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Medicine

संवर्धित कोशिकाओं में कैंसर से जुड़े सिग्नल transduction पूछताछ के लिए एक multiplexed luciferase आधारित स्क्रीनिंग प्लेटफार्म

doi: 10.3791/50369 Published: July 3, 2013

Summary

सेलुलर प्रक्रियाओं के एक सिस्टम स्तर समझ हासिल आधुनिक दिन कोशिका जीव विज्ञान के एक लक्ष्य है. हम यहाँ विभिन्न सेलुलर समारोह के बहुसंकेतन luciferase पत्रकारों के लिए रणनीति का वर्णन अंत अंक जीनोम पैमाने आरएनएआई पुस्तकालयों का उपयोग जीन समारोह से पूछताछ की.

Abstract

शाही सेना हस्तक्षेप (आरएनएआई) का उपयोग जीन समारोह का जीनोम पैमाने पूछताछ रासायनिक विनयशील कैंसर सेल कमजोरियों की तेजी से पहचान के लिए जबरदस्त वादा है. इस तकनीक की क्षमता को सीमित तेजी प्ररूपी परिणामों की यंत्रवत आधार चित्रित करना और इस प्रकार molecularly लक्षित चिकित्सीय रणनीतियों के विकास को सूचित करने की अक्षमता है. हम कुंजी कैंसर सेल जुड़े प्रक्रियाओं की निगरानी की अनुमति है कि मल्टिप्लेक्स संवाददाता प्रणाली का उपयोग को लक्षित आरएनएआई की मध्यस्थता जीन से प्रेरित सेलुलर phenotypes deconstruct करने के लिए यहां के तरीकों की रूपरेखा. यह उच्च सामग्री स्क्रीनिंग पद्धति बहुमुखी है और आसानी से बड़ी आणविक पुस्तकालयों के अन्य प्रकार की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Introduction

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सेल जैविक प्रक्रियाओं की एक विविध सरणी की निगरानी के लिए luciferase आधारित पत्रकारों की एक किस्म व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं. इन डीएनए के बहुमत विशेष सेल उत्तेजनाओं या perturbations द्वारा व्यक्त करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं कि luciferase सांकेतिक शब्दों में प्रोटीन निर्माण करती है. सबसे मजबूत transcriptionally आधारित संवाददाताओं सिंथेटिक बढ़ाने तत्वों या जीन प्रमोटर क्षेत्रों एक physiologically प्रासंगिक ट्रांसक्रिप्शनल घटना 1,2 रिपोर्टिंग में उनकी विश्वसनीयता के लिए अच्छी तरह से स्थापित के नियंत्रण में एक luciferase एंजाइम की अभिव्यक्ति जगह है. Luciferase प्रोटीन अभिव्यक्ति ड्राइव GAL4-यूएएस उपयोग उस पार संवाददाता luciferase सिस्टम भी कर रहे हैं. Gal4 एक खमीर ट्रांसक्रिप्शनल उत्प्रेरक है और यूएएस Gal4 यह विशेष रूप से 3 की डाउन स्ट्रीम रखा जीन दृश्यों के प्रतिलेखन सक्रिय करने के लिए बांधता है, जो करने के लिए एक बढ़ाने है. Luciferase प्रणालियों के इन प्रकार के आम तौर पर दो डीएनए plasmids से समर्थन कर रहे हैं - एक regulato के लिए जुड़े हुए GAL4 प्रोटीन encodesry के हित के एक प्रोटीन का भाग है, और दूसरा एक या एक से अधिक यूएएस दृश्यों के नियंत्रण में रखा एक luciferase प्रोटीन encodes. इस प्रकार, सेलुलर luciferase संकेत ब्याज की प्रोटीन की गतिविधि के स्तर को दर्शाता है. Luciferase आधारित संवाददाताओं के एक अन्य आम उपयोग के लिए ब्याज की एक प्रोटीन एक luciferase एंजाइम 4 से जुड़े हुए है जिससे प्रोटीन स्थिरता की निगरानी के लिए है. एक अच्छी तरह से पूछताछ की गई है करने के लिए किसी भी पत्रकार की विशिष्टता नहीं मान सकते हैं के रूप में भले ही रिपोर्टर के प्रकार के, एक चेतावनी emptor यहाँ उल्लेख किया है. इस प्रकार, परिश्रम के कारण किसी भी अनुसंधान रणनीति में नया संवाददाता निर्माणों का समावेश जरूरी है.

luciferase एंजाइम पढ़ने के लिए बाहर का चयन अपनी अभिव्यक्ति को नियंत्रित कि डीएनए तत्वों की विश्वसनीयता के रूप में महत्वपूर्ण हो सकता है. जुगनू luciferase (FL) के व्यावसायिक रूप से उपलब्ध निर्माणों में सबसे अधिक इस्तेमाल किया एंजाइम है जबकि, (मामले में एटीपी की आवश्यकता नहीं है कि नए luciferase संवाददाता सिस्टम के आगमनFL आधारित प्रतिक्रियाओं के) या कि इस शोध मंच की दक्षता और विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए वादा मजबूत संकेत फेंकना कि अधिक स्थिर एंजाइमों शामिल. रासायनिक पढ़ाई में luciferase पत्रकारों के चयन के बारे में एक महत्वपूर्ण सूचना झूठी रिपोर्ट को जन्म दे सकता है कि रासायनिक अवरोध को FL की संवेदनशीलता है. हमारे अनुभव में, एक के रूप में सब्सट्रेट coelenterazine उपयोग कि ऐसे Renilla या Gaussia luciferase (क्रमश: आर एल और जीएल,) के रूप में अन्य एंजाइमों कम आसानी से छोटे अणुओं 5 से हिचकते हैं.

बहुसंकेतन luciferase पढ़ने के बहिष्कार के लिए सबसे आम स्वरूप काफी हद तक क्रमिक रूप से एक भी नमूना से enzymatic गतिविधियों को मापने की क्षमता के साथ आसान करने के लिए उपयोग किट की उपलब्धता को देखते हुए FL और आर एल के उपयोग की जरूरत पर जोर देता. सबसे किट में, नमूने पहले एक साथ एक secon उपज को coelenterazine साथ जमा किया जाता है कि एक शमन अभिकर्मक द्वारा पीछा FL गतिविधि के स्तर को प्रकट करने के लिए luciferin को उजागर कर रहे हैंdary आरएल संकेत. ऐसे जीएल या कि उपयोग ऐसे Cypridina luciferase (सीएल), luciferases का उपयोग करते हुए उच्च सामग्री डेटा उभरा है पैदा करने के लिए संभावनाओं की एक बड़ी संख्या के रूप में अभी तक एक सब्सट्रेट के रूप में स्रावित किया जा सकता है कि अन्य luciferases के अलावा के साथ. इस तकनीक का उपयोग कर एक जीनोम चौड़ा आरएनएआई स्क्रीन का एक उदाहरण यहां 6 पाया जा सकता है. इन तकनीकी विकास की बारी में है पार बात 7 को सीमित करने के क्रम में luciferase एंजाइम के प्रत्येक प्रकार बुझाने के लिए विशेष तंत्र के विकास को प्रेरित किया. हमारे हाथ में है, हम ऐसे जीएल या सीएल के रूप में स्रावित luciferases साथ, "बढ़त प्रभाव" (उच्च टिटर संस्कृति प्लेटों की बढ़त के साथ जुड़े सेलुलर गतिविधि में भरी प्रवृत्तियों) का अधिक से अधिक आवृत्ति ध्यान दें. वे सेल व्यवहार्यता adulterating बिना संकेत नमूना सक्षम के रूप में दूसरी ओर, इस तरह के स्रावित luciferases गतिज assays के लिए उपयोगी होते हैं.

यहाँ प्रस्तुत हमारे अध्ययन के लिए, हम एक साथ तीन कैंसर प्रासंगिक की गतिविधि की निगरानी करेंगेसेलुलर प्रक्रियाओं: p53, क्रास, और Wnt संकेत पारगमन मार्ग. ,, हमारे अध्ययन में शामिल पत्रकारों Clontech से pp53-टीए ल्यूक FL रिपोर्टर (अब p53-FL के संवाददाता के रूप में) 8, एक Elk1-GAL4/UAS-CL संवाददाता प्रणाली (Agilent के आगे से एल्क -1 पत्रकार हैं) और टी सेल कारकों (या TCFs), 9-11 के रूप में जाना जाता Wnt मार्ग transcriptional नियामकों द्वारा मान्यता प्राप्त कई सिंथेटिक बढ़ाने तत्वों को शामिल किया गया है कि 8X खरब घन फुट आरएल संवाददाता.

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Protocol

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पूरे प्रोटोकॉल लगभग 4 दिन लगते हैं.

1. SiRNA और रिपोर्टर अभिकर्मक के लिए कक्ष की तैयारी

हम यहाँ निदर्शी प्रयोजनों के लिए एक जीनोम चौड़ा siRNA के पुस्तकालय से siRNAs के एक छोटे से सेट (एक जीन को लक्षित 4x siRNAs के मिलकर प्रत्येक पूल से 96 प्रारूप में 384 अलग siRNA के पूल सरणी) का उपयोग कर siRNA के पुस्तकालयों से पूछताछ के लिए एक प्रोटोकॉल को लागू करेगा. इस विशेष अध्ययन के लिए, हम HCT116 deviant Wnt और क्रास संकेत दिखा रहे हैं कि कोशिकाओं, और p53 गतिविधि का फायदा उठाने देंगे. ब्याज की अन्य सेलुलर प्रक्रियाओं को पूछताछ के उद्देश्य से अध्ययन में उचित सेल लाइन की पहचान की है और एक समान फैशन में मूल्यांकन करना होगा.

  1. 2% फ़े युक्त Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 10 मिलीलीटर के साथ निराकरण के द्वारा पीछा trypsinization के समाधान / प्लेट के 1 मिलीलीटर का उपयोग कर trypsinization द्वारा पीबीएस तो फसल कोशिकाओं के साथ 80-90% मिला हुआ HCT116 कोशिकाओं के 5 x 10 सेमी 2 प्लेट धोताल गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन / प्लेट.
  2. DMEM / 2% FBS / 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के 10 मिलीलीटर में एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को निलंबित कोशिकाओं स्थानांतरण और 5 मिनट के लिए ~ 130 XG पर centrifugate, सतह पर तैरनेवाला निकालें, और फिर से निलंबित सेल गोली.
  3. एक सेल काउंटर के साथ सेल संख्या की गणना, और फिर 10 5 कोशिकाओं / एमएल के साथ एक सेल समाधान बनाने, अगले कदम के लिए 150 मिलीलीटर सेल निलंबन रखना. एक multidrop स्वचालित तरल औषधि (अब multidrop) का उपयोग करते हुए एक साथ 96 सेल संस्कृति की थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से थाली 10 4 कोशिकाओं (100 μl). सेल निलंबन चढ़ाना 12 एक्स 96 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए इस मामले में पर्याप्त होना चाहिए.
  4. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री एक इनक्यूबेटर में सी कोशिकाओं के साथ प्लेटें सेते अभिकर्मक मिश्रण तैयार करते समय.

2. रिपोर्टर कंस्ट्रक्शन स्टॉक समाधान की तैयारी

  1. पृथक उच्च गुणवत्ता संवाददाता मानक midiprep किट (NucleoBond एक्स्ट्रा मिडी उत्पादित द्वारा उपयोग डीएनए का निर्माणऔर Clontech) प्रत्येक रिपोर्टर के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए डीएनए पतला.
  2. संवाददाता p53-FL के 30 μl, 8X खरब घन फुट-आर एल, Elk1-Gal4 के 30 μl, 6 μl यूएएस सीएल और साथ एक डीएनए मिश्रण प्राप्त करने के लिए एच 2 ओ के 4 μl के 30 μl के संयोजन से शेयर समाधान के निर्माण के लिए 100 μl तैयार संवाददाताओं के अंतिम 1:1:1:0.2 अनुपात. इस डीएनए मिश्रण शेयर समाधान के अंतिम डीएनए एकाग्रता 0.3 मिग्रा / मिली है.

3. SiRNA के / डीएनए अभिकर्मक मिश्रण की तैयारी

प्रोटोकॉल के इस भाग में, हम 12 एक्स 96 अच्छी तरह प्लेटें transfecting के लिए पर्याप्त होगा कि siRNA / डीएनए अभिकर्मक मिश्रण तैयार करेंगे. SiRNAs की 4 एक्स 96 अच्छी तरह से थाली के इस परीक्षण पुस्तकालय के लिए, हम तीन प्रतियों में प्रत्येक siRNA के पूल transfect जाएगा. हम प्रयोग करेंगे अभिकर्मक अभिकर्मक Effectene (Qiagen) कहा जाता है. हमारे हाथ में इस संवर्धित कोशिकाओं में siRNA और डीएनए का एक साथ वितरण के लिए काम करता है कि केवल अभिकर्मक है.

  1. रिपोर्टर निर्माण स्टॉक प के 80 μl पतला3 ग्राम / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के साथ एक डीएनए समाधान प्राप्त करने के लिए चुनाव आयोग बफर (Effectene किट) के 8 मिलीलीटर में ution. सामान्य तौर पर, तत्काल उपयोग के लिए पर्याप्त डीएनए समाधान मिश्रण तैयार करते हैं.
  2. एक साथ 96 / थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से इस डीएनए समाधान की प्लेट 20 μl. 96 अच्छी तरह से प्लेटों की संख्या siRNA के पूल परीक्षण किया जाएगा कि कितने पर निर्भर करेगा. उदाहरण के लिए, इस मामले में हम 384 अलग siRNA के पूल का मूल्यांकन करने के लिए 4 एक्स 96 अच्छी तरह प्लेटें आवश्यकता होगी.
  3. परीक्षण किया जाना siRNAs के 5 माइक्रोन के एक शेयर एकाग्रता में होना चाहिए. यदि नहीं, तो वे प्रतिकृति चढ़ाया और प्रत्येक लायब्रेरी से संबद्ध सिफारिश कमजोर पड़ने बफर का उपयोग इस एकाग्रता को पतला हो सकता है.
  4. अच्छी तरह से एक Biomek स्वचालित तरल हैंडलर के साथ पतला डीएनए शेयर युक्त पीसीआर प्लेट की इसी को प्रत्येक 5 माइक्रोन siRNA के शेयर के 2 μl स्थानांतरण. अध्ययन के पैमाने पर निर्भर करता है, एक मल्टी चैनल pipettor का पर्याप्त हो सकता है.
  5. अब, हम डीएनए / siRNA को पीएलए के प्रत्येक अच्छी तरह से बढ़ाने समाधान (Effectene किट) के 1 μl जोड़ देगाते. यह फिर से एक स्वचालित तरल हैंडलर या मल्टीचैनल pipettor के साथ या तो पूरा किया जा सकता है.
  6. फिर एक अच्छी तरह से Effectene अभिकर्मक अभिकर्मक के 3 μl जोड़ने और एक अतिरिक्त 10 मिनट के लिए आरटी पर सेते बढ़ाने प्रतिक्रिया 5 मिनट के लिए आरटी पर घटित करने की अनुमति दें.
  7. अभिकर्मक जटिल गठन को रोकने के लिए, पीसीआर थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से 10 DMEM के μl / 2% FBS / 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें.
  8. कोशिकाओं (सेल इनक्यूबेटर से लिया गया) से युक्त 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से अभिकर्मक मिश्रण के 10 μl स्थानांतरण. प्रत्येक अभिकर्मक तीन प्रतियों में प्रदर्शन किया जाएगा के रूप में, एक ही मिश्रण कोशिकाओं से युक्त दो अतिरिक्त 96 अच्छी तरह से प्लेटों को लागू किया जाएगा.
  9. 36 घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ एक humidified वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर जोड़ा अभिकर्मक मिश्रण के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.

4. सेल नमूने से luciferase गतिविधियों का निर्धारण करें

36 घंटे के बाद, luciferase गतिविधियों माप के लिए तैयार हैंट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में. समापन बिंदु प्रति एक प्रयोग के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए. हमारे अध्ययन में, एक 36 घंटे ऊष्मायन समय पहले परिणाम दृढ़ संकल्प अर्थ के लिए एक पर्याप्त मजबूत संकेत मिले था. इस अध्ययन में कई पत्रकारों (सेल cytoplasm में व्यक्त की संस्कृति के माध्यम से, और दो अन्य लोगों में स्रावित एक) को शामिल किया गया के रूप में, हम दोनों संस्कृति के माध्यम के रूप में भी एक सेलुलर lysate से माप प्राप्त होगा.

  1. संस्कृति के माध्यम में सीएल गतिविधि की जांच:
    1. संस्कृति के माध्यम से 20 μl है प्रतिकृति चढ़ाया एक सफेद अपारदर्शी 96 अच्छी तरह से थाली (या तो Biomek तरल हैंडलर या multichannel pipettor का उपयोग) में.
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से सीएल परख बफर के 20 μl (सिस्टम लक्ष्य निर्धारण) जोड़ें.
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से Cypridina luciferin सब्सट्रेट (सिस्टम लक्ष्य निर्धारण) के 10 μl जोड़ें और एक luminometer (उदाहरण के लिए बीएमजी द्वारा उत्पादित Pherastar प्लेट रीडर) का उपयोग सीएल गतिविधि का पता लगाने.
  2. FL और आर एल गतिविधि की जांच:
    1. ग lyseपहला संस्कृति के माध्यम निकाल कर Ells. यह उल्टा थाली मोड़ और एक सिंक में मध्यम पटकना द्वारा तेजी से पूरा किया जा सकता है. शेष मध्यम धीरे कागज तौलिए पर उल्टा थाली दोहन से हटाया जा सकता है. एक मंच घुमाव पर multidrop और जगह का उपयोग कोशिकाओं की एक अच्छी तरह से 1X निष्क्रिय lysis बफर (Promega) का 30 μl जोड़ें आरटी पर 5 मिनट के लिए एक मध्यम गति सेट (Bellco इन करता है कि एक कंपनी है).
    2. Luminometer का उपयोग कर multidrop और तुरंत उपाय FL गतिविधि का उपयोग luciferase परख अभिकर्मक द्वितीय (Promega दोहरी luciferase किट का हिस्सा) के 20 μl जोड़ें. इसके बाद, जोड़ने और बंद करो FL गतिविधि बुझाना और आर एल गतिविधि की माप की अनुमति देगा कि ग्लो अभिकर्मक (Promega). नोट: यदि आप विस्तारित संकेत अवधि (जैसे Promega से दोहरे ग्लो luciferase किट के रूप में) की अनुमति है कि सब्सट्रेट घोला जा सकता है का उपयोग कर रहे हैं, जब तक कि फ्लैश किट के उपयोग सब्सट्रेट अलावा पर तेजी से माप (5 मिनट के भीतर) की आवश्यकता है.

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Representative Results

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भारी जीनोम अनुक्रमण प्रयासों 12-14 का उपयोग कर विभिन्न तरह के कैंसर के उत्परिवर्तनीय परिदृश्य मानचित्रण में प्रगति के बावजूद, हम अभी भी जगह में हस्तक्षेप रणनीतियों में इन टिप्पणियों के अनुवाद के लिए एक व्यवस्थित दृष्टिकोण नहीं है. / Wnt β-catenin, p53, और क्रास संकेत - - कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी), तीन सेलुलर प्रक्रियाओं के घटकों को प्रभावित करने के लिए भविष्यवाणी कर रहे हैं कि म्यूटेशन में वे आंत में सेलुलर परिवर्तन के प्रमुख ड्राइवर हैं सुझाव सभी ट्यूमर के 99% में पाए जाते हैं 13. इस प्रकार, कैंसर जीनोम डेटासेट संभावना प्रक्रियाओं को बढ़ावा देने के आम भाजक कैंसर का समर्थन करने वाले जीनों के लिए समृद्ध है, और है कि कैंसर सेल कमजोरियों की तेजी से पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता. इस परिकल्पना की जांच करने के लिए, हम / Wnt β-catenin, p53, और क्रास संकेत के संबंध में जीन समारोह के उच्च throughput पूछताछ करने के लिए उत्तरदायी रणनीतियों तैयार कर लिया है. हम पहले ही reporte में प्रत्येक रिपोर्टर प्रणाली की विशिष्टता का प्रदर्शनआर परीक्षण (चित्रा 1) और फिर इन पत्रकारों को इन तीन महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं (चित्रा 2) के जीन गतिविधि का एक साथ मापन के लिए एक साथ इस्तेमाल किया जा सकता है कि सबूत प्रदान करते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1. / Wnt β-catenin, p53 और स्तनधारी कोशिकाओं में क्रास / ERK मार्ग की स्थिति की निगरानी के लिए उच्च throughput luciferase आधारित assays. तीन अलग स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों की मजबूती के लिए व्यक्तिगत रूप से पहले अच्छी तरह से स्थापित मार्ग घटकों को लक्षित बहुसंकेतन का उपयोग करते हुए नियंत्रण siRNAs के लिए मूल्यांकन किया गया. संकेत कोलोरेक्टल कैंसर कोशिका लाइनों 8X खरब घन फुट, pp53-टीए ल्यूक, या एल्क -1 जुगनू luciferase एन्कोडिंग संवाददाता क्रमशः β-catenin, p53, या क्रास, लक्षित कर siRNAs की ताल के साथ निर्माण करती है. साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे Pathwaप्रत्येक कोशिका लाइन के लिए y-प्रासंगिक जीनोटाइप संकेत कर रहे हैं. प्रत्येक स्क्रीनिंग मंच की ताकत प्रासंगिक संकेत पारगमन मार्ग पर इन siRNAs प्रेरित प्रभाव के reproducibility द्वारा मूल्यांकन किया गया था. β-catenin siRNAs के DLD -1 और एपीसी मार्ग शमन प्रोटीन में क्रमश: कमी कर रहे हैं और β-catenin के एक सक्रिय रूप है कि एक्सप्रेस HCT-116 कोशिकाओं के विपरीत RKO के कक्षों में 8X खरब घन फुट संवाददाता गतिविधि पर कोई प्रभाव नहीं है. यहां क्लिक करें बड़ा आंकड़ा देखने .

चित्रा 2
चित्रा 2. जीन समारोह के उच्च सामग्री सेलुलर विश्लेषण के लिए luciferase आधारित संवाददाताओं बहुसंकेतन. एक साथ Wnt / β-बिल्ली की निगरानी के लिए एक रणनीति के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ENIN, p53, और क्रास मार्ग गतिविधियों. FL = जुगनू luciferase, आर एल = Renilla luciferase, सीएल = Cypridina luciferase (secreted एंजाइम). Lysate में FL और आर एल गतिविधियों luciferin और coelenterazine substrates का उपयोग निर्धारित कर रहे हैं. संस्कृति के माध्यम में सीएल गतिविधि oxyluciferin का उपयोग कर मापा जाता है. * अन्य रिपोर्टर सिस्टम एक प्रयोग की सामग्री को बढ़ाने के लिए इस प्रोटोकॉल में शामिल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, CytoTox आटा परख संस्कृति के माध्यम में जारी एक intracellular प्रोटीज के स्तर नमूना द्वारा सेलुलर विषाक्तता की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. CytoTox परख अभिकर्मक के अलावा सीएल रिपोर्टर की गतिविधि को प्रभावित नहीं करता है. आरएनएआई का उपयोग कर मार्ग विशिष्ट कमजोरियों के बी पहचान. सेलुलर समारोह के लिए जीन समर्पण यों तो 'ए' में वर्णित मल्टिप्लेक्स luciferase प्रणाली की क्षमता संकेत siRNA के पूल का उपयोग कर परीक्षण किया गया था.नायक "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

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पहली बार के लिए एक उच्च throughput स्क्रीन मनोरंजक उन लोगों के लिए उपयोगी ऑन लाइन संसाधन उपलब्ध कराने कि luciferase आधारित रिपोर्टर सिस्टम के कई पैरोकार (जैसे Promega के रूप में, लक्ष्य निर्धारण प्रणाली, न्यू इंग्लैंड Biolabs, और थर्मो फिशर) कर रहे हैं. इसके अलावा, जीन की खोज और कैसे आरएनएआई आधारित स्क्रीनिंग के परिणाम अन्य omics आधारित डेटासेट के साथ एकीकृत किया जा सकता है के लिए उच्च throughput स्क्रीन के उपयोग का अनुकूलन के बारे में उत्कृष्ट समीक्षा की संख्या मददगार 15,16 होना चाहिए. उच्च throughput स्क्रीन से 'हिट' के चयन के लिए तरीके इस रिपोर्ट के दायरे से परे है कि एक और चर्चा का विषय हैं. इस विषय पर कई समीक्षा 17,18 उपलब्ध हैं. हालांकि, transcriptionally सक्रिय पत्रकारों के उपयोग पर आधारित स्क्रीन से चयनित हिट मान्य करने के लिए एक महत्वपूर्ण कसौटी के रूप में मापा RT-पीसीआर, qPCR का उपयोग कर पुष्टि लक्ष्य जीन पर ही प्रभाव उत्पन्न करने के लिए एक ही perturbagen (आरएनएआई या रासायनिक आधारित) के लिए क्षमता है, या माइक्रोएरे विश्लेषण. इसके अलावा, संवाददाता द्वारा मापा के रूप में प्रतिक्रिया की भयावहता को आम तौर पर एक सफलतापूर्वक सिंथेटिक रिपोर्टर की एक विशेषता यह एक मजबूत संकेत प्रदान करना है, यह देखते हुए कि एक अंतर्जात संवाददाता के शामिल होने की तुलना में अधिक है कि मन में रखो. अंत में, इस सह अभिकर्मक रणनीति का एक लाभ यह है कि एक तेजी से सेलुलर गतिविधियों का एक वांछित सेट की निगरानी के लिए अलग संवाददाता कॉकटेल इकट्ठा कर सकते हैं, जिसके साथ कम है. अधिक श्रम गहन हालांकि, स्थिरतापूर्वक संवाददाताओं शरण सेल लाइनों का उपयोग होने की संभावना प्रतिक्रिया की परिवर्तनशीलता दिया शोर अनुपात करने के लिए संकेत में वृद्धि होगी अब अकेले siRNA अभिकर्मक दक्षता के लिए मुख्य रूप से सीमित है.

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Disclosures

ठीक है और डालूँगा luciferase प्रौद्योगिकी मल्टिप्लेक्स से संबंधित एक लंबित पेटेंट पर लेखक हैं.

Acknowledgments

हम CPRIT (RP100119) और वेल्श फाउंडेशन (मैं-1665) से अनुदान सहायता को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
PathDetect Elk1 Trans-Reporting System Agilent Technologies Inc. 219005
Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector Clontech Lab Inc. 631914
Effectene Transfection Reagent Qiagen Inc. 301427
Dual-Luciferase Reporter Assay System Promega Corp. E1960
Cypridina Luciferase Assay reagent Targeting Systems VLAR-1
HCT116 cells ATCC CCL-247
CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay Promega Corp. G9260
EQUIPMENT
MultiFlo Microplate Dispenser Labsystems Inc. Model 832
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation Beckman Coulter Inc. A31842
PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader BMG Labtech Inc. 0471-101A
Bright-Line Reichert Hemacytometers Hausser Scientific Company 1490

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References

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संवर्धित कोशिकाओं में कैंसर से जुड़े सिग्नल transduction पूछताछ के लिए एक multiplexed luciferase आधारित स्क्रीनिंग प्लेटफार्म
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Cite this Article

Kulak, O., Lum, L. A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (77), e50369, doi:10.3791/50369 (2013).More

Kulak, O., Lum, L. A Multiplexed Luciferase-based Screening Platform for Interrogating Cancer-associated Signal Transduction in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (77), e50369, doi:10.3791/50369 (2013).

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