Summary
Atteindre un niveau compréhension des systèmes de processus cellulaires est un objectif de la biologie cellulaire moderne. Nous décrivons ici les stratégies pour les journalistes luciférase multiplexage de diverses fonctions cellulaires points d'extrémité pour interroger la fonction des gènes en utilisant l'échelle du génome bibliothèques ARNi.
Abstract
Interrogation échelle du génome de la fonction des gènes en utilisant l'interférence ARN (ARNi) s'annonce très prometteuse pour l'identification rapide des vulnérabilités de cellules cancéreuses chimiquement traitables. Limiter le potentiel de cette technologie est l'incapacité à définir rapidement la base mécaniste des résultats phénotypiques et ainsi informer le développement de stratégies thérapeutiques moléculaires ciblées. Nous décrivons ici les méthodes de déconstruire phénotypes cellulaires induits par le gène ARNi à médiation visant l'utilisation des systèmes multiplexés journaliste qui permettent le suivi du cancer touche les processus associés à la cellule. Cette méthode de criblage à haut contenu est polyvalent et peut être facilement adapté pour le dépistage d'autres types de grandes bibliothèques moléculaires.
Introduction
Une variété de journalistes luciférase basés pour surveiller un large éventail de processus biologiques cellulaires sont disponibles commercialement. La majorité de ces constructions d'ADN codant pour des protéines luciférase qui sont amenés à exprimer par des stimuli spécifiques de cellules ou de perturbations. Les plupart des journalistes transcription base robuste placent l'expression d'une enzyme luciférase sous le contrôle des éléments activateurs synthétiques ou régions du promoteur du gène bien établies pour leur fiabilité en rapporter un événement 1,2 transcriptionnelle physiologiquement pertinents. Il existe également des systèmes trans-rapporteur de la luciférase qui utilisent GAL4 UAS pour conduire l'expression de la protéine luciférase. Gal4 de levure est un activateur de la transcription et de l'UAS est un activateur de Gal4 qui se lie spécifiquement à activer la transcription des séquences de gènes placés en aval de celui-ci 3. Ces types de systèmes luciférase sont généralement pris en charge par deux plasmides d'ADN - on encode la protéine GAL4 fusionné à la regulatory partie d'une protéine d'intérêt, et le deuxième code pour une protéine luciférase placé sous le contrôle d'une ou plusieurs séquences d'UAS. Ainsi, le signal luciférase cellulaire reflète le niveau d'activité de la protéine d'intérêt. Une autre utilisation courante de journalistes luciférase à base est de surveiller la stabilité des protéines par lequel une protéine d'intérêt est fusionnée à une enzyme luciférase 4. Quel que soit le type de journaliste, un caveat emptor est à noter ici que l'on ne peut assumer la spécificité de tout journaliste aurait été bien interrogé. Ainsi, la diligence raisonnable est nécessaire dans l'intégration des nouvelles constructions rapporteurs dans toute stratégie de recherche.
Le choix de l'enzyme luciférase lecture peut être aussi important que la fiabilité des éléments d'ADN qui contrôlent son expression. Alors que la luciférase de luciole (FL) est l'enzyme la plus couramment utilisée dans les constructions disponibles dans le commerce, l'avènement de nouveaux systèmes de rapporteur de la luciférase qui ne nécessitent pas l'ATP (comme dans le casdes réactions FL-based) ou qui intègrent des enzymes plus stables qui émettent des signaux forts promettre d'améliorer l'efficacité et la fiabilité de cette plate-forme de recherche. Une remarque importante concernant la sélection des journalistes luciférase dans des études chimiques est la sensibilité des FL à l'inhibition chimique qui pourrait donner lieu à de faux rapports. Dans notre expérience, d'autres enzymes telles que Renilla ou Gaussia luciférase (RL et GL, respectivement) qui utilisent coelentérazine comme substrat sont moins facilement inhibé par des petites molécules 5.
Le format le plus courant pour le multiplexage luciférase read-out implique l'utilisation de FL et RL largement donné la disponibilité de fonctions faciles à utiliser kits avec la capacité à mesurer de manière séquentielle des activités enzymatiques à partir d'un seul échantillon. Dans la plupart des ensembles, les échantillons sont d'abord exposées à la luciférine pour révéler les niveaux d'activité FL suivis d'un réactif d'extinction qui est simultanément déposés avec coelentérazine pour donner une secondesignal de RL Dary. Avec l'ajout d'autres luciferases qui peuvent être sécrétés comme GL ou que l'utilisation encore un autre substrat comme Cypridina luciférase (CL), un plus grand nombre de possibilités pour générer des données à haute teneur en utilisant luciferases ont émergé. Un exemple d'un écran ARNi du génome entier en utilisant cette technique peut être trouvée ici 6. Ces avancées technologiques ont à leur tour stimulé le développement de mécanismes spécifiques pour étancher chaque type d'enzyme luciférase pour limiter la diaphonie 7. Dans nos mains, nous constatons une plus grande fréquence des «effets de bord» (tendances inexplicables dans l'activité cellulaire associée au bord de plaques de culture à titre élevé), avec luciferases sécrétées telles que GL ou CL. D'autre part, ces luciferases sécrétées sont utiles pour les essais cinétiques, car elles permettent d'échantillonnage du signal sans dénaturer la viabilité cellulaire.
Pour notre étude présentée ici, nous allons surveiller simultanément l'activité de trois cancer pertinentesprocessus cellulaires: la p53, Kras, et les voies de transduction du signal Wnt. Les journalistes intégrés dans notre étude sont le FL journaliste PP53-TA-Luc de Clontech (ci-après dénommé le journaliste p53-FL) 8, un système de journaliste Elk1-GAL4/UAS-CL (ci-Elk-1 journaliste, Agilent), et le 8X TCF RL journaliste qui intègre de multiples éléments activateurs synthétiques reconnus par la voie Wnt régulateurs de transcription connus comme des facteurs de lymphocytes T (ou FCT) 9-11.
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Protocol
Protocole complet prend environ 4 jours.
1. Préparation des cellules pour les siRNA et rapporteur transfection
Nous allons présenter ici un protocole pour interroger les bibliothèques de siRNA à l'aide d'un petit ensemble de siRNA (384 tableau différent des pools de siRNA en format 96 puits chaque ensemble étant composé de siRNA 4x ciblant un gène unique) à partir d'une base de données siRNA du génome pour des fins d'illustration. Pour cette étude, nous allons exploiter HCT116 cellules qui présentent la signalisation Wnt et Kras déviants, et l'activité de p53. La lignée cellulaire appropriée dans les études visant à interroger d'autres processus cellulaires d'intérêt devront être identifiés et évalués de la même façon.
- Laver 5 x 10 cm 2 plaques de cellules 80-90% de confluence HCT116 avec du PBS, puis les cellules de la récolte par la trypsine en utilisant 1 ml de solution de trypsine / plaque suivie d'une neutralisation avec 10 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 2% de Fetal sérum bovin (FBS) et 1% de pénicilline / streptomycine / plaque.
- Transfert cellules en suspension dans un tube conique de 50 ml et centrifuger à ~ 130 g pendant 5 min, retirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de DMEM / FBS à 2% / 1% de pénicilline / streptomycine.
- Compter le nombre de cellules avec un compteur de cellules, puis faire une solution de cellules avec 10 5 cellules / ml, garder 150 suspension de cellules ml pour l'étape suivante. Planche 10 4 cellules (100 pi) dans chaque puits d'une plaque de culture cellulaire de 96 puits à l'aide d'un distributeur de liquide automatisé multipoint (désormais multipoint). La suspension cellulaire devrait être suffisante dans ce cas pour le placage 12 x plaques à 96 puits.
- Incuber les boîtes avec des cellules à 37 ° C dans un incubateur avec 5% de CO 2 lors de la préparation du mélange de transfection.
2. Préparation de la Construct Reporter Stock Solution
- Isoler journaliste de haute qualité construire ADN en utilisant des kits midiprep standard (NucleoBond Xtra Midi produite parClontech) et diluer l'ADN à une concentration finale de 1 mg / ml pour chaque reporter.
- Préparez 100 pi de construction rapporteur solution mère en combinant 30 ul de p53-FL, 30 pl de 8X TCF-RL, 30 pl de Elk1-Gal4, 6 pl UAS-CL et 4 ul de H 2 O pour obtenir un mélange d'ADN avec un ratio final 1:1:1:0.2 des journalistes. Concentration finale de l'ADN de cette solution mère de mélange d'ADN est de 0,3 mg / ml.
3. Préparation du siRNA / ADN transfection Mix
Dans cette partie du protocole, nous allons préparer siRNA / ADN mélanges de transfection qui sera suffisant pour la transfection 12 x 96 plaques à puits. Pour cette bibliothèque de test de 4 x 96 puits de siRNA, nous transfecter chaque pool de siRNA en trois exemplaires. Le réactif de transfection, nous allons utiliser est appelé Effectene (Qiagen). Dans nos mains c'est le seul réactif qui travaille pour la livraison simultanée de siRNA et de l'ADN dans des cellules cultivées.
- Diluer 80 pi de journaliste construction Stock solution dans 8 ml de tampon CE (Kit Effectene) pour obtenir une solution d'ADN avec une concentration finale de 3 pg / ml. En général, préparer suffisamment de mélange de solution d'ADN pour une utilisation immédiate.
- Plate 20 pi de cette solution d'ADN à chaque puits d'une 96 puits / plaque. Le nombre de plaques à 96 puits dépendra de combien de pools de siRNA seront testés. Par exemple, dans ce cas, nous aurons besoin de 4 x plaques à 96 puits pour évaluer 384 piscines de siRNA différents.
- Les siRNA à tester doivent être à une concentration du stock de 5 pm. Sinon, ils peuvent être réplique plaquée et dilué à cette concentration en utilisant le tampon de dilution recommandée associée à chaque bibliothèque.
- Transfert 2 pi de chaque stock de siRNA de 5 uM dans le puits correspondant de la plaque PCR contenant le stock d'ADN dilué avec un Biomek Automated Liquid Handler. Selon l'ampleur de l'étude, une pipette multi-canaux peut suffire.
- Maintenant, nous allons ajouter 1 l de solution Enhancer (kit Effectene) dans chaque puits de l'ADN / siRNA plate. Ce nouveau peut être réalisée soit avec un gestionnaire de liquide automatisé ou pipette multicanaux.
- Laisser la réaction Enhancer se produire à température ambiante pendant 5 min, puis ajouter 3 pi de réactif de transfection Effectene à chaque puits et incuber à température ambiante pendant 10 minutes supplémentaires.
- Pour arrêter la formation d'un complexe de transfection, ajouter 10 ul de DMEM / FBS à 2% / 1% de pénicilline / streptomycine dans chaque puits de la plaque PCR.
- Transférer 10 ul du mélange de transfection pour chaque puits de la plaque de 96 puits contenant les cellules (extrait de l'incubateur de cellules). Comme chaque transfection sera réalisée en trois exemplaires, le même mélange sera appliqué à deux plaques et 96 autres contenant des cellules.
- Incuber les cellules avec des mélanges de transfection ajoutés à 37 ° C dans un environnement humidifié avec 5% de CO2 pendant 36 heures.
4. Déterminer les activités luciférase dans des échantillons cellulaires
Après 36 h, les activités luciférase sont prêts pour la mesuredans des cellules transfectées. Le critère doit être déterminée sur une base par expérience. Dans notre étude, un temps d'incubation de 36 heures avait déjà donné un signal suffisamment robuste pour dire la détermination du résultat. Comme cette étude intègre plusieurs journalistes (un sécrété dans le milieu de culture, et deux autres exprimée dans le cytoplasme de la cellule), nous allons obtenir des mesures à la fois de milieu de culture ainsi que d'un lysat cellulaire.
- Détection de l'activité d'AC dans le milieu de culture:
- 20 pl de milieu de culture est une réplique en plaqué un opaque 96 puits blanc (soit en utilisant le Liquid Handler Biomek ou pipette multicanaux).
- Ajouter 20 ul de tampon de dosage CL (systèmes de ciblage) dans chaque puits.
- Ajouter 10 ul de Cypridina substrat luciférine (systèmes de ciblage) à chaque puits et détecter l'activité de CL en utilisant un luminomètre (le lecteur de plaque PHERAstar produit par BMG par exemple).
- Détection de Floride et de l'activité RL:
- Lyse le caunes en retirant d'abord le milieu de culture. Ceci peut être accompli rapidement en tournant la plaque à l'envers et en jetant moyen dans un évier. Moyenne restant peut être retiré en tapotant doucement la plaque vers le bas de la tête sur du papier absorbant. Ajouter 30 ul de 1X Passif tampon de lyse (Promega) dans chaque puits de cellules en utilisant le multipoint et le placer sur une bascule de plate-forme (Bellco est une société qui fabrique ces) fixer une vitesse moyenne pendant 5 min à la température ambiante.
- Ajouter 20 ul de réactif dosage de luciférase II (partie de la trousse de luciférase double Promega) en utilisant l'activité FL multipoint et mesurer immédiatement d'utiliser le luminomètre. Ensuite, ajoutez Stop & Glo réactif (Promega) qui va étancher l'activité FL et permettre la mesure de l'activité RL. Remarque: si vous utilisez des mélanges de substrats qui permettent durée de signal étendu (tels que des kits luciférase Dual-Glo de Promega), l'utilisation des kits flash nécessite une mesure rapide lors de l'addition de substrat (moins de 5 min).
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Representative Results
Malgré les progrès de la cartographie du paysage mutationnel de divers cancers à l'aide des efforts de séquençage du génome massives 12-14, nous n'avons pas encore mis en place une approche systématique pour la traduction de ces observations dans les stratégies d'intervention. Dans le cancer colorectal (CRC), les mutations qui sont prévus pour affecter les composants de trois processus cellulaires - Wnt / β-caténine, p53, et la signalisation Kras - se retrouvent dans 99% de toutes les tumeurs qui suggère qu'ils sont les principaux moteurs de la transformation cellulaire de l'intestin 13. Ainsi, les ensembles de données sur le génome du cancer sont probablement enrichis de gènes qui favorisent le cancer du dénominateur commun la promotion des processus, et qui pourraient être exploitées pour l'identification rapide des vulnérabilités de cellules cancéreuses. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons conçu des stratégies qui se prêtent à des interrogatoires à haut débit de la fonction des gènes à l'égard de Wnt / β-caténine, p53, et la signalisation Kras. Nous démontrons d'abord la spécificité de chaque système de journaliste dans reporte uniqueessais r (figure 1) et ensuite fournir la preuve que ces journalistes pourraient être utilisés ensemble pour des mesures simultanées de l'activité des gènes de ces trois processus cellulaires importants (Figure 2).
Figure 1. Dosages luciférase basés à haut débit pour la surveillance Wnt / β-caténine, p53 et Kras / Erk état de la voie dans les cellules de mammifères. La robustesse de trois plates-formes de dépistage différents ont été évalués individuellement avant de multiplexage avec des siRNA de contrôle visant les composants de la voie bien établies. Lignées cellulaires de cancer colorectal indiquées ont été transfectées avec le 8X TCF, PP53-TA-Luc, ou Elk-1 luciférase de luciole d'encodage journaliste construit avec des pools de siRNA ciblant β-caténine, p53, ou Kras, respectivement. Pathwagénotypes y pertinents pour chaque lignée cellulaire sont indiquées. La force de chaque plateforme de criblage a été évaluée par la reproductibilité de ces effets siRNA-induits sur la voie de transduction du signal pertinent. Les siRNA β-caténine n'ont aucun effet sur l'activité du rapporteur TCF 8X dans les cellules RKO contrairement à DLD-1 et cellules HCT-116 qui sont respectivement déficients en protéine suppresseur de la voie APC et expriment une forme activée de β-caténine. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Multiplexage journalistes basés luciférase pour l'analyse cellulaire à haut contenu de la fonction des gènes. A. Représentation schématique d'une stratégie pour la surveillance simultanée Wnt / β-cat enin, p53, et les activités de la voie Kras. FL = luciférase de luciole, RL = Renilla, CL = Cypridina luciférase (enzyme sécrétée). Activités FL et RL dans lysat sont déterminées en utilisant la luciférine et substrats coelentérazine. activité d'AC dans le milieu de culture est mesurée en utilisant oxyluciférine. * D'autres systèmes rapporteurs peuvent être incorporés dans ce protocole pour augmenter la teneur de chaque expérience. Par exemple, le dosage de la farine CytoTox peut être utilisé pour surveiller la toxicité cellulaire en échantillonnant les niveaux d'une protéase intracellulaire libérée dans le milieu de culture. L'ajout du réactif de dosage CytoTox n'influence pas l'activité du journaliste de CL. B. Identification des vulnérabilités spécifiques à certaines voies à l'aide de l'ARNi. La capacité du système luciférase multiplexé décrit dans "A" pour quantifier le dévouement du gène à la fonction cellulaire a été testé en utilisant les pools de siRNA indiqués.nk "> Cliquez ici pour agrandir la figure.
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Discussion
Il existe plusieurs fournisseurs de systèmes rapporteurs luciférase (telles que le Promega, systèmes de ciblage, New England Biolabs, et Thermo Fisher) qui fournissent des ressources en ligne utiles pour ceux divertir un écran à haut débit pour la première fois. En outre, un certain nombre d'excellentes critiques concernant l'optimisation de l'utilisation d'écrans à haut débit pour la découverte de gènes et comment l'ARNi basée sur les résultats du dépistage peuvent être intégrés aux bases de données d'autres-omiques à base devrait être utile 15,16. Méthodes de sélection des "hits" de écrans à haut débit font l'objet d'un autre débat qui dépasse le cadre de ce rapport. Plusieurs commentaires sur ce sujet sont disponibles 17,18. Cependant, un critère important pour la validation des résultats sélectionnés à partir des écrans basés sur l'utilisation de reporters transcription activés est la capacité pour le même perturbagène (ARNi ou chimiquement base) pour induire le même effet sur les gènes cibles validées, telle que mesurée par RT-PCR, qPCR, Ou l'analyse des microréseaux. De plus, gardez à l'esprit que l'ampleur de la réponse, mesurée par le journaliste est généralement plus élevé que l'induction d'une journaliste endogène étant donné qu'une caractéristique d'un journaliste succès synthétique est de fournir un signal fort. Enfin, un avantage de cette stratégie de co-transfection est la facilité avec laquelle on peut rapidement assembler des cocktails différents rapporteurs pour le suivi d'un ensemble souhaité des activités cellulaires. Bien que plus de main-d'œuvre, l'utilisation de lignées cellulaires de façon stable hébergeant les journalistes augmenterait probablement le rapport signal sur bruit étant donné la variabilité de la réponse est maintenant essentiellement limité à l'efficacité de la transfection de siARN seul.
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Disclosures
OK et LL sont des auteurs sur un brevet en instance relatives à la technologie multiplex luciférase.
Acknowledgments
Nous reconnaissons le soutien financier du CPRIT (RP100119) et la Fondation Welch (I-1665).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 | |
References
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