Summary
Il raggiungimento di un livello di sistemi di comprensione dei processi cellulari è un obiettivo di biologia cellulare moderna. Descriviamo qui le strategie per multiplazione reporter luciferasi di varia funzione cellulare end-point per interrogare la funzione del gene utilizzando genoma scala librerie di RNAi.
Abstract
Interrogatorio genoma scala della funzione genica mediante RNA interference (RNAi) è di enorme speranza per l'identificazione rapida delle chimicamente trattabili vulnerabilità delle cellule tumorali. Limitando il potenziale di questa tecnologia è l'incapacità di delineare rapidamente la base meccanicistica dei risultati fenotipici e quindi informare lo sviluppo di strategie terapeutiche a bersaglio molecolare. Noi descriviamo qui i metodi di decostruire fenotipi cellulari indotti dal gene di RNAi mediato il targeting utilizzando sistemi reporter canalizzati che permettono il monitoraggio del cancro chiave processi associati alle cellule. Questa metodologia screening ad alto contenuto è versatile e può essere facilmente adattato per lo screening di altri tipi di grandi librerie molecolari.
Introduction
Una varietà di reporter luciferasi-based per il monitoraggio di una gamma diversificata di processi biologici cellulari sono disponibili in commercio. La maggioranza di questi DNA costruisce codificare proteine luciferasi che sono indotte ad esprimere da stimoli specifici delle cellule o perturbazioni. La maggior parte dei giornalisti robusti transcriptionally basati inserire l'espressione di un enzima luciferasi sotto il controllo di elementi enhancer sintetici o regioni promotore del gene ben stabiliti per la loro affidabilità nel riportare una fisiologicamente rilevanti 1,2 evento trascrizionale. Ci sono anche sistemi trans-reporter luciferasi che utilizzano GAL4-UAS per guidare l'espressione della proteina luciferasi. GAL4 è un lievito attivatore trascrizionale e la SUP è un enhancer di GAL4 che si lega specificamente ad attivare la trascrizione di sequenze geniche poste a valle di esso 3. Questi tipi di sistemi di luciferasi sono tipicamente supportate da due plasmidi DNA - una codifica la proteina GAL4 fusa al regulatory porzione di una proteina di interesse, e il secondo codifica una proteina luciferasi posto sotto il controllo di una o più sequenze UAS. Così, il segnale luciferasi cellulare riflette il livello di attività della proteina di interesse. Un altro uso comune di reporter luciferasi è basati per monitorare la stabilità proteica quale una proteina di interesse è fuso ad un enzima luciferasi 4. Indipendentemente dal tipo di giornalista, un caveat emptor viene qui notare come non si può assumere la specificità di qualsiasi reporter di essere stato ben interrogato. Così, due diligence è richiesta la costituzione di nuovi costrutti reporter di qualsiasi strategia di ricerca.
La selezione dell'enzima luciferasi read-out può essere importante quanto l'affidabilità dei elementi di DNA che controllano l'espressione. Considerando lucciola luciferasi (FL) è l'enzima più comunemente usato in costrutti disponibili in commercio, l'avvento di nuovi sistemi di luciferasi che non richiedono ATP (come nel casodi reazioni FL-based), o che incorporano enzimi più stabili che emettono segnali forti promettono di migliorare l'efficienza e l'affidabilità di questa piattaforma di ricerca. Una nota importante per quanto riguarda la selezione dei reporter luciferasi in studi chimici è la suscettibilità di FL di inibizione chimica che potrebbe dare luogo a falsi rapporti. Nella nostra esperienza, altri enzimi come Renilla o Gaussia luciferasi (RL e GL, rispettivamente) che utilizzano come substrato coelenterazina sono meno facilmente inibito da piccole molecole 5.
Il formato più comune per multiplazione luciferasi read-out comporta l'uso di FL e RL largamente data la disponibilità di facile da usare kit con la capacità di misurare sequenzialmente attività enzimatiche da un singolo campione. Nella maggior parte kit, i campioni vengono prima esposti a luciferina per rivelare livelli di attività FL seguiti da un reagente tempra che viene contemporaneamente depositati presso coelenterazina per produrre una secondasegnale RL dary. Con l'aggiunta di altri luciferases che possono essere secreti come GL o che utilizzano ancora un altro substrato quale Cypridina luciferasi (CL), un numero maggiore di possibilità per la generazione di dati di alta contenuti utilizzando luciferases sono emerse. Un esempio di un genoma schermo RNAi utilizzando questa tecnica può essere trovato qui 6. Questi progressi tecnologici hanno a loro volta stimolato lo sviluppo di meccanismi specifici per placare ogni tipo di enzima luciferasi per limitare diafonia 7. Nelle nostre mani, si nota una maggiore frequenza di "effetti di bordo" (tendenze inspiegabili in attività cellulare associato alla periferia di piastre di coltura ad alto titolo), con luciferases secrete come GL o CL. D'altra parte, tali luciferases secrete sono utili per saggi cinetici quanto consentono di campionamento del segnale senza adulterare vitalità cellulare.
Per il nostro studio qui presentato, avremo contemporaneamente monitorare l'attività dei tre cancro rilevantiprocessi cellulari: il p53, Kras, e Wnt vie di trasduzione del segnale. I giornalisti incorporati nel nostro studio sono il pp53-TA-Luc FL giornalista Clontech (d'ora in poi indicato come il giornalista p53-FL) 8, un sistema giornalista Elk1-GAL4/UAS-CL (d'ora in poi Elk-1 giornalista, Agilent), e la 8X TCF RL giornalista che incorpora più elementi enhancer sintetici riconosciuti dalle Wnt pathway regolatori trascrizionali noti come fattori di cellule T (o TCF) 9-11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Intero protocollo impiega circa 4 giorni.
1. Preparazione di cellule per siRNA e Reporter Transfezione
Introdurremo qui un protocollo per interrogare librerie di siRNA utilizzando un piccolo insieme di siRNA (384 diversi siRNA piscine array in formato a 96 pozzetti con ogni pool composto da siRNA 4x Targeting per un singolo gene) da una libreria siRNA genoma a scopo illustrativo. Per questo particolare studio, sfrutteremo HCT116 cellule che esibiscono devianti segnalazione Wnt e Kras, e l'attività di p53. La linea cellulare appropriata in studi volti a interrogare altri processi cellulari di interesse dovrà essere identificato e valutato in modo simile.
- Lavare 5 x 10 cm 2 piatti di 80-90% confluenti HCT116 cellule con PBS poi raccolto mediante tripsinizzazione cellule con 1 ml di soluzione di tripsinizzazione / piastra seguito da neutralizzazione con 10 ml di Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) contenente 2% feTal siero bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina / piastra.
- Trasferire le cellule in sospensione in una provetta da 50 ml e centrifugare a ~ 130 xg per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di DMEM / 2% FBS / 1% di penicillina / streptomicina.
- Contare il numero di cellule con un contatore di cellule, e poi fare una soluzione di cellule con 10 5 cellule / ml, 150 ml mantenere sospensione cellulare per il passaggio successivo. Piastra 10 4 cellule (100 microlitri) in ciascun pozzetto di una piastra di coltura cellulare 96 utilizzando un dosatore automatico multipunto (d'ora in poi multipunto). La sospensione cellulare dovrebbe essere sufficiente in questo caso per placcatura 12 x 96 pozzetti.
- Incubare le piastre con cellule a 37 ° C in un incubatore con il 5% di CO 2 durante la preparazione della miscela di trasfezione.
2. Preparazione della Construct Reporter Archivio Solution
- Isolare giornalista di alta qualità costruire DNA utilizzando kit standard di midiprep (NucleoBond Xtra MIDI prodotti daClontech) e diluire il DNA per una concentrazione finale di 1 mg / ml per ciascun giornalista.
- Preparare 100 ml di soluzione madre giornalista costruire combinando 30 ml di p53-FL, 30 ml di 8X TCF-RL, 30 ml di ELK1-Gal4, 6 microlitri UAS-CL e 4 ml di H 2 O per ottenere una miscela di DNA con un 1:1:1:0.2 rapporto finale dei giornalisti. Concentrazione di DNA finale di questa soluzione madre di DNA misto è di 0,3 mg / ml.
3. Preparazione del siRNA / DNA Transfezione Mix
In questa parte del protocollo, prepareremo siRNA / DNA mix di trasfezione che saranno sufficienti per trasfezione 12 x 96 pozzetti. Per questa libreria di test di 4 x 96 pozzetti di siRNA, saremo trasfettare ogni pool siRNA in triplice copia. Il reagente di trasfezione che useremo si chiama Effectene (Qiagen). Nelle nostre mani questo è l'unico reagente che funziona per l'erogazione contemporanea di siRNA e DNA in cellule coltivate.
- Diluire 80 ml di giornalista costrutto magazzino solution in 8 ml di tampone CE (Effectene Kit) per ottenere una soluzione di DNA con una concentrazione finale di 3 mg / ml. In generale, preparare abbastanza soluzione di miscela di DNA per uso immediato.
- Piastra 20 ml di questa soluzione di DNA a ciascun pozzetto di una ben 96 / piastra. Il numero delle piastre a 96 pozzetti dipenderà da quanti saranno testati piscine siRNA. Ad esempio, in questo caso avremo bisogno di 4 x 96 pozzetti per valutare 384 diverse piscine siRNA.
- I siRNA da testare devono essere ad una concentrazione magazzino di 5 micron. Se non, possono essere replica placcato e diluito a questa concentrazione utilizzando il tampone di diluizione raccomandata associato a ciascuna libreria.
- Trasferire 2 ml di ogni 5 micron siRNA magazzino al corrispondente pozzetto della piastra di PCR contenente il brodo DNA diluito con un Biomek Automated Liquid Handler. Seconda della scala dello studio, una pipetta multicanale può essere sufficiente.
- Ora, aggiungeremo 1 ml di soluzione Enhancer (kit Effectene) in ciascun pozzetto del DNA / siRNA plaTE. Anche questo può essere realizzato sia con un gestore di liquido automatizzato o multicanale pipetta.
- Lasciare che la reazione Enhancer avvenga a temperatura ambiente per 5 minuti poi aggiungere 3 ml di reagente di trasfezione Effectene a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per altri 10 min.
- Per interrompere trasfezione complesso formazione, aggiungere 10 ml di DMEM / 2% FBS / 1% di penicillina / streptomicina a ciascun pozzetto della piastra PCR.
- Trasferire 10 microlitri della miscela di trasfezione per ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenenti le cellule (recuperati dal termostato cella). Come ogni trasfezione verrà effettuata in triplicato, la stessa miscela sarà applicato a due ulteriori piastre 96 pozzetti contenenti cellule.
- Incubare le cellule con miscele di trasfezione aggiunti a 37 ° C in ambiente umidificato al 5% di CO 2 per 36 hr.
4. Determinare attività luciferasi da campioni di cellule
Dopo 36 ore, le attività di luciferasi sono pronti per la misurazionein cellule trasfettate. Il punto finale dovrebbe essere determinato su una base per-esperimento. Nel nostro studio, un tempo di incubazione di 36 ore aveva già dato un segnale sufficientemente robusto per significato determinazione esito. Poiché questo studio incorpora reporter multipli (uno secreta nel terreno di coltura, e altri due espressa nel citoplasma cellulare), otterremo misurazioni sia da mezzo di coltura così come un lisato cellulare.
- Rivelazione dell'attività CL nel mezzo di coltura:
- 20 ml di terreno di coltura è replica-placcato in un bianco opaco 96 pozzetti (sia utilizzando il Liquid Handler Biomek o multicanale pipetta).
- Aggiungere 20 ml di tampone CL (sistemi di puntamento) in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 10 ml di Cypridina substrato luciferina (Sistemi Targeting) a ciascun pozzetto e rilevare attività CL usando un luminometro (il lettore di piastre Pherastar prodotto da BMG per esempio).
- Rilevazione di FL e attività RL:
- Lyse il cells rimuovendo prima il terreno di coltura. Questo può essere realizzato rapidamente girando piastra capovolta e lanciare medie in un lavandino. Rimanendo mezzo può essere rimosso battendo leggermente la piastra di testa in giù su carta assorbente. Aggiungere 30 ml di 1X Passive Lysis Buffer (Promega) in ciascun pozzetto di celle usando il multipunto e posto su una sedia a dondolo piattaforma (Bellco è una ditta che produce questi) impostare una velocità media per 5 min a RT.
- Aggiungere 20 microlitri della Luciferase Assay Reagent II (parte del kit Promega dual luciferasi) utilizzando l'attività FL Multidrop e subito misurare usando il luminometro. Successivamente, aggiungere Stop & Glo Reattivo (Promega) che spegnerà l'attività FL e consentire la misurazione delle attività di RL. Nota: se non si sta utilizzando miscele di substrato che permettono durata del segnale prolungato (come Dual-Glo Kit luciferasi da Promega), l'uso di kit flash richiede una rapida misurazione su substrato oltre (entro 5 minuti).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nonostante i progressi nella mappatura del paesaggio mutazionale di vari tipi di cancro che utilizzano enormi sforzi di sequenziamento del genoma 12-14, noi ancora non abbiamo in atto un approccio sistematico per la traduzione di queste osservazioni nelle strategie di intervento. Nel cancro del colon-retto (CRC), le mutazioni che si prevede di colpire i componenti di tre processi cellulari - Wnt / β-catenina, p53, e Kras segnalazione - si trovano nel 99% di tutti i tumori che suggeriscono che i fattori trainanti della trasformazione cellulare nell'intestino 13. Così, il cancro dataset genomici sono probabilmente arricchite per i geni che sostengono il cancro comune denominatore promuovere processi, e che potrebbero essere sfruttati per una rapida identificazione delle vulnerabilità delle cellule tumorali. Per studiare questa ipotesi, abbiamo messo a punto le strategie suscettibili di interrogatorio high-throughput di funzione del gene rispetto al Wnt / β-catenina, p53, e Kras segnalazione. Abbiamo innanzitutto dimostrare la specificità di ciascun sistema di giornalista in un'unica reportetest r (Figura 1) e quindi forniscono la prova che questi reporter potrebbero essere utilizzati insieme per misurazioni simultanee di attività genica di queste tre importanti processi cellulari (Figura 2).
Figura 1. Saggi di luciferasi-based high-throughput per il monitoraggio di Wnt / β-catenina, p53 e Kras / Erk stato percorso in cellule di mammifero. La robustezza di tre diverse piattaforme di screening sono stati valutati singolarmente prima di multiplazione mediante siRNA di controllo rivolte componenti della via consolidate. Linee cellulari di cancro del colon-retto indicate sono state trasfettate con il 8X TCF, pp53-TA-Luc, o Elk-1 lucciola luciferasi-encoding costruisce insieme a piscine di siRNA rivolte β-catenina, p53, o Kras, rispettivamente. Pathwasono indicati genotipi y-rilevanti per ciascuna linea cellulare. La forza di ciascuna piattaforma screening è stato valutato dalla riproducibilità di questi effetti siRNAs-indotti sulla pertinente trasduzione del segnale. I siRNA β-catenina non hanno effetto su 8X TCF attività giornalista in cellule RKO in contrasto con DLD-1 e HCT-116 cellule che sono rispettivamente carenti nel percorso proteina soppressore APC ed esprimono una forma attivata di β-catenina. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Multiplexing reporter luciferasi base per l'analisi ad alto contenuto cellulare di funzione del gene. A. Rappresentazione schematica di una strategia per il monitoraggio contemporaneamente Wnt / β-cat enin, p53, e le attività di via Carso. FL = lucciola luciferasi, RL = Renilla luciferasi, CL = Cypridina luciferasi (enzima secreto). Attività di FL e RL nel lisato sono determinate con luciferina e substrati coelenterazina. Attività CL nel mezzo di coltura viene misurata utilizzando oxyluciferin. * Altri sistemi reporter possono essere incorporati in questo protocollo per aumentare il contenuto di ogni esperimento. Per esempio, il saggio Farina Cytotox può essere utilizzato per monitorare tossicità cellulare campionando i livelli di una proteasi intracellulare rilasciata nel mezzo di coltura. L'aggiunta del reagente dosaggio Cytotox non influenza l'attività del reporter CL. B. Identificazione di vulnerabilità pathway-specifici utilizzando RNAi. La capacità del sistema luciferasi multiplati descritto in "A" per quantificare dedica gene per la funzione cellulare è stata testata usando le piscine siRNA indicati.nk "> Clicca qui per ingrandire la figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ci sono diversi fornitori dei sistemi reporter luciferasi-based (come ad esempio Promega, sistemi di puntamento, New England Biolabs, e Thermo Fisher) che forniscono utili risorse on-line per coloro intrattenere uno schermo ad alta produttività per la prima volta. Inoltre, una serie di ottime recensioni riguardo ottimizzare l'uso di schermi high-throughput per la scoperta del gene e come base di RNAi risultati di screening possono essere integrati con altri dataset-omiche basate dovrebbe essere utile 15,16. Metodi per la selezione dei "colpi" di schermi high-throughput sono oggetto di un'altra discussione che va oltre gli scopi di questo rapporto. Diverse recensioni su questo argomento sono disponibili 17,18. Tuttavia, un criterio importante per convalidare colpi selezionati dagli schermi basati sull'uso di reporter trascrizionalmente attivati è la possibilità per la stessa perturbagen (RNAi o chimicamente based) per indurre lo stesso effetto su geni bersaglio convalidati come misurato mediante RT-PCR, qPCRO analisi di microarray. Inoltre, tenere presente che l'entità della risposta misurata dal reporter è tipicamente superiore alla induzione di una giornalista endogeno dato che una caratteristica di un reporter successo sintetico è di fornire un segnale robusto. Infine, un vantaggio di questa strategia di co-trasfezione è la facilità con cui si può assemblare rapidamente cocktail diversi reporter per monitorare un insieme desiderato di attività cellulari. Anche se più laborioso, l'uso di linee cellulari stabilmente ospitano i reporter probabilmente aumentare il rapporto segnale rumore in considerazione della variabilità della risposta adesso è principalmente limitato a siRNA efficienza di trasfezione solo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
OK e LL sono autori di un brevetto relativo alla tecnologia multiplex luciferasi.
Acknowledgments
Noi riconosciamo il supporto di finanziamento da CPRIT (RP100119) e la Welch Foundation (I-1665).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 | |
References
- Bronstein, I., Fortin, J., Stanley, P. E., Stewart, G. S., Kricka, L. J. Chemiluminescent and bioluminescent reporter gene assays. Analytical Biochemistry. 219, 169-181 (1994).
- Miraglia, L. J., King, F. J., Damoiseaux, R. Seeing the light: luminescent reporter gene assays. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 14, 648-657 (2011).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends in Genetics: TIG. 20, 384-391 (2004).
- Smirnova, N. A., et al. Development of Neh2-luciferase reporter and its application for high throughput screening and real-time monitoring of Nrf2 activators. Chem. Biol. 18, 752-765 (2011).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat. Chem. Biol. 5, 100-107 (2009).
- Tang, W., et al. A genome-wide RNAi screen for Wnt/beta-catenin pathway components identifies unexpected roles for TCF transcription factors in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 9697-9702 (2008).
- Multiplexed Luciferase Reporter Assay Systems. United States patent. Lum, L. D., Kulak, O. , (2012).
- Funk, W. D., Pak, D. T., Karas, R. H., Wright, W. E., Shay, J. W. A transcriptionally active DNA-binding site for human p53 protein complexes. Mol. Cell Biol. 12, 2866-2871 (1992).
- DasGupta, R., Kaykas, A., Moon, R. T., Perrimon, N. Functional genomic analysis of the Wnt-wingless signaling pathway. Science. 308, 826-833 (2005).
- Korinek, V., et al. Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf-4. Nat. Genet. 19, 379-383 (1998).
- Korinek, V., et al. Two members of the Tcf family implicated in Wnt/beta-catenin signaling during embryogenesis in the mouse. Mol. Cell Biol. 18, 1248-1256 (1998).
- Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487, 330-337 (2012).
- Koboldt, D. C., et al. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. , (2012).
- Wood, L. D., et al. The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Berndt, J. D., Biechele, T. L., Moon, R. T., Major, M. B. Integrative analysis of genome-wide RNA interference screens. Science Signaling. 2, pt4 (2009).
- Falschlehner, C., Steinbrink, S., Erdmann, G., Boutros, M. High-throughput RNAi screening to dissect cellular pathways: a how-to guide. Biotechnology Journal. 5, 368-376 (2010).
- Boutros, M., Bras, L. P., Huber, W. Analysis of cell-based RNAi screens. Genome Biology. 7, R66 (2006).
- Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS ONE. 6, e28338 (2011).
