En Multiplexed Luciferase-basert screening plattform for avhør kreft-assosiert Signal Transduksjon i dyrkede celler

Summary

Oppnå et system nivå forståelse av cellulære prosesser er et mål for dagens cellebiologi. Vi beskriver her strategier for multipleksing luciferase reportere i ulike cellular funksjon endepunkter å avhøre gen-funksjon ved hjelp av genom-skala RNAi biblioteker.

Abstract

Genom-skala avhør av gen-funksjon ved hjelp av RNA interferens (RNAi) har enorm løftet for rask identifisering av kjemisk medgjørlig kreftcelle sårbarheter. Begrenser potensialet i denne teknologien er manglende evne til raskt å avgrense det mekanistiske grunnlaget for fenotypiske utfall og dermed informere utviklingen av molekylært målrettede terapeutiske strategier. Vi skissere her metoder for å dekonstruere cellulære fenotyper indusert av RNAi-mediert gene targeting bruker multipleksede reporter systemer som tillater overvåking av nøkkelen kreftcelle-tilknyttede prosesser. Dette høye innhold screening-metoden er fleksibel og kan lett tilpasses for screening av andre typer store molekylære bibliotek.

Introduction

En rekke luciferase-baserte journalister for å overvåke et variert utvalg av cellebiologiske prosesser er kommersielt tilgjengelig. De fleste av disse DNA konstruerer kode luciferase proteiner som er overtalt til å uttrykke av bestemte celle stimuli eller forstyrrelsene. Den mest robuste transcriptionally baserte journalister plasserer uttrykk for en luciferase enzymet under kontroll av syntetiske enhancer elementer eller genpromotoren regioner veletablerte for sin pålitelighet i rapporteringen en fysiologisk relevant transkripsjonell hendelsen ^1,2. Det er også trans-reporter luciferase systemer som bruker Gal4-UAS å kjøre luciferase protein uttrykk. Gal4 er en gjær-transkripsjons-aktivator, og UAS er en enhancer som Gal4 spesifikt bindes å aktivere transkripsjon av gensekvenser plassert nedstrøms av den ^tre. Disse typer luciferase systemer er vanligvis støttet av to DNA-plasmider - en koder Gal4 protein smeltet til regulatoriskery del av et protein av interesse, og den andre koder for et protein som luciferase plassert under kontroll av en eller flere av UAS sekvenser. Således reflekterer den cellulære luciferase signal aktiviteten av proteinet av interesse. En annen vanlig bruk av luciferase-baserte reportere er for overvåkning av proteinstabilitet hvorved et protein av interesse er her koblet til en luciferase enzym ^4.. Uavhengig av type reporter, er en forbeholdet emptor bemerket her som man ikke kan anta spesifisitet av noen reporter å ha vært godt avhørt. Dermed er due diligence som kreves i inkorporering av nye reporter konstruksjoner i noen forskningsstrategi.

Valget av luciferase enzymet lese-out kan være like viktig som påliteligheten av DNA-elementer som styrer sitt uttrykk. Mens ildflue luciferase (FL) er den mest brukte enzym i kommersielt tilgjengelige konstruksjoner, framveksten av nye luciferase reporter systemer som ikke krever ATP (som i tilfelletav FL-baserte reaksjoner) eller at innlemme mer stabile enzymer som avgir sterkere signaler lover å forbedre effektiviteten og påliteligheten til denne forskningsplattform. Viktig merknad om valg av luciferase reportere i kjemiske studier er mottakelighet for FL til kjemisk hemming som kan gi opphav til falske rapporter. Vår erfaring er andre enzymer som Renilla eller Gaussia luciferase (RL og GL, henholdsvis) som utnytter coelenterazine som underlag er ikke så lett hemmet av små molekyler ^fem.

Det vanligste formatet for multipleksing luciferase read-outs innebærer bruk av FL og RL i stor grad gitt tilgjengeligheten av lett-å-bruke kits med evnen til fortløpende måle enzymatiske aktiviteter fra en enkelt prøve. I de fleste kits det ut prøver først utsettes for luciferin for å avsløre nivåer av FL aktivitet etterfulgt av en bråkjøling reagens som blir samtidig avsatt med coelenterazine hvorved et s.dary RL signal. Med tillegg av andre luciferases som kan skilles ut som GL, eller at bruken enda et substrat som Cypridina luciferase (CL), et større antall muligheter for å generere høye innhold data ved hjelp luciferases har dukket opp. Et eksempel på et genom-wide RNAi skjermen ved hjelp av denne teknikken kan bli funnet her ^seks. Disse teknologiske fremskritt har i sin tur påvirket utviklingen av spesifikke mekanismer for å slukke hver type luciferase enzym for å begrense krysstale ^7. I våre hender, ser vi en større frekvens av "kanteffekter" (uforklarlige trender i mobilnettet aktivitet forbundet med kanten av høye titer kultur plater), med utskilt luciferases som GL eller CL. På den annen side, slike utskilte luciferases er nyttige for kinetiske analyser som de klargjøringssignalet prøvetaking uten adulterating cellelevedyktighet.

For vår studie presentert her, vil vi samtidig overvåke aktiviteten til tre kreft-relevantcellulære prosesser: p53, Kras, og Wnt signaltransduksjonsveiene. Journalistene innlemmet i vår studie er pp53-TA-Luc FL reporter fra Clontech (heretter kalt p53-FL reporter) ^8, en Elk1-GAL4/UAS-CL reporter system (heretter Elk-1 reporter, Agilent), og 8X TCF RL reporter som inkorporerer flere syntetiske enhancer elementer anerkjent av Wnt veien transcriptional regulatorer som kalles T-celle faktorer (eller TCFs) ^9-11.

Protocol

Hele protokollen tar ca 4 dager.

En. Utarbeidelse av celler for siRNA og Reporter Transfection

Vi vil introdusere her en protokoll for avhør siRNA bibliotekene ved hjelp av et lite sett med siRNAs (384 forskjellige siRNA bassenger array i 96 godt format med hver pool bestående av 4x siRNAs rettet mot et enkelt gen) fra et genom-wide siRNA bibliotek for veiledende. For denne studien, vil vi utnytte HCT116 celler som viser avvikende Wnt og Kras signalering, og p53 aktivitet. Den passende cellelinje i studier med sikte på utspørrende andre cellulære prosesser av interesse må identifiseres og vurderes på en lignende måte.

1. Vask 5 x 10 cm ² plater av 80-90% konfluente HCT116-celler med PBS og deretter høste celler ved trypsinering ved anvendelse av 1 ml av trypsinering løsning / plate etterfulgt av nøytralisering med 10 ml Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 2% fetal bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin / plate.
2. Overfør cellene suspendert i et 50 ml konisk rør og sentrifugatet på ~ 130 xg i 5 minutter, supernatanten fjernes, og suspensjonen igjen cellepelleten i 10 ml DMEM / 2% FBS / 1% penicillin / streptomycin.
3. Telle celle nummer med en celle teller, og deretter foreta en celle løsning med 10 ⁵ celler / ml, holder 150 ml celle suspensjon for neste trinn. Plate 10 ⁴ celler (100 ul) i hver brønn av en 96 brønn cellekultur plate ved hjelp av en Multifall automatisert væske dispenser (heretter Multifall). Cellesuspensjonen bør være tilstrekkelig i dette tilfelle for plating 12 x 96-brønners plater.
4. Inkuber platene med cellene ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO ₂ mens han forberedte transfeksjon blanding.

2. Klargjøre Reporter Construct Stock Solution

1. Isolere høy kvalitet reporter konstruere DNA ved hjelp av standard midiprep kits (NucleoBond Xtra Midi produsert avClontech) og fortynne DNA til en sluttkonsentrasjon på 1 mg / ml for hver reporter.
2. Forbered 100 mL av reporter konstruere stamløsningen ved å kombinere 30 pl av p53-FL, 30 ul TCF 8X-RL, 30 mL av Elk1-Gal4, 6 mL UAS-CL og 4 pl av _H2O for å oppnå et DNA-blanding med en endelig 1:1:1:0.2 forholdet mellom journalister. Endelige DNA-konsentrasjonen av denne DNA-blanding stamløsning er 0,3 mg / ml.

3. Klargjøring av siRNA / DNA Transfection Mix

I denne delen av protokollen, vil vi forberede siRNA / DNA transfeksjon mikser som vil være tilstrekkelig for transfektere 12 x 96 brønners plater. For denne testen bibliotek med 4 x 96 brønners plate av sirnas, vil vi transfektere hver siRNA basseng i triplikat. Transfeksjon reagens vi vil bruke kalles Effectene (Qiagen). I våre hender er dette den eneste reagens som fungerer for samtidig levering av siRNA og DNA i dyrkede celler.

1. Fortynne 80 mL av reporter konstruere lager solution i 8 ml av EC-buffer (Effectene kit) for å oppnå et DNA-oppløsning med en endelig konsentrasjon på 3 ug / ml. Generelt, forberede nok DNA løsning mix for umiddelbar bruk.
2. Plate 20 pl av denne DNA-løsning til hver brønn av en 96 brønn / plate. Antallet 96 brønners plater vil avhenge av hvor mange siRNA bassenger vil bli testet. For eksempel, i dette tilfellet vil vi trenge 4 x 96 brønners plater for å evaluere 384 forskjellige siRNA bassenger.
3. De sirnas som skal testes, ligge på lager konsentrasjon på 5 uM. Hvis ikke, kan de være replika belagt og fortynnet til denne konsentrasjon ved anvendelse av anbefalte fortynningsbuffer tilknyttet hvert bibliotek.
4. Overfør 2 mL av hver 5 mikrometer siRNA lager til tilsvarende godt av PCR plate med den fortynnede DNA aksje med en Biomek Automated Flytende Handler. Avhengig av omfanget av studien, kan en flerkanals pipetten nok.
5. Nå vil vi 1 mL av Enhancer-løsning (Effectene pakken) til hver brønn av DNA / siRNA plate. Dette igjen kan gjøres enten med en automatisert væske fører eller multikanalpipette.
6. Tillat den Enhancer reaksjonen skal skje ved RT i 5 min og deretter tilsett 3 mL av Effectene transfeksjon reagens til hver brønn og inkuberes ved romtemperatur i ytterligere 10 min.
7. For å stoppe transfeksjon kompleksdannelse, tilsett 10 pl DMEM / 2% FBS / 1% penicillin / streptomycin til hver brønn av PCR-platen.
8. Overfør 10 ul av transfeksjon blanding til hver brønn på 96-brønners platen inneholdende cellene (hentet fra cellen inkubator). Etter hvert som hver transfeksjon vil bli utført i triplikat, vil den samme blanding anvendes til to ytterligere 96 brønners plater inneholdende celler.
9. Inkuber cellene med transfeksjon blandinger tilsatt ved 37 ° C i en fuktet miljø med 5% CO ₂ i 36 timer.

4. Bestem luciferase Aktiviteter fra celleprøver

Etter 36 timer, luciferase aktiviteter er klar for målingi transfekterte celler. Endepunktet bør bestemmes på en per-eksperiment basis. I vår studie hadde en 36 timers inkubasjonstid tidligere gitt en tilstrekkelig robust signal etter mening utfallet besluttsomhet. Ettersom denne studien omfatter flere reportere (ett utskilt i kulturmediet, og to andre uttrykt i cytoplasma celle), vil vi oppnå målinger fra begge kulturmediet samt en cellulær lysat.

1. Påvisning av CL aktivitet i kulturmediet:
   1. 20fil kultur medium er replica-belagt i en hvit ugjennomsiktig plate med 96 brønner (enten ved hjelp av Biomek Flytende Handler eller multikanalpipette).
   2. Tilsett 20 pl av CL analysebuffer (målsystemer) til hver brønn.
   3. Tilsett 10 pl av Cypridina luciferin substrat (målsystemer) til hver brønn og detektere CL aktivitet ved hjelp av et luminometer (den Pherastar plateavleseren produsert av BMG for eksempel).
2. Påvisning av FL og RL aktivitet:
   1. Lyse calen ved først å fjerne kulturmediet. Dette kan gjøres hurtig ved å snu platen opp ned og kaster medium i en vask. Gjenværende medium kan fjernes ved å banke opp ned plate på tørkepapir. Tilsett 30 pl av 1X Passiv Lysis Buffer (Promega) til hver brønn av celler ved hjelp av Multifall og sted på en plattform vippe (Bellco er et selskap som gjør disse) sette en middels hastighet i 5 min ved RT.
   2. Tilsett 20 mL av Luciferase analysereagenssettet II (del av Promega Dual Luciferase Kit) med Multifall og umiddelbart måle FL aktivitet ved hjelp av luminometer. Deretter legger Stop & Glo Reagens (Promega) som vil slukke FL aktivitet og tillate måling av RL aktivitet. Merk: Med mindre du bruker substrat mikser som tillater lengre signal varighet (for eksempel Dual-Glo luciferase Kits fra Promega), krever bruk av flash kits rask måling på underlaget tillegg (innen 5 min).

Representative Results

Til tross for fremskritt i å kartlegge mutational landskapet av ulike kreftformer med massive genomsekvensering innsats ^12-14, har vi fortsatt ikke har på plass en systematisk tilnærming for å oversette disse observasjonene i intervensjon strategier. I tykk-og endetarmskreft (CRC), mutasjoner som er spådd å påvirke komponenter i tre cellulære prosesser - Wnt / β-catenin, p53, og Kras signalering - er funnet i 99% av alle svulster som tyder på at de er sentrale drivere av mobilnettet transformasjon i tarmen ^13. Dermed er kreft genom datasett sannsynlig beriket for gener som støtter fellesnevner kreft fremme prosesser, og som kan utnyttes for rask identifisering av kreftcelle sårbarheter. For å undersøke denne hypotesen har vi utviklet strategier mottagelig for high-throughput avhør av gen-funksjon med hensyn til Wnt / β-catenin, p53, og Kras signalering. Vi først demonstrere det spesielle ved hver reporter system i én reporter tester (figur 1), og deretter gi bevis for at disse reportere kunne brukes sammen for samtidige målinger av gen-aktivitet av disse tre viktige cellulære prosesser (figur 2).

Figur 1. Høy gjennomstrømming luciferase-baserte analyser for å overvåke Wnt / β-catenin, p53 og Kras / Erk sti status i mammalske celler. Den robusthet av tre ulike screening plattformer ble individuelt vurdert før multipleksing bruker kontroll siRNAs rettet mot veletablerte spredningsveier komponenter. Indikerte colorectal cancer cellelinjer ble tilført med 8X TCF, pp53-TA-Luc, eller Elk-en ildflue luciferase-koding reporter konstruerer sammen med bassenger av siRNAs rettet mot β-catenin, p53, eller Kras, henholdsvis. Pathway-relevante genotype for hver cellelinje er angitt. Styrken av hver screening plattform ble vurdert av reproduserbarheten av disse sirnas-induserte virkninger på det aktuelle signaltransduksjon pathway. De β-catenin sirnas har ingen effekt på 8X TCF reporter aktivitet i RKO celler i motsetning til DLD-1-og HCT-116 celler som er henholdsvis mangelfull i APC pathway suppressor protein og uttrykker en aktivert form av β-catenin. Trykk her se større figur .

Figur 2. Multipleksing luciferase baserte journalister for høyt innhold mobilnettet analyse av gen-funksjon. A. Skjematisk fremstilling av en strategi for samtidig overvåking Wnt / β-cat Enin, p53, og Kras spredningsveier aktiviteter. FL = ildflue luciferase, RL = Renilla luciferase, CL = Cypridina luciferase (utskilt enzym). FL og RL aktiviteter i lysatet fastsettes ved luciferin og coelenterazine underlag. CL aktivitet i kulturen medium måles med oxyluciferin. * Andre rapportørgrupper systemer kan innlemmes i denne protokoll for å øke innholdet av hvert eksperiment. For eksempel kan den CytoTox mel assay brukes for å overvåke cellulær toksisitet ved sampling av nivåene av en intracellulær protease frigjøres til kulturmediet. Innlemmelsen av CytoTox analysereagenssettet påvirker ikke aktiviteten i CL reporter. B. Identifisering av sti-spesifikke sårbarheter ved hjelp RNAi. Evnen til multiplex luciferase systemet beskrevet i "A" for å kvantifisere genet dedikasjon til cellular funksjon ble testet ved hjelp av de angitte siRNA bassenger.nk "> Klikk her for å se større figur.

Discussion

Det er flere formidlere av luciferase-baserte reporter systemer (som Promega, målsystemer, New England Biolabs, og Thermo Fisher) som gir nyttige on-line ressurser for de underholdende en høy gjennomstrømming skjermen for første gang. I tillegg bør en rekke gode anmeldelser om å optimalisere bruken av high-throughput skjermer for genet funnet og hvordan RNAi-basert screening resultater kan integreres med andre-omics-baserte datasett være nyttig ^15,16. Metoder for valg av "treff" fra high-throughput skjermer er gjenstand for en annen diskusjon som er utenfor rammen av denne rapporten. Flere vurderinger på dette emnet, er tilgjengelige ^17,18. Imidlertid er et viktig kriterium for å validere utvalgte hits fra skjermer basert på bruk av transcriptionally aktivert journalister muligheten for samme perturbagen (RNAi-eller kjemisk baserte) for å indusere samme effekt på validerte mål gener som måles ved hjelp av RT-PCR, qPCR, Eller microarray analyse. Videre, husk at responsen målt ved reporter er vanligvis høyere enn induksjon av en endogen reporter gitt at en funksjon av en vellykket syntetisk reporter er å gi et robust signal. Til slutt, er en fordel med dette samarbeidet transfeksjon strategi brukervennligheten som man raskt kan sette sammen ulike reporter cocktails for å overvåke en ønsket sett av cellulære aktiviteter. Selv om mer arbeidskrevende, ville bruken av cellelinjer stabilt skjuler journalistene trolig øke signal til støyforhold gitt variasjon av respons er nå først og fremst begrenset til siRNA transfeksjon effektivitet alene.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
PathDetect Elk1 Trans-Reporting System	Agilent Technologies Inc.	219005
Pathway Profiling Luciferase System 4 pp53-TA-Luc Vector	Clontech Lab Inc.	631914
Effectene Transfection Reagent	Qiagen Inc.	301427
Dual-Luciferase Reporter Assay System	Promega Corp.	E1960
Cypridina Luciferase Assay reagent	Targeting Systems	VLAR-1
HCT116 cells	ATCC	CCL-247
CytoTox-Fluo Cytotoxicity Assay	Promega Corp.	G9260
EQUIPMENT
MultiFlo Microplate Dispenser	Labsystems Inc.	Model 832
Biomek FXP Laboratory Automation Workstation	Beckman Coulter Inc.	A31842
PHERAstar FS-multi-mode HTS microplate reader	BMG Labtech Inc.	0471-101A
Bright-Line Reichert Hemacytometers	Hausser Scientific Company	1490