Summary
세포 프로세스의 시스템 수준의 이해를 달성하는 것은 현대 세포 생물학의 목표입니다. 우리는 여기에서 다양한 세포 기능의 다중 루시 페라 제 기자에 대한 전략을 설명하는 엔드 포인트 게놈 규모의 RNAi 라이브러리를 사용하여 유전자 기능을 심문.
Abstract
RNA 간섭 (RNAi의)를 사용하여 유전자 기능의 게놈 규모의 심문은 화학적으로 취급하기 쉬운 암 세포 취약점의 신속한 식별을위한 엄청난 약속을 보유하고 있습니다. 이 기술의 잠재력을 제한하면 신속하게 표현형 결과의 기계론의 기초를 묘사함으로써 분자 표적 치료 전략의 개발을 알리는 무능력이다. 우리는 주요 암 세포 관련 프로세스를 모니터링 할 수 있도록 다중 기자 시스템을 사용하여 대상 RNAi를 매개 유전자에 의한 세포의 표현형을 해체하기 위해 여기 방법을 설명합니다. 이 높은 콘텐츠 심사 방법은 다재다능하고 쉽게 큰 분자 라이브러리의 다른 종류의 검사를 위해 적용 할 수 있습니다.
Introduction
세포 생물 학적 과정의 다양한 배열을 모니터링 루시퍼 기반 기자의 다양한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 DNA의 대부분은 특정 세포 자극이나 교란에 의해 표현하는 유도 루시퍼 단백질을 인코딩 구성합니다. 가장 강력한 transcriptionally 기반 기자 합성 증강 요소 또는 유전자의 프로모터 영역 생리학 관련 전사 이벤트 1,2를보고 자신의 신뢰성을 잘 확립의 제어하에 루시 페라 제 효소의 발현을 배치합니다. 루시 페라 제 단백질 발현을 유도하는 GAL4-UAS를 활용 횡단 기자 루시퍼 시스템도 있습니다. GAL4는 효모 전사 활성과 UAS는 GAL4은 특별히 3의 하류에 배치 유전자 서열의 전사를 활성화하기 위해 바인딩을 증강이다. 루시퍼 시스템의 이러한 유형은 일반적으로 두 개의 DNA 플라스미드에 의해 지원됩니다 - 하나는 조절기와 융합 GAL4 단백질을 인코딩스피 관심의 단백질의 부분, 두 번째는 하나 이상의 UAS 시퀀스의 제어 아래에 배치 루시 페라 제 단백질을 인코딩합니다. 따라서, 세포 루시 페라 제 신호가 관심의 단백질의 활동 수준을 반영합니다. 루시 페라 기반 기자의 또 다른 일반적인 사용은 그 단백질 루시 페라 제 효소 4 융합 그것에 의하여 단백질의 안정성을 모니터링합니다. 하나의 잘 심문 한 어떤 기자의 특이성을지지 않습니다 수에 관계없이 기자의 종류,주의 위험 부담이 여기에 기록됩니다. 따라서, 실사가 어떤 연구 전략의 새로운 리포터 구조의 결합이 필요합니다.
루시 페라 제 효소 읽기 중 선택의 발현을 제어하는 DNA 요소의 신뢰성만큼 중요 할 수 있습니다. 반딧불 루시 페라 제 (FL)에 시판 구조에서 가장 일반적으로 사용되는 효소 반면, (경우와 같이 ATP를 필요로하지 않는 새로운 루시 페라 제 리포터 시스템의 출현FL-기반 반응) 또는 그이 연구 플랫폼의 효율성과 안정성을 개선 할 것을 약속 강한 신호를 방출 안정 효소를 통합합니다. 화학 연구에서 루시 페라 제 기자의 선택에 관한 중요 사항을 거짓보고에 상승을 줄 수있는 화학 물질 억제 FL의 감수성이다. 우리의 경험에서, 기판으로 coelenterazine 활용 등 Renilla의 또는 Gaussia 루시 페라 제 (각각 RL 및 GL) 등의 효소가 덜 쉽게 작은 분자 5에 의해 억제합니다.
다중 루시 페라 읽기 아웃에 대한 가장 일반적인 형식은 주로 순차적으로 하나의 샘플에서 효소 활동을 측정 할 수있는 기능을 사용하기 쉬운 키트의 가용성을 부여 FL과 RL의 사용을 수반한다. 대부분의 키트에 샘플을 먼저 동시에 secon를 산출하기 coelenterazine에 기탁되어 담금질 시약 다음 FL 활동의 수준을 나타 내기 위해 루시페린에 노출되는dary RL 신호. 이러한 GL하거나 사용하는 등 Cypridina 루시 페라 제 (CL), luciferases를 사용하여 높은 콘텐츠 데이터를 등장 생성을위한 가능성의 큰 번호와 같은 또 다른 기질로 분비 될 수있는 다른 luciferases의 추가와 함께. 이 기술을 사용하여 게놈 전체의 RNAi 화면의 예는 다음 6 찾을 수 있습니다. 이러한 기술적 진보는 차례가 크로스 토크 7을 제한하기 위해 루시 페라 제 효소의 각 유형을 냉각하는 특정 메커니즘의 개발에 박차를 가했다. 우리 손에, 우리는 GL 또는 CL 등의 분비 luciferases와 "가장자리 효과"(높은 역가 문화 접시의 가장자리와 관련된 세포 활동의 설명 할 수없는 경향)의 큰 주파수를 확인합니다. 그들은 세포 생존을 adulterating없이 신호 샘플링을 가능으로, 다른 한편으로는, 이러한 분비 luciferases은 운동 분석에 유용합니다.
여기에 제시된 연구를 위해, 우리는 동시에 세 개의 암 관련의 활동을 모니터링 할세포 과정 : p53의, 크라스, 그리고 Wnt의 신호 전달 경로. ,, 우리의 연구에 통합 기자 Clontech 사에서 pp53-TA-뤽 FL 기자 (이제부터는 p53의-FL 기자라고도 함) 8 Elk1-GAL4/UAS-CL 기자 시스템 (애질런트 이제부터는 엘크-1 기자)입니다 와 T-세포 인자 (또는 TCFS) 9-11로 알려진 Wnt의 경로 전사 규제에 의해 인식 여러 합성 증강 요소를 통합 8X TCF RL 기자.
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Protocol
전체 프로토콜은 약 사일 소요됩니다.
1. siRNA를 및 기자 형질에 대한 세포의 준비
우리는 여기에서 설명을위한 게놈 전체의 siRNA 라이브러리에서 siRNAs에의 작은 집합 (하나의 유전자를 대상으로 배 siRNAs에 구성된 각 풀에 96도 형식으로 384 가지의 siRNA 풀 배열)을 사용하여 siRNA의 라이브러리를 심문하기위한 프로토콜을 소개합니다. 이 특정 연구를 위해, 우리는 HCT116 비정상적인 Wnt의와 크라스 신호를 전시 세포와 p53의 활동을 이용합니다. 관심의 다른 세포 프로세스를 심문을 목표로 연구에 적절한 셀 라인은 식별 유사한 방식으로 평가해야합니다.
- 2 % 철을 함유 Dulbecco의 수정 이글 배지 (DMEM) 10 mL로 중화 한 다음 트립신 솔루션 / 판 1 ㎖를 사용하여 트립신에 의해 PBS 다음 수확 세포와 80 % ~ 90 % 합류 HCT116 세포 5 × 10cm 2 판을 씻어탈 소 혈청 (FBS), 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 판.
- DMEM / 2 % FBS / 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 10 ㎖에 50 ML 원뿔 튜브에 정지 세포를 전송하고 5 분 ~ 130 XG에서 centrifugate, 상층 액을 제거하고 다시 중단 세포 펠렛.
- 셀 카운터와 세포 수를 계산 한 다음, 10 5 세포 / ml의 세포 솔루션을 만들어 다음 단계를위한 150 ML의 세포 현탁액을 유지합니다. 멀티 드롭 자동화 된 액체 디스펜서 (이제부터는 멀티 드롭)를 사용하여 96도 세포 배양 플레이트의 각 우물 판 (10) 4 셀 (100 μL). 세포 현탁액은 도금 12 × 96 웰 플레이트이 경우 충분합니다.
- 5 % CO 2와 37 ° 인큐베이터에서 C에서 세포와 번호판을 품어의 transfection 혼합물을 준비하는 동안.
2. 기자 구문 재고 솔루션을 준비
- 분리 고품질 기자는 표준 midiprep 키트 (NucleoBond 엑스트라 미디가 제작하여 사용하여 DNA를 구성그리고 Clontech 사)는 각 기자 1 MG / ML의 최종 농도로 DNA를 희석.
- 기자는 p53의-FL 30 μL, 8X TCF-RL, Elk1-GAL4의 30 μL, 10 μL UAS-CL과 함께 DNA의 혼합을 달성하기 위해 H 2 O 4 μL의 30 μL를 결합하여 주식 솔루션을 구축의 100 μl를 준비 기자의 최종 1:1:1:0.2 비율입니다. 이 DNA 혼합 원액의 최종 DNA 농도는 0.3 ㎎ / ML입니다.
3. siRNA를 / DNA 형질 믹스를 준비
프로토콜의이 부분에서, 우리는 12 × 96 잘 접시를 형질에 대한 충분합니다 siRNA의 / DNA 형질 믹스를 준비합니다. siRNAs는 4 X 96 웰 플레이트의이 테스트 라이브러리, 우리는 세중의 각 siRNA의 풀을 형질 것입니다. 우리가 사용하는 형질 시약 Effectene (Qiagen의)이라고합니다. 우리의 손이 배양 세포에의 siRNA 및 DNA의 동시 배달을 위해 작동하는 전용 시약이다.
- 기자 구조 주식 졸의 80 μl를 희석3 μg / ML의 최종 농도로 DNA 솔루션을 달성하기 위해 EC 버퍼 (Effectene 키트)의 8 ML의 ution. 일반적으로, 즉시 사용을위한 충분한 DNA 솔루션 믹스를 준비합니다.
- 96도 / 플레이트의 각 웰이 DNA 솔루션의 플레이트 (20) μL. 96 잘 플레이트의 수는 siRNA의 풀 테스트 할 얼마나 많은에 따라 달라집니다. 예를 들어,이 경우에 우리는 384 다른 siRNA의 풀을 평가하는 4 × 96 웰 플레이트가 필요합니다.
- 테스트 할 siRNAs는 5 μM의 주식 농도에 있어야합니다. 하지 않으면, 그들은 복제가 도금 및 각 라이브러리와 연관된 권장 희석 버퍼를 사용하여이 농도로 희석 할 수 있습니다.
- 잘 Biomek 자동 액체 처리기와 희석 DNA 주식을 포함하는 PCR 플레이트의 해당 각 5 μm의 siRNA의 주식의 2 μl를 전송합니다. 연구의 규모에 따라 멀티 채널 피펫은 충분합니다.
- 이제, 우리는 DNA / siRNA의 PLA의 각 웰에 증강 용액 (Effectene 키트) 1 μl를 추가합니다테. 이것은 다시 자동 액체 핸들러 또는 멀티 채널 피펫으로도 수행 할 수 있습니다.
- 각 well에 Effectene 형질 시약의 3 μl를 추가하고 추가로 10 분 동안 RT에서 품어 증강 반응이 5 분 RT에서 발생 할 수 있습니다.
- 형질 복잡한 형성을 중지하려면, PCR 플레이트의 각 웰에 10 ㎕의 DMEM / 2 % FBS / 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 추가합니다.
- 세포 (세포 배양기에서 검색)을 포함하는 96 잘 플레이트의 각 웰에 형질 믹스의 10 μl를 전송합니다. 각 형질은 세중의에서 수행되므로, 동일한 믹스 세포를 포함하는 두 개의 추가 96 잘 접시에 적용됩니다.
- 36 시간 동안 5 % CO 2 가습 환경에서 37 ° C에 추가 형질 혼합물로 세포를 품어.
4. 세포 샘플에서 루시 페라 제 활동을 결정
36 시간 후, 루시퍼 활동 측정을위한 준비형질 세포합니다. 엔드 포인트 당 실험 방식에 의해 결정해야한다. 본 연구에서는 36 시간의 배양 시간 이전 결과 결정 의미를 충분히 강력한 신호를 굴복했다. 이 연구는 여러 기자 (세포 세포질에서 발현 배지, 두 사람으로 분비 한) 통합으로, 우리는 모두 배양 배지뿐만 아니라 세포 파쇄물에서 측정 값을 얻을 것이다.
- 문화 매체 CL 활동의 탐지 :
- 배양액 20 μL은 복제 도금 흰색 불투명 96 웰 플레이트 (중 Biomek 액체 처리기 또는 멀티 채널 피펫을 사용)합니다.
- 각 well에 CL 분석 버퍼 20 μl를 (시스템 대상)를 추가합니다.
- 각 well에 Cypridina 루시페린 기판 (시스템 대상)의 10 μl를 추가하고 luminometer (예를 들어 BMG에 의해 생성 된 Pherastar 플레이트 리더)를 사용하여 CL 활동을 감지합니다.
- FL 및 RL 활동 감지 :
- C를 용해먼저 문화 매체를 제거하여 ELL 학생. 이것은 거꾸로 판을 켜고 싱크 매체를 던지기에 의해 신속하게 수행 할 수 있습니다. 나머지 매체는 부드럽게 종이 타월에 거꾸로 판을 눌러 제거 할 수 있습니다. 플랫폼 로커에 멀티 드롭과 장소를 사용하여 세포의 각 웰에 1X 수동 용해 버퍼 (Promega 사)의 30 μl를 추가 RT에서 5 분 중간 속도를 설정합니다 (Bellco이가 만드는 한 회사입니다.)
- luminometer를 사용하여 멀티 드롭 즉시 측정 FL 활동을 사용 루시 페라 제 분석 시약 II (프로 메가 듀얼 루시 페라 키트의 일부)의 20 μl를 추가합니다. 다음으로, 추가 및 중지 FL 활동을 담금질하고 RL 활동의 측정을 허용합니다 저런 형광 시약 (Promega 사). 참고 : 확장 된 신호 지속 시간 (예 : 프로 메가에서 이중 글로 루시 페라 키트 등)을 허용 기판 믹스를 사용하지 않는 플래시 키트의 사용은 기판뿐만 아니라시 신속한 측정 (5 분 이내)이 필요합니다.
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Representative Results
대규모 게놈 시퀀싱 노력 12-14를 사용하여 다양한 암의 돌연변이 풍경을 매핑의 발전에도 불구하고, 우리는 여전히 그 자리에 개입 전략에 이러한 관측을 번역하기위한 체계적인 접근 방법을 가지고 있지 않습니다. / Wnt는 β-catenin 신호, p53의, 그리고 크라스 신호 - - 대장 암 (CRC), 세 가지 세포 프로세스의 구성 요소에 영향을 미칠 것으로 예상되는 돌연변이들은 창자의 세포 변화의 주요 드라이버입니다 제안 모든 종양의 99 %에서 발견된다 13. 따라서, 암 게놈 데이터 집합 가능성이 과정을 촉진 공통 분모 암을 지원하는 유전자 충실하고는 암 세포 취약점의 신속한 식별을 위해 악용 될 수 있습니다. 이 가설을 조사하기 위해, 우리는 / Wnt의 β-catenin 신호, p53의, 그리고 크라스 신호와 관련된 유전자 기능의 높은 처리량 심문 의무 전략을 고안했습니다. 우리는 첫 번째 싱글 reporte 각 기자 시스템의 특이성을 보여R 테스트 (그림 1) 그리고이 기자는 이러한 세 가지 중요한 세포 과정 (그림 2)의 유전자 활동의 동시 측정을 위해 함께 사용될 수 있다는 증거를 제공합니다.
그림 1. / Wnt는 β-catenin 신호, p53의와 포유 동물 세포에있는 크라스 / Erk의 경로 상태를 모니터링하기위한 높은 처리량 루시퍼 기반의 분석은. 세 가지 선별 플랫폼의 견고성은 개별적으로 사전에 잘 확립 된 경로 구성 요소를 대상으로 다중화하여 제어 siRNAs에로 평가 하였다. 표시된 대장 암 세포주 8X TCF, pp53-TA-뤽 또는 엘크-1 반딧불 루시 페라 인코딩 기자는 각각 β-catenin 신호, p53의, 또는 크라스를 대상으로 siRNAs에의 풀과 함께 구성합니다. 형질 전환 하였다 Pathwa각 세포주에 대한 Y 관련 유전자형이 표시됩니다. 각 심사 플랫폼의 강도는 관련 신호 전달 경로에이 siRNAs에 의한 효과의 재현성에 의해 평가되었다. β-catenin의 siRNAs는이 DLD-1 APC 통로 억제 단백질이 각각 부족하고 β-catenin의의 활성화 형태를 표현 HCT-116 세포에 대비 RKO 세포에서 8X TCF 기자 활동에 영향을주지 않습니다. 하려면 여기를 클릭하십시오 큰 그림을 보려면 .
그림 2. 유전자 기능의 높은 콘텐츠 세포 분석을위한 루시퍼 기반 기자 멀티플렉싱. 동시에 Wnt는 / β-고양이를 모니터링하기위한 전략 A. 도식 표현 enin, p53의, 그리고 크라스 통로 활동. FL = 반딧불 루시 페라 제, RL = Renilla의 루시 페라 제, CL = Cypridina 루시 페라 제 (분비 효소). 해물 플로리다와 RL 활동은 루시페린과 coelenterazine 기판을 사용하여 결정됩니다. 문화 매체 CL 활동은 oxyluciferin을 사용하여 측정하고 있습니다. * 다른 기자 시스템은 각 실험의 함량을 증가하기 위해이 프로토콜에 통합 할 수 있습니다. 예를 들어, CytoTox 밀가루 분석은 문화 매체에 발표 세포 내 단백질 분해 효소의 수준을 샘플링하여 세포 독성을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. CytoTox 분석 시약의 추가 CL 기자의 활동에 영향을주지 않습니다. RNAi를 사용하여 경로 별 취약점 B. 식별합니다. 세포 기능에 유전자 헌신을 계량하는 "A"에 설명 된대로 다중 루시 페라 제 시스템의 기능은 표시된 siRNA를 풀을 사용하여 테스트 하였다.NK "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
처음으로 높은 처리량 화면을 접대하는 데 유용에 대한 온라인 리소스를 제공 루시퍼 기반 기자 시스템의 여러 조달업자 (예 : Promega 사 등, 대상 시스템, 뉴 잉글랜드 Biolabs가, 그리고 써모 피셔)가 있습니다. 또한, 유전자 발견 방법 및 RNAi의 기반 검사 결과는 다른 - 오 믹스 기반 데이터 셋과 통합 될 수 높은 처리량 스크린의 사용을 최적화에 대한 훌륭한 리뷰의 숫자는 도움 15,16해야합니다. 높은 처리량 화면에서 "히트"의 선택 방법은 본 보고서의 범위를 넘어서는 또 다른 토론의 주제입니다. 이 주제에 대한 몇 가지의 리뷰 17,18 사용할 수 있습니다. 그러나 transcriptionally 활성화 기자의 사용에 따라 화면에서 선택한 안타를 검증하는 중요한 기준은 측정 된 RT-PCR, qPCR에 사용하여 검증 표적 유전자에 동일한 효과를 유도하는 동일한 perturbagen (RNAi의 또는 화학적 기반)를위한 기능입니다또는 마이크로 어레이 분석. 또한, 기자에 의해 측정 된 응답의 크기는 일반적으로 성공적으로 합성 기자의 기능은 강력한 신호를 제공하는 것입니다 주어진 내생 기자의 유도보다 높은 것을 명심하십시오. 마지막으로,이 공동 형질 전략의 장점 하나는 빠르게 세포 활동의 원하는 집합을 모니터링하기 위해 다른 기자 칵테일을 조립할 수있는 용이성이다. 더 많은 노동 집약적이지만, 안정적으로 기자를 숨겨 세포 라인의 사용 가능성이 반응의 다양성 주어진 잡음 비율로 신호를 증가시킬 것입니다 지금 혼자의 siRNA의 transfection 효율을 주로 제한됩니다.
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Disclosures
OK와 LL는 루시 페라 기술을 다중화와 관련된 특허 출원에 저자입니다.
Acknowledgments
우리는 CPRIT (RP100119) 및 웰치 재단 (I-1665)의 자금 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| PathDetect Elk1 Trans-Reporting System | Agilent Technologies Inc. | 219005 | |
| Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector | Clontech Lab Inc. | 631914 | |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen Inc. | 301427 | |
| Dual-Luciferase Reporter Assay System | Promega Corp. | E1960 | |
| Cypridina Luciferase Assay reagent | Targeting Systems | VLAR-1 | |
| HCT116 cells | ATCC | CCL-247 | |
| CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay | Promega Corp. | G9260 | |
| EQUIPMENT | |||
| MultiFlo Microplate Dispenser | Labsystems Inc. | Model 832 | |
| Biomek FXP Laboratory Automation Workstation | Beckman Coulter Inc. | A31842 | |
| PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader | BMG Labtech Inc. | 0471-101A | |
| Bright-Line Reichert Hemacytometers | Hausser Scientific Company | 1490 | |
References
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