Summary
Photothrombosis è una tecnica rapida, mini-invasiva per indurre le piccole e ben delimitate del miocardio in aree di interesse in modo altamente riproducibile. È particolarmente adatto per studiare risposte cellulari e molecolari alla base della plasticità cerebrale in topi transgenici.
Abstract
Il modello di ictus photothrombotic mira a indurre un danno ischemico entro una data area corticale mediante foto-attivazione di un colorante fotosensibile precedentemente iniettato. Seguendo illuminazione, il colorante viene attivato e produce ossigeno singoletto che danneggia i componenti delle membrane cellulari endoteliali, con successiva aggregazione piastrinica e la formazione di trombi, che alla fine determina l'interruzione del flusso sanguigno locale. Questo approccio, inizialmente proposto dal Rosenblum e El-Sabban nel 1977, è stato successivamente migliorato da Watson nel 1985 nel cervello di ratto e ha posto le basi del modello attuale. Inoltre, l'aumento della disponibilità di linee di topi transgenici ha ulteriormente contribuito ad aumentare l'interesse sul modello photothrombosis. Brevemente, un colorante fotosensibile (Rosa Bengala) viene iniettato per via intraperitoneale e entra nel flusso sanguigno. Quando illuminata da una sorgente luminosa fredda, il colorante diventa attivato e induce danno endoteliale con l'attivazione piastrinica e trombosi, causando localeinterruzione del flusso sanguigno. La sorgente luminosa può essere applicato sul cranio intatto senza bisogno di craniotomia, che permette il targeting di qualsiasi area corticale di interesse in modo riproducibile e non invasivo. Il mouse viene poi suturata e ha permesso di svegliarsi. La valutazione del danno ischemico può essere rapidamente realizzato da cloruro trifenil-tetrazolium o cresile colorazione viola. Questa tecnica produce infarto di piccole dimensioni e confini ben delimitati, che è molto vantaggioso per la caratterizzazione delle cellule precise o studi funzionali. Inoltre, è particolarmente adatto per studiare risposte cellulari e molecolari alla base della plasticità cerebrale in topi transgenici.
Introduction
Agli inizi del secolo 21 °, ictus ischemico è una malattia devastante che rappresenta la seconda causa di disabilità a lungo termine 1 e la seconda causa di mortalità in tutto il mondo, nei quali ictus rappresentato circa 5,7 milioni di morti nel 2004 2. Nonostante i numerosi sforzi che sono stati messi in, non vi è ancora alcun trattamento efficace disponibile per migliorare il recupero funzionale dopo ictus. I modelli animali di ictus sono ampiamente utilizzati nel campo della ricerca ictus in quanto consentono la modellazione della fisiopatologia del danno ischemico e testare l'efficacia di differenti strategie di neuroprotezione in vivo. La maggior parte di questi modelli mirano a indurre infarto esteso da interrompere (temporaneamente o definitivamente) il flusso di sangue all'interno dell'arteria cerebrale media, mentre altri modelli sono stati sviluppati per studiare le lesioni di piccole dimensioni in settori specifici, in genere il motore e la corteccia somatosensoriale. Tuttavia, diversi fattori possono contribuire a generare corrente alternataalune grado di variabilità in studi sperimentali ictus, compreso il mouse ceppo utilizzato, l'età e il sesso degli animali inclusi nello studio e, soprattutto, la tecnica adottata per indurre il danno ischemico. Con riferimento a quest'ultimo punto, la durata e invasività della chirurgia (cioè la necessità di una craniotomia), così come l'abilità chirurgica richiesta all'operatore di indurre attendibilmente una lesione ischemica sono fattori determinanti per il successo di uno studio imparziale nella corsa in vivo .
Il concetto di photothrombosis stato inizialmente proposto da Rosenblum e El-Sabban nel 1977 3 e divenne celebre per la sua applicazione nel cervello di ratto da Watson et al nel 1985, 4 nel quale la tecnica è stata ampiamente migliorata e ha posto le basi del modello attuale 3. - 6. L'approccio photothrombotic mira a indurre un infarto corticale attraverso la foto-attivazione di un colorante fotosensibile precedentemente consegnata nel sistema sanguigno, which provoca trombosi dei vasi locale nelle aree esposte alla luce. Quando il colorante circolante è illuminato alla lunghezza d'onda appropriata da una sorgente di luce fredda, rilascia energia a molecole di ossigeno, che a loro volta generano una grande quantità di prodotti altamente reattive dell'ossigeno singoletto. Questi intermedi dell'ossigeno inducono perossidazione endoteliali membrana cellulare, portando ad adesione e l'aggregazione piastrinica, e infine alla formazione di trombi, che determinano il flusso locale interruzione cerebrale 7.
Photothrombosis è un modello ischemico non canonico che non occlude o rompere una sola arteria come accade di solito in tempi umani, ma induce lesioni in vasi più superficiali, che provoca l'interruzione selettiva del flusso sanguigno nelle zone esposte alla luce. Per questo motivo, questo approccio può essere adatto per gli studi cellulari e molecolari della plasticità corticale. Il vantaggio principale di questa tecnica risiede nella sua semplicità di esecuzione.Inoltre, photothrombosis può essere facilmente effettuata in circa 40 minuti per animale, compreso venti minuti di attesa (3 min per anestesia, 1 min a radere il cuoio capelluto, 3 per 5 min per posizionare l'animale sul apparato stereotassico; 2 min per fregare la cuoio capelluto con soluzione antisettica, fare un'incisione e pulire il cranio; 2-4 min per posizionare la fibra di luce fredda; 1 min per iniettare la soluzione di rosa del Bengala; 5 minuti di attesa per la diffusione intraperitoneale; 15 min di illuminazione, e 5 min a pulire la ferita e suturare l'animale). Inoltre, nessuna perizia chirurgica è necessaria per eseguire questa tecnica come la lesione è indotta mediante semplice illuminazione del cranio intatto. A differenza di occlusione arteriosa classica, questo metodo determina occlusione selettiva del microcircolo piale e intraparenchimale all'interno della zona irradiata e riduce la variabilità tra le lesioni come nessuna nave garanzia è lasciato per la fornitura di ossigeno nella zona di mira.
Nonostante la sua particolare natura, ilazioni danni photothrombotic meccanismi essenziali che si verificano nel cervello ictus. Similmente a occlusione dell'arteria in corsa umana, l'aggregazione piastrinica e la formazione di coagulo determinano interruzione del flusso sanguigno nella zona irradiata 7. Allo stesso modo, questo modello condivide anche le risposte infiammatorie essenziali come in occlusione dell'arteria cerebrale media 8. Tuttavia, a causa dei limiti ben delimitato, la zona di penombra, che corrisponde ad un campo di metabolismo parzialmente conservata, è molto ridotta o inesistente dopo una lesione photothrombotic. Questo confine chiaro può facilitare lo studio delle risposte cellulari all'interno dell'area corticale ischemica o intatto. Modello di topo Photothrombosis è particolarmente adatto per studi di ictus in una varietà di animali transgenici. Infatti i modelli classici non possono adattarsi a tutti i ceppi e studi lungo periodo in C57BL / 6 ceppo di topi riferito un alto rapporto di mortalità che può causare pregiudizi 9.
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Protocol
1. Pre-chirurgia
- Pesare Rosa Bengala in una provetta da 1,5 ml e sciogliere in soluzione salina sterile fino a raggiungere una concentrazione finale di 15 mg / ml. Filtro sterilizzare attraverso un filtro 0,2 micron e conservare al buio a temperatura ambiente fino a due mesi.
- Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave. L'area chirurgica deve essere sterilizzata meno di un'ora prima di iniziare l'intervento chirurgico.
- Registrare il peso del corpo del mouse per regolare la dose di Rosa Bengala da iniettare. Abbiamo iniettato 10 ml / g di peso animale in topi femmina CD1 12 settimane nel presente protocollo. La quantità di Rosa Bengala necessario per produrre la dimensione desiderata lesione corticale può essere facilmente determinato in una serie separata di esperimenti preliminari testando diversi dosaggi (tipicamente 2 microlitri / g, 5 microlitri / go 10 ml / g di peso corporeo). Si noti che la quantità di Rosa Bengala da iniettare è fortemente dipendente dalle condizioni sperimentali, in particolare il tipo di sorgente luminosautilizzato e la durata di esposizione alla luce. In questo studio, 10 ml / g (150 mcg / g) della dose è risultato essere necessario per indurre photothrombosis con l'esposizione alla luce per 15 minuti, mentre altri gruppi hanno riferito che o 50 mcg / g 6,8 e 100 mcg / g 10 iniezione intraperitoneale era sufficiente per indurre una lesione photothrombotic.
2. Procedura di Anestesia
- Anestetizzare topi con isoflurano in una camera di induzione trasparente (3,5-4% per l'induzione, 1,5-2% per il mantenimento) in 50% (v / v) oxygen/50% (v / v) diazoto miscela di gas monossido. Anestesia gassosa permette un rapido risveglio degli animali e il livello di gas anestetico può essere regolata facilmente. Alternativamente, i topi possono anche essere anestetizzati con una miscela ketamina-xilazina.
- Quando si raggiunge in profondità dell'anestesia, rimuovere l'animale anestetizzato dalla camera di induzione, posizionarlo nel frame stereotassico e mantenere l'anestesia utilizzando una maschera viso. Regolare la isoflurane della dose per raggiungere un livello adeguato di anestesia. Monitorare la frequenza respiratoria durante tutta la procedura e assicurarsi che sia costante (40-60 respiri al minuto).
- Utilizzare pizzichi punta in modo da garantire che l'animale è profondamente anestetizzati.
- Applicare pomate oftalmiche, al fine di evitare gli occhi si secchi.
- Inserire delicatamente la sonda rettale per monitorare la temperatura durante le procedure chirurgiche. Impostare il pad riscaldamento retroazione controllata associato per il mantenimento della temperatura corporea topo a 37 ± 0,5 ° C.
3. Chirurgia per illuminazione della zona di destinazione
- Shave il cuoio capelluto del mouse con un rasoio elettrico.
- Fissare saldamente la testa e inserire le barre di auricolari in meato esterno. Siate attenti a non danneggiare i timpani.
- Disinfettare la pelle in superficie con colpi di etanolo al 70% e betadine utilizzando tamponi di cotone alternati.
- Utilizzare un bisturi per fare un'incisione lungo la linea mediana dall'occhio level fino al collo. Applicare divaricatori della pelle per mantenere il cranio esposto.
- Ritrarre delicatamente il periostio ai bordi del cranio con un bisturi e lasciare la superficie del cranio asciugare utilizzando tamponi di cotone sterili. Identificare il bregma e lambda. Posizionare una micropipetta di vetro sul bregma come punto di riferimento, quindi spostarlo le coordinate della regione di interesse. La regione di interesse scelto per questo articolo è approssimativamente roundly sagomata, centrata circa 2 mm lateralmente al bregma, e copre una superficie di circa 30 mm 2, che comprende gran parte della corteccia sensomotoria secondo il topo cervello atlante da Franklin e Paxinos 11.
- Segnare la posizione di interesse con punti di riferimento e di porre in fibra ottica a stretto contatto con la superficie del cranio per evitare dispersione della luce, ma attenzione a non esercitare una pressione su di esso. L'area illuminata può essere limitata applicando sul cranio una maschera con piccola apertura o un tappo sulla punta della fibra ottica guide.
4. Rosa Bengala iniezione e attivazione
- Caricare la soluzione Rosa Bengala in una siringa da 1 ml e calcolare l'importo da iniettare in base a una dose di 10 ml / g di peso corporeo.
- Procedere ad una iniezione intraperitoneale lenta.
- Lasciate che la diffusa colorante ed entrare nel flusso sanguigno. Dopo 5 minuti, accendere l'illuminatore a luce fredda. Evitare l'illuminazione dell'animale da qualsiasi altra sorgente di luce. Abbiamo usato illuminatore da 150 W intensità in fibra ottica.
- Dopo 15 min di illuminazione, interrompere l'esposizione alla luce e suturare la ferita. Cinque minuti di illuminazione già producono miocardico e 10 min dovrebbe essere sufficiente per ottenere un effetto massimo 12. Per ridurre al minimo la variabilità, abbiamo scelto di illuminare per 15 min.
5. Suturare
- Rimuovere i divaricatori pelle e applicare la soluzione salina sterile per evitare la disidratazione.
- Chiuda la ferita utilizzando inverso needl taglioE e seta o filo di sutura di nylon.
- Interrompere per anestesia, rimuovere con attenzione il mouse dal apparato stereotassico e metterlo su un rilievo di riscaldamento pre-riscaldato fino a quando non è completamente sveglio, per poi tornare alla sua gabbia. La temperatura corporea deve essere monitorata attentamente tutta la procedura per limitare la variabilità dell'estensione dell'infarto. In funzione della concentrazione e la via di somministrazione, Rosa Bengala può ancora essere rilevato nel flusso sanguigno per diverse ore dopo l'iniezione 13. Preferire la coperta di riscaldamento per il riscaldamento della lampada per evitare potenziali danni secondari (Rosa Bengala assorbimento di lunghezza d'onda è nello spettro verde).
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Representative Results
Questo protocollo produrrà una lesione corticale che è già visibile sulla dissezione della corteccia ad occhio nudo (Figure 1A-1C). La lesione photothrombotic sviluppa in superficiali e profondi strati corticali in cui il tessuto è sufficientemente trasparente da consentire foto-attivazione del Rosa Bengala. Misurare l'entità di infarto cerebrale può essere eseguita rapidamente mediante colorazione istologica con cloruro di trifenil-tetrazolio (TTC) su tessuto fresco o violetto cresolo dopo fissazione in 4% paraformaldeide (PFA). TTC prima incubazione, il cervello di fresco sezionato è posizionato in una affettatrice cervello e sezionata in fette spesse 1 mm (Figura 1C). TTC etichetta tessuto intatto in rosso mentre la regione infartuata appare pallido, che permette una misurazione precisa della zona infartuata (Figure 1D-1E). La zona di ischemia incompleta definito penombra è molto ridotta o inesistente a seconda delle dimensioni della lesione.
Analogamente, la colorazione violetto cresolo permette l'identificazione di aree infartuati non colorati rispetto al tessuto circostante viola-tinto. La proliferazione reattiva e infiltrazione di cellule (che si verifica durante la prima settimana dopo la lesione) può anche essere effettuata (Figure 2A1-2A2), così come la comparsa di una cicatrice gliale (Figure 2B1-2B2). Il controllo negativo viene effettuata eseguendo la stessa chirurgia e iniezione colorante, ma senza l'esposizione alla fonte di luce fredda. La lesione è riproducibile in dimensione e posizione a tempi diversi dopo la lesione (Figure 3A-3B). L'area infartuale in genere raggiunge la sua dimensione massima di 4-6 ore dopo l'iniezione di Rosa Bengala 14 e, successivamente, riduce rapidamente da 2 giorni a 4 giorni dopo photothrombosis. L'irraggiamento avviene negli strati più superficiali, ma grandi vasi negli strati corticali profondi potrebbe anche essere occluso causa dellacompressione provocata dalla lesione 7. È importante indagare la riproducibilità della lesione prima del trattamento perché la distribuzione di cervello microcircolo piale può variare tra animali di età o ceppo diverso.
Figura 1. Aspetto macroscopico della lesione photothrombotical nel CD1 topo cervello 4 giorni dopo photothrombosis.. Vista laterale e frontale AB. L'infarto superficiale (teste di freccia) appare come una regione bianca visibile ad occhio nudo. C. Il cervello è posizionata in affettatrice cervello e sezionato rapidamente in sezioni spesse 1 millimetro. DF. Misura della portata di infarto cerebrale può essere compiuta da colorazione TTC . Il tessuto necrotico all'interno della lesione trombotica è personaggiozato da assenza di colorazione. Fette coronali del cervello illustrato in AC sono rappresentati in rostrale per estensione caudale da D a F.
Figura 2. Evoluzione temporale rappresentativo di danni photothrombotic. Sezioni coronali di adulti C57BL / 6 cervello di topo sono state colorate con violetto cresolo. A1, A2. 7 giorni dopo la lesione di un elevato numero di cellule raccoglie al confine infarto. B1, B2. A 30 anni, il volume della lesione molto ridotta e cicatrice gliale sta formando. A2 e B2 sono rispettivamente alto ingrandimento di A1 e B1. Barre di scala: A1, B1: 1 mm; A2 B2: 0,5 mm.
Figura 3. Aspetto macroscopico del cervello a 2, 4 e 16 giorni dopo photothrombosis. A. microfotografie di cervelli PFA-perfusi, preparato per ulteriori analisi immunoistochimiche. La zona infartuata è evidenziato (linea tratteggiata). B. Confronto tra la superficie ai 2, 4 e 16 giorni dopo la lesione. n = 4 in ciascun gruppo. * P <0,05 (t di Student-test).
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Discussion
Le modifiche e sostituzioni
A causa del suo picco di assorbimento a 562 nm, un laser a luce verde da una lampada ad arco allo xeno filtrato è stato originariamente scelto per irradiare la fotosensibile Rosa Bengala. Sebbene eccitazione laser-mediata è stato ancora utilizzato recently5, esso può essere sostituito da lampada a luce fredda che anche garantire eccitazione colorante 10,15. Fibre ottiche a luce fredda sono più facili da manipolare e meno costoso di sorgenti laser. Tuttavia, va notato che i laser sono comunemente utilizzati per indirizzare singole arteriole superficiali dopo craniotomia per un recipiente in vivo-specifico coagulazione 10.
Consegna di colorante sensibile è compiuta solitamente tramite iniezione vena della coda, il che richiede un certo allenamento per ottenere risultati omogenei e riproducibili. Per contro, iniezione intraperitoneale è più facile da eseguire e Rosa Bengala è rilevabile nel flusso sanguigno pochi minuti dopo 13. Phototh Efficacerombosis può essere ottenuto eccitando il colorante 5 min dopo l'iniezione intraperitoneale 8, tuttavia dose elevata di Rosa Bengala intraperitoneale nel ratto ha mostrato che la concentrazione plasmatica del colorante continuano ad aumentare ancora di 60 min dopo somministrazione 13. Iniezione endovenosa infuso di Rosa Bengala può aumentare la riproducibilità della lesione 13, tuttavia questo modo di somministrazione può essere associata a ipotensione in caso l'infusione avviene troppo rapidamente (<1,5 min) o ad alta concentrazione di colorante 5. Per evitare fluttuazioni della pressione sanguigna, altre sostanze fotosensibili come Erythrosin B possono essere utilizzati per produrre vasi occlusioni, però questa molecola è considerata meno efficiente di Rosa Bengala per lo stesso intervallo di concentrazione 5.
Passaggi critici
Diversi fattori influenzano dimensione della lesione e profondità come la concentrazione del colorante sensibile, la latenza tra il colorante injection e illuminazione, l'intensità della sorgente di luce, il diametro della superficie illuminata, la durata dell'esposizione e la temperatura corporea durante e dopo la chirurgia. L'angolo della sorgente luminosa sul cranio può anche influenzare la forma dell'infarto. Una serie di esperimenti preliminari deve essere effettuata per testare la riproducibilità e di determinare la quantità minima di colorante e tempo di irradiazione che producono una lesione che colpisce selettivamente l'area di destinazione e / o ottenere deficit comportamentale significativa.
Limiti della tecnica
Questa tecnica è stata sviluppata al fine di imitare ictus umana inducendo l'aggregazione piastrinica, come osservato durante ischemia cerebrale 4. Danni Tuttavia photothrombotic leggermente diversa da corsa umana. Prima di tutto, trombosi è innescato in gran numero di navi nella zona illuminata, mentre ictus è generalmente causato da interruzione del flusso di sangue all'interno di una singola arteria terminale. ComeDi conseguenza, alcune regioni del cervello, il cui metabolismo è solo parzialmente supportata dal arteria subendo l'interruzione del flusso sanguigno sono inizialmente meno colpiti in quanto potrebbero ricevere rifornimento di sangue da arterie collaterali e non subire la morte delle cellule necrotiche. Al contrario il contorno ben definito prodotto da risultati photothrombosis in una penombra molto limitata, che è l'obiettivo principale di post-ischemia agenti neuroprotettivi. Inoltre, in un sottogruppo di pazienti con ictus, riperfusione avviene spontaneamente e può provocare danni secondari (ivi compreso il danno da riperfusione). Per studiare questo particolare aspetto della ischemia, modelli occlusione transitori sono più appropriate.
Il modello di infarto sé mostra alcune caratteristiche che differiscono da ictus umana. RM mostra uno sviluppo simultaneo del miocardio ischemico e l'edema vasogenico in larga lesione photothrombotic considerando che lo sviluppo del miocardio ischemico prevale edema vasogenico in humaN Corsa 16. Viceversa, photothrombosis può non essere adeguato per lo studio di studi agente anti-trombotici a causa del fatto che l'infarto photothrombotic verifica anche dopo il blocco di piastrine o inibizione della coagulazione pathway intrinseco 17. Infatti è stato suggerito che in condizioni particolari la coagulazione delle piastrine non fosse necessario occlusione photothrombotic in cui interruzione dell'integrità endoteliale indurrebbe edema e compressione dei vasi associati circostanti. Inoltre nella stessa analisi MRI studio non ha mostrato la modifica della dimensione dell'infarto dopo il blocco della funzione piastrinica o esaurimento delle piastrine 17.
Significatività rispetto ai metodi esistenti
Numerosi modelli ben standardizzate di ischemia permanente, transitoria, focale e globale, indotta meccanicamente o chimicamente, sono stati sviluppati nei roditori per imitare da vicino la corsa di fisiopatologia umana e di svip nuove strategie neuroprotettive. Il photothrombosis come presentato qui è un modello di ischemia focale permanente che induce coerente un pregiudizio corsa della dimensione desiderata in qualsiasi sito corticale o sottocorticale in maniera molto riproducibile e poco invasivo. Questo modello presenta un elevato tasso di sopravvivenza che che ha raggiunto il 100% nei nostri esperimenti (25 animali), mentre più ampi studi ottenuti 98,4% 18. La lesione photothrombotic può essere personalizzato in modo da interessare una precisa funzione in base alla zona di mira e di recupero comportamentale può essere valutata da prove multiple 6,19. Inoltre tale approccio non richiede molto tempo, pochi costoso e può essere appreso rapidamente in quanto non è tecnicamente impegnativo al contrario di altri modelli, compreso il modello filamento. Inoltre l'occlusione nave è ottenuta inducendo la formazione di trombi locale che sono strutturalmente simili a quelli osservati in corsa umana. Tuttavia, l'approccio photothrombotic stato anche adattato per producing occlusioni dell'arteria cerebrale media 20. Il modello di lesione anello è stato successivamente sviluppato in modo da ottenere una penombra più grande. Si compone di una illuminazione sotto la forma di un cerchio, al centro del quale regione corticale del tessuto vitale è circondata da un tessuto danneggiato circolare e condividere le caratteristiche biochimiche e molecolari del penombra ischemica 21,22. Varianti di tecnica sono disponibili per l'esecuzione di ictus nel cervello in via di sviluppo 23 o in tessuto sottocorticale 24 anche.
In conclusione, photothrombosis è un facile da eseguire modello ischemico con elevata riproducibilità. Inoltre, è adatto per un certo numero di studi sperimentali ictus, in particolare per la valutazione della plasticità corticale in risposta al danno cerebrale, sia a livello cellulare e molecolare.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo Annalisa Buffo per penetranti suggerimenti e commenti, e Maurizio Grassano, Marina Boido e Ermira Pajaj per le riprese. Questo lavoro è stato finanziato dal 7 ° PQ-MC-214.003-2 (Marie Curie Initial Training Network AXREGEN) e la Compagnia di San Paolo, progetto gliarep.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and chemicals | |||
| Rose Bengal | Sigma, Italy | 330000 | |
| Isoflurane Vet | Merial | 103120022 | |
| Betadine | Asta Medica | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Surgical material and equipment | |||
| Fluosorber Filter | Havard apparatus | 340415 | |
| 150W fiber optic illuminator | Photonic | PL3000 | |
| Temperature Controller for Plate TCAT-2DF | Havard apparatus | 727561 | |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51950 | |
| Operating microscope | Takagi | OM8 | |
| Heating pad | |||
| Oxygen and nitrogen gas | |||
| Surgery Tools | World precision instrument | Optic fiber taps and mask are custom-made | |
References
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