光化学缺血：一种微创和可重复性的光化学皮质病变模型小鼠中风研究

Summary

的Photothrombosis是一种快速，微创技术领域的兴趣，高度可重复的方式诱导小以及分隔梗死。它特别适用于为研究细胞和分子在转基因小鼠中脑的可塑性响应相关。

Abstract

光化学中风模型的目的是通过在一个给定的皮层区的先前注入的光敏感的染料的光激活诱导的局部缺血损伤。照明，染料被激活，并产生单重态氧，损害元件的内皮细胞的膜，随后的血小板聚集和血栓形成，最终确定了局部血流量的中断。布鲁姆和El-萨班于1977年，最初提出这种方法，后来在1985年提高沃森在大鼠脑并设置当前模型的基础。此外，供应量增加的转基因小鼠线进一步提供的提高利息上photothrombosis模型。简单地说，光敏染料（玫瑰红）腹膜内注射，并进入血流。当冷光源照明，染料被激活，诱导血管内皮损伤，血小板活化和血栓形成，造成局部血流中断。光源可应用于完整的头骨，无需开颅手术，可以针对任何皮质区的利益在一个可重复的和非侵入性的方式。鼠标，然后缝合，并允许醒来。局部缺血损伤的评价可以迅速通过三苯基四唑鎓氯化物或甲酚紫染色。该技术生产出体积小，以及分隔的边界，这是非常有利于精确的电池特性或功能的研究梗死。此外，它是特别适合用于研究细胞和分子在转基因小鼠中脑的可塑性响应相关。

Introduction

在21世纪的开始，缺血性中风是一种破坏性疾病，长期残疾^和全球死亡原因的第二位，其中中风占约5,7万人死亡，在2004年²代表第二个原因。尽管被放在许多努力，但仍然没有有效的治疗方法，可改善卒中后功能恢复。卒中动物模型被广泛用于中风研究的领域中，因为它们允许缺血性损伤的病理生理学机制的建模和测试不同的神经保护策略在体内的疗效。这些模型大多通过中断（暂时或永久）大脑中动脉内的血流量，而其他车型的开发，研究在特定区域，通常是电动机和体感皮层的病变体积小，旨在引起广泛梗死。然而，有几个因素可能会导致产生交流在实验中风的研究，其中包括所使用的小鼠品系ERTAIN变异程度，在研究中的动物的年龄和性别，并最重要的是，该技术通过诱导局部缺血损伤。对于后一点，手术的持续时间和侵袭性的（ 即开颅手术的需要），以及需要操作者能够可靠地诱导缺血性病变的外科手术技术人员的关键决定因素，一个成功的体内中风研究的相关。

最初提出的概念photothrombosis布鲁姆和El-萨班在1977年³和其应用在大鼠脑沃森等人成为著名的。于1985年⁴技术大幅度提高，并设置当前模型³的基础^{- 6。}光化学方法的目的是通过光激活的光敏感染料先前交付进入血液系统，WH诱发皮质梗死ICH导致局部血管血栓形成暴露在光天化日之下的地区。当循环染料在适当的波长的照明冷光源，它释放出能量的氧分子，从而能够产生大量的反应性高的单重态氧产品。这些氧中间体诱导血管内皮细胞的膜脂质过氧化，导致血小板粘附和聚集，并最终确定局部脑血流量中断^7的血栓的形成。

photothrombosis是一个非规范性脑缺血模型，不吸留或打破只有一个动脉因为它通常发生在人类卒中，但诱导病变的比较浅的容器，这会导致在暴露在光线下的区域中选择性的血流中断。由于这个原因，这种方法可能适合皮层可塑性的细胞和分子的研究。这种技术的主要优点驻留在其简单的执行。此外，photothrombosis可以容易地进行在每只动物约40分钟，包括21分钟的等待时间（3分钟麻醉; 1分钟到剃的头皮;动物放置在立体定位仪上3至5分钟，2分钟，擦洗头皮消毒液，做一个切口，清洁的头骨; 2到4分钟，将冷光源光纤，1分钟，注入孟加拉玫瑰红溶液，5分钟等待腹腔扩散，15分钟的照明; 5分钟，清洗伤口，缝合动物）。此外，没有手术专业知识是必要执行此技术通过简单的照明完整的头骨，引起病变。不同于古典动脉闭塞，这个方法决定选择性地照射区域内的软脑膜和脑实质微血管闭塞，没有侧支血管留在目标区域的氧气供应，降低病变之间的变异。

其特殊的性质，尽管光化学损伤股脑中风发生的重要机制。类似于人类卒中的动脉闭塞，在照射区域^7的血小板聚集和凝块的形成决定的血流中断。同样，这种模式也分享必不可少的炎症反应，如在大脑中动脉闭塞^8。然而，因为以及delimitated的边界，半影区，它对应于一个区域的部分保存下来的代谢，是非常减少或不存在的后光化学病变。这种边界清晰，可以方便的在缺血性或完整的皮质区细胞反应研究。 photothrombosis小鼠模型是特别适合于在各种转基因动物的中风研究。事实上，经典机型不适合所有菌株和长时间的研究在C57BL / 6小鼠品系死亡率高的比例，可能会导致偏见^9。

Protocol

1。手术前

1. 称量玫瑰红的1.5毫升管中，溶解在无菌生理盐水溶液中，直到达到最终浓度为15毫克/毫升。通过0.2微米的过滤器过滤灭菌，并将其存储在黑暗中，在室温下长达两个月。
2. 所有的手术器械消毒灭菌。应消毒手术区不到一小时才开始手术。
3. 记录小鼠体重调整剂量注入孟加拉玫瑰红。女CD1小鼠12周龄本协议注入10微升/克动物体重。孟加拉玫瑰红需要的量，以产生所需的皮质病变的大小，可以很容易地确定的一组独立的预备实验，通过测试不同剂量（通常为2微升/克，5微升/克或10微升/ g体重）。请注意，孟加拉玫瑰红的量被注入高度依赖于实验条件下，特别是不同的光源使用光线照射的持续时间。另外，在本研究中，10微升/克（150微克/克）的剂量发现是必要的诱导photothrombosis曝光时的光15分钟，而其余各组报告，50微克/克^6,8和100微克/克¹⁰腹腔注射足以诱导光化学病变。

2。麻醉过程

1. 透明感应室（诱导的3.5-4％，保持1.5-2％）在50％（体积/体积）oxygen/50％（体积/体积）的一氧化二氮的混合气体与异氟醚麻醉小鼠。气体麻醉允许快速唤醒的动物和麻醉气体的水平，能够容易地调整。另外，小鼠也可以用氯胺酮 - 甲苯噻嗪的混合物麻醉。
2. 达到深麻醉时，取出麻醉动物感应室，将其放置在立体框架，并用面罩维持麻醉。调整isoflura的NE剂量达到足够的麻醉水平。监控整个过程中的呼吸速率，并确保它是恒定的（每分钟呼吸40 - 60）。
3. 用脚趾捏，以确保动物是深深麻醉。
4. 应用眼药膏，以防止眼睛干燥。
5. 轻轻插入直肠温度探头监控整个手术过程。鼠标体温维持在37±0.5℃下，设置相应的反馈控制的加热垫

3。手术目标区域照明

1. 用电动剃须刀刮胡子鼠标头皮。
2. 牢固地固定在头部和耳棒插入到外部鼻道。要小心，不要伤害耳膜。
3. 与交替挥笔70％乙醇和优碘用棉签消毒皮肤表面上。
4. 用手术刀做一个切口，沿中线从眼睛LEVEL的脖子。应用皮肤拉钩保持颅骨外露。
5. 轻轻缩回periostium，颅骨的边缘，用手术刀让颅骨表面晾干，用无菌棉签。确定前囟门和lambda。前囟门上放置一个玻璃微作为参考点，然后将其移动到您感兴趣的区域的坐标。本文选择感兴趣的区域大致是严厉形，约2毫米横向居中前囟门，占地约30毫米^，其中包括了很大一部分的感觉皮层的小鼠脑图谱富兰克林paxinos ^11。
6. 标记利益与参考点的位置，并把一根光纤与颅骨表面紧密接触，避免光的散射，但注意不要施加压力。照射范围可以任意申请头骨上口罩光纤GUI的尖端小光圈，或者上限限制德。

4。孟加拉玫瑰红注射液和激活

1. 负载的玫瑰红溶液1 ml注射器和计算的量要根据在10μl/克体重的剂量注入。
2. 继续一个缓慢腹腔注射。
3. 让染料的漫反射，并进入血流。 5分钟后，冷光源切换。避免任何其他光源照明的动物。我们使用光纤照明灯150瓦的强度。
4. 经过15分钟的照明，停止光照射，并缝合伤口。五分钟的照明已经产生梗死和10分钟可能是足够的，以获得最大的效果^12。为了尽量减少可变性，我们选择照亮15分钟。

5。缝合

1. 去除皮肤拉钩和应用无菌生理盐水，以避免脱水。
2. 关闭使用反向切割needl的伤口e和丝绸或尼龙缝合线。
3. 中断麻醉交付，小心地取出鼠标从立体定位仪，并把它放在一个预热加热垫，直到它完全清醒，然后再返回到它的笼子。人体温度应仔细监测整个程序限制的可变性，在梗塞扩展。的浓度和给药途径，孟加拉玫瑰红，仍然可以在血液中检测到几个小时后注射^13。不想电热毯暖灯，以避免潜在的二次损害（孟加拉玫瑰在绿色光谱吸收波长为）。

Representative Results

此协议将产生皮质病变，皮质解剖后，已是可见的，肉眼（ 图1A-1C）。光化学病变发展浅表和深部皮质层组织是半透明到足以允许孟加拉玫瑰红的光激活的。脑梗塞的程度的测量，可快速地执行通过组织染色与三苯基氯化四氮唑（TTC）在4％多聚甲醛（PFA）固定后对新鲜组织或甲酚紫。 TTC孵育之前，新鲜解剖的脑定位在脑切片机，划分成1毫米厚的片（ 图1C）。 TTC标记为红色，而完整的组织梗死区出现面色苍白，它可以精确测量梗死区（ 图1D-1E）。减少或不存在，根据病变的大小不完全缺血的区域定义为半暗带。

同样，甲酚紫染色的紫色染色周围组织相比，可以识别未染色的梗死区。的反应性增殖和细胞浸润（其中发生病变的第一周期间）也可以被评估（ 图2A1-2A2），以及外观的胶质瘢痕（ 图2B1-2B2）。通过执行相同的手术和染料注入阴性对照进行，但未经曝光的冷光源。病变是重复性的大小和位置，在不同的时间点后病变（ 图3A-3B）。梗死面积一般达到其最大大小孟加拉玫瑰红注射液¹⁴后4至6小时，随后迅速减少2天至4天photothrombosis。照射发生在浅层，但也可能因为被遮挡在深皮质层的大型船舶压缩挑起病变^7。重要的是要调查的病变治疗前的可重复性，因为软脑膜脑微血管系统的分布可以不同动物之间的不同年龄或应变。

图1。宏观外观photothrombotical病变在CD1小鼠大脑后第4天，AB photothrombosis横向和正面的看法。显示为一个白色的区域，肉眼可见的表面梗死（箭头）。C.，脑定位在脑切片机切片成1毫米厚的部分迅速DF。脑梗塞的程度的测量可以通过TTC染色。血栓性病变的坏死组织内的字符在于染色缺席。冠状切片的大脑交流所示的喙尾椎延伸从D到 F表示。

图2。代表时间的演变的光化学损伤。成年C57BL / 6小鼠的大脑冠状切片甲酚紫染色。A1，A2。损伤后第7天的细胞数高集在梗死边界B1，B2。在30日，病灶体积高度降低胶质瘢痕形成。A2和B2是高倍率分别为A1和B1。标尺：A1，B1：1毫米; A2 B2：0.5毫米。

图3。宏观外观的大脑在2，4和16天后photothrombosis。A.显微PFA灌注大脑，准备进一步的免疫组化分析。梗死区（虚线）被高亮显示。病变部位后，2，4和16天的表面积比较。 n = 4时，各组。 * P <0.05（学生t-检验）。

Discussion

修改和替换

由于其在562 nm处的吸收峰从过滤的氙弧灯，绿光激光器最初被选择照射在感光玫瑰红。虽然仍然使用激光介导激发recently5，它可以取代冷光源灯泡，也能确保染料激发^10,15。冷光源光纤更易于操作，更便宜比激光源。然而，应该注意的是激光器被普遍用来针对单个表面小动脉开颅手术后在体内的特定血管凝血^10。

交付敏感的染料通常是通过尾静脉注射，这需要一定的训练，为获得均匀的和可再现的结果。相比之下，腹腔内注射更容易执行，和玫瑰红是在血液中检测到了几分钟后^，13。有效phototh可以通过rombosis激发染料5分钟后显示该血药浓度的染料的继续增加，甚至60分钟给药后^13，腹腔注射^8，然而，孟加拉玫瑰红，在大鼠的腹腔内剂量。输注静脉注射玫瑰红可以提高病变¹³的可再现性，但这种给药方式可以关联到的情况下进行输液过于急剧的（<1.5分钟），或在高染料浓度⁵低血压。为了避免血压的波动，以及其他的光敏物质，例如赤藓红乙可用于产生血管闭塞，但这种分子被认为相同的范围内，浓度⁵的效率低于孟加拉玫瑰红。

关键步骤

不同的因素影响病变的大小和深度，如敏感的染料的浓度的染料之间的延时，injecti和照明的光源的强度，直径的开明的表面，暴露时间和期间和手术后的体温。颅骨上的光源的角度也能影响梗死的形状。应进行的一系列的初步的实验测试的可重复性和来确定最低的染料量和照射时间，即产生损伤，影响了选择性的目标区域和/或获得有意义的行为赤字。

该技术的局限性

这项技术的开发，以模仿人类卒中通过观察诱导血小板聚集在脑缺血^4。然而光化学损伤稍微不同于人类卒中。首先，血栓触发大量的船只在照明领域，而中风通常是由一个单一的终末动脉内血流中断。如因此，一些地区的大脑，其代谢仅部分支持由经历动脉血流中断，最初受影响较小，因为他们可能会收到侧支动脉供血，不发生坏死的细胞死亡。在明确定义的边界，在一个非常有限的半影由photothrombosis结果相反，这是缺血后神经保护剂的主要目标。此外，在中风病人的一个子集，再灌注自发发生，并可能引起继发的损失（包括再灌注损伤）。为了研究这个特定方面的缺血，短暂闭塞模型是比较合适的。

梗死本身的格局显示了一些不同的特点，从人类中风。 MRI显示大光化学发展的病变，而缺血性梗死缺血性梗死和血管性水肿的同时发展压倒血管性水肿在呼玛Ñ ​​行程^16。相反，photothrombosis可能不足够用于研究的抗血栓形成剂的研究，由于这样的事实，发生光化学梗死后也阻断血小板或抑制内源性凝血途径^17。事实上，曾有人建议，在特有的条件下，对​​血小板凝血是没有必要的光化学闭塞血管内皮的完整性，其中中断会诱发周围血管水肿和相关的压缩。此外，在同一研究MRI分析没有表明修改后的梗死面积阻断血小板功能或耗尽血小板^17。

相对于现有方法中的意义

众多的标准化永久性的，短暂的，重点和全脑缺血模型，机械或化学诱导，在啮齿类动物中，为了密切模仿人类中风的病理生理学和开发的P新的神经保护策略。这里介绍的是一个永久性局灶性脑缺血模型，始终诱导中风损伤所需的大小在任何皮质或皮质下站点一个非常重复性和微创的方式photothrombosis。该模型显示，成活率高，达到了100％（25只），而在我们的实验中得到更广泛的研究^{，98.4％，18。}根据目标区域和行为休养影响到一个精确的功能，可以自定义，以光化学病变，可以由多个测试^6,19评估。此外，这种方法是不费时，一些昂贵的，并且可以很快就学会了，因为它在技术上并不要求相对于其他车型，包括灯丝模型。此外，是通过诱导局部血栓的形成，结构上类似于人类卒中中所观察到的血管闭塞。然而，光化学方法还被改编为公关oducing闭塞，大脑中动脉^20。环病变模型后来发展，以获得更大的半影。它包括一个照明下的圆的形状，在中心的活组织的皮层区域所包围的圆形的损坏的组织和共享缺血半暗带^21,22的生物化学和分子特性。变种的技术也可进行中风大脑发育的²³或皮层下组织^24。

总之，的photothrombosis是一个易于执行的缺血模型具有很高的稳定性。此外，它是适用于一些实验中风研究，特别是对脑损伤皮层可塑性的评价，在细胞和分子水平。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made