lysis Buffer (Promega) till varje brunn av celler med Multidrop och placera på en plattform rocker (Bellco är ett företag som gör dessa) ställa en medelhastighet under 5 min vid RT.
   2. Tillsätt 20 pl av Luciferase Assay Reagent II (en del av Promega Dual Luciferase Kit) med användning av Multidrop och omedelbart mäta FL aktivitet med användning av luminometer. Nästa, lägg till Stop & Glo reagens (Promega) som kommer att släcka FL verksamheten och möjliggöra mätning av RL aktivitet. Obs: om du inte använder substrat mixar som tillåter utökad signalens varaktighet (t.ex. Dual-Glo Luciferas Kits från Promega), kräver användning av flash kit snabb mätning vid substrattillsats (inom 5 min).

Representative Results

Trots framsteg inom kartlägga mutational landskap av olika cancerformer med massiva insatser genomsekvensering ^12-14, vi fortfarande inte har infört ett systematiskt tillvägagångssätt för att översätta dessa observationer i insatsstrategier. I kolorektal cancer (CRC), mutationer som förutspås påverka delar av tre cellulära processer - Wnt / β-catenin, p53, och Kras signalering - finns i 99% av alla tumörer tyder på att de är viktiga drivkrafter för cellulär transformation i tarmen ^13. Således är cancer genomet datamängder sannolikt anrikats för gener som stöder gemensamma nämnaren cancer främja processer, och som skulle kunna utnyttjas för snabb identifiering av sårbarheter cancercell. För att undersöka denna hypotes, har vi utarbetat strategier mottagliga för hög genomströmning förhör av geners funktion med avseende på Wnt / β-catenin, p53, och Kras signalering. Vi visar först specificiteten hos varje reporter system enstaka Reporter tester (figur 1) och sedan ge belägg för att dessa reportrar kunde användas tillsammans för samtidiga mätningar av geners aktivitet av dessa tre viktiga cellulära processer (Figur 2).

Figur 1. Hög genomströmning luciferas-baserade analyser för övervakning Wnt / β-catenin, p53 och Kras / Erk väg status i däggdjursceller. Robustheten i tre olika screening plattformar individuellt värderade före multiplexering med kontroll siRNA riktade väletablerade pathway komponenter. Angivna kolorektal cancer cellinjer transfekterades med 8X TCF, pp53-TA-Luc, eller Elk-1 eldflugeluciferas-kodande reporter konstruerar tillsammans med pooler av siRNA riktade β-catenin, p53, eller Kras, respektive. Pathway-relevanta genotyper för varje cellinje indikeras. Styrkan av varje screening plattform bedömdes av reproducerbarhet av dessa siRNA-inducerade effekter på den relevanta signaltransduktionsvägen. De β-catenin siRNAs har ingen effekt på 8X TCF reporteraktivitet i RKO-celler i motsats till DLD-1 och HCT-116 celler som är respektive bristfällig i APC reaktionsvägen suppressor protein och uttrycker en aktiverad form av β-catenin. klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Multiplexing luciferas baserade reportrar för hög halt cellulär analys av geners funktion. A. Schematisk bild av en strategi för att samtidigt övervaka Wnt / β-cat Enin, p53, och Kras aktiviteter pathway. FL = eldflugeluciferas, RL = Renilla luciferas, CL = Cypridina luciferas (utsöndrat enzym). FL och RL verksamhet i lysat bestäms med luciferin och coelenterazine substrat. CL aktivitet i odlingsmediet mäts med användning oxyluciferin. * Andra reporter system kan införlivas i detta protokoll för att öka innehållet i varje experiment. Till exempel kan den CytoTox Mjöl analysen användas för att övervaka cellulär toxicitet genom sampling av nivåerna av en intracellulär proteas frisätts i odlingsmediet. Tillsatsen av CytoTox analysreagenset påverkar inte aktiviteten av CL reporter. B. Identifiering av väg-specifika sårbarheter med RNAi. Förmågan hos den multiplexerade luciferas systemet beskrivs i "A" för att kvantifiera gen hängivenhet till cellulär funktion testades med de angivna siRNA poolerna.nk "> Klicka här för att visa en större bild.

Discussion

Det finns flera leverantörer av luciferas-baserade rapporteringssystem (t.ex. Promega, identifieringssystem, New England Biolabs, och Thermo Fisher) som ger användbara resurser på nätet för dem som underhållande en hög genomströmning skärm för första gången. Dessutom bör ett antal utmärkta recensioner om att optimera användningen av high-throughput skärmar för gen upptäckt och hur RNAi screening resultat kan integreras med andra-genomik-baserade datamängder vara användbart ^15,16. Metoder för val av "hits" från hög genomströmning skärmar är föremål för en annan diskussion som är utanför ramen för denna rapport. Flera recensioner om detta ämne finns ^17,18. Dock är ett viktigt kriterium för att validera utvalda hits från skärmar baserade på användning av transkriptionellt aktiverade reportrar möjligheten för samma perturbagenen (RNAi-eller kemiskt baserade) för att framkalla samma effekt på validerade målgener mätt med RT-PCR, realtids-, Eller microarray analys. Dessutom, tänk på att storleken på svar mätt med reportern är oftast högre än induktion av en endogen reporter med tanke på att en del av ett framgångsrikt syntetisk reporter är att ge en tydlig signal. Slutligen är en fördel med denna samtransfektion strategi den lätthet med vilken man kan snabbt montera olika reporter cocktails för övervakning av ett önskade uppsättningen av cellulära aktiviteter. Även om mer arbetsintensiv, skulle användningen av cellinjer som stabilt härbärgerar reportrarna sannolikt öka signalbrusförhållandet Variabiliteten i svaret är nu i första hand begränsat till siRNA transfektion effektivitetsskäl.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PathDetect Elk1 Trans-Reporting System	Agilent Technologies Inc.	219005
Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector	Clontech Lab Inc.	631914
Effectene Transfection Reagent	Qiagen Inc.	301427
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega Corp.	E1960
Cypridina Luciferase Assay reagent	Targeting Systems	VLAR-1
HCT116 cells	ATCC	CCL-247
CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay	Promega Corp.	G9260
EQUIPMENT
MultiFlo Microplate Dispenser	Labsystems Inc.	Model 832
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation	Beckman Coulter Inc.	A31842
PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader	BMG Labtech Inc.	0471-101A
Bright-Line Reichert Hemacytometers	Hausser Scientific Company	1490