Photothrombotic虚：マウス脳卒中研究のための低侵襲かつ再現性の光化学皮質病変モデル

Summary

Photothrombosisは、再現性の高い方法で、興味のある分野での小よく区切り梗塞を誘発するための迅速、低侵襲技術です。これは、トランスジェニックマウスの脳の可塑性の根底にある細胞および分子応答を研究するために特に適している。

Abstract

photothromboticストロークモデルは、以前に注入された光感受性色素の光活性化によって与えられた皮質領域内虚血性損傷を誘発することを目指しています。照明続いて、色素が活性化され、その後の血小板凝集し、最終的に局所血流の中断を決定する血栓の形成、を、内皮細胞膜の損傷成分という一重項酸素を生成する。当初は1977年にローゼンブラムとエルSabbanによって提案されたこの手法は、後のラット脳内で1985年にワトソンによって改良と現行モデルの基礎を設定されていた。また、トランスジェニックマウス系統の可用性の向上、さらにphotothrombosisモデルの関心を高めるために貢献した。簡潔には、感光性染料（ローズベンガル）が腹腔内注射し、血流に入る。冷光源によって照射されたときに、色素が活性化になると、ローカルの結果、血小板の活性化および血栓症、内皮損傷を誘発する血流の中断。光源は、再現可能かつ非侵襲的な方法で、任意の目的の皮質領域のターゲティングを可能開頭の必要がなく無傷の頭蓋骨に適用することができる。マウスはその後縫合と目を覚ますために許可されています。虚血性損傷の評価が迅速トリフェニルテトラゾリウムクロリド又はクレシルバイオレット染色によって達成することができる。この技術は、正確なセルの特性又は機能的研究のために非常に有利で小型化と十分に区切られた境界の梗塞を生成する。また、トランスジェニックマウスにおける脳の可塑性の根底にある細胞および分子応答を研究するために特に適している。

Introduction

21世紀の初めには、虚血性脳卒中は、長期障害¹とストロークは、2004年²で約5,7万人が死亡を占めている死亡、世界中の第二の原因の第二の原因を表して壊滅的な疾患である。に入れ、多くの努力にもかかわらず、脳卒中後の機能回復を改善するために利用できる有効な治療法はまだありません。それらは虚血性障害の病態のモデル化を可能にし、in vivoで異なる神経保護戦略の有効性を試験するようにストロークの動物モデルが広くストローク研究の分野で使用されている。これらのモデルのほとんどは、他のモデルは、通常、特定の領域、モータと体性感覚野に小型の病変を研究するために開発されたのに対し、（一時的または恒久的に）中大脳動脈内の血流を遮断することによって広範な梗塞を誘発することを目指します。しかし、いくつかの要因は、ACを生成するために寄与することができる使用マウス系統を含む実験的な脳卒中の研究、の変動のertain度、すべての上に、研究に含まれており、動物の年齢や性別、技術は、虚血性損傷を誘発するために採用。後者の点に関しては、期間と侵襲手術（ つまり開頭術の必要性）だけでなく、確実に虚血性病変を誘発するために、オペレータに必要な外科的なスキルは、in vivo脳卒中研究で成功し、公平のための重要な決定要因である。

photothrombosisの概念は当初、1977年³ローゼンブラムとエルSabbanによって提案され、ワトソンらがラットの脳におけるそのアプリケーションによって有名になった1985年⁴技術が大幅に向上し、現在のモデル³の基礎を設定された^{- 6。} photothromboticアプローチは以前に血液系、WHに供給される光感受性色素の光活性化を介して皮質梗塞を誘発することを目的と光にさらされる地域では地元の血管血栓症におけるICH結果。循環色素が冷光源によって適切な波長で照射されるとき、それは順番に反応性の高い一重項酸素生成物を多量に生成した酸素分子にエネルギーを放出する。これらの酸素中間体は、血小板付着および凝集に、最終的に局所脳流れの中断^7を決定血栓の形成をもたらす、内皮細胞膜の過酸化を誘導する。

Photothrombosisは、それが普通の人間のストロークで発生しますが、光にさらされる分野での血流の選択的な中断、その結果より多くの表面的な血管に病変を誘発するような唯一の動脈を閉塞または破壊しない非正規虚血モデルである。この理由のため、このアプローチは、皮質可塑性の細胞および分子生物学的研究のために適切であり得る。この技術の主な利点は、実行のそのシンプルさに存在します。スクラブ2分;頭皮を剃るための1分;;定位固定装置に動物を配置し、3〜5分また、photothrombosisは簡単に20分待ち（麻酔のために3分を含む動物あたり約40分で行うことができ消毒液で頭皮、切開をし、頭蓋骨をきれいに、冷光ファイバを配置し、2〜4分;腹腔内拡散のために5分待ち、、ローズベンガル液を注入する1分、照明の15分、そして5分〜傷をきれいに）動物を縫合。さらに、全く手術専門知識は病変がそのまま頭蓋骨のシンプルな照明を通じて誘導されるように、この手法を実行するために必要ありません。古典的な動脈閉塞とは異なり、この方法では、照射されたゾーン内に軟膜と実質内微小血管閉塞の選択を決定しない側副血管の目標領域内に酸素を供給するために残っていないような病変間のばらつきを低減する。

その特定の性質にもかかわらず、photothrombotic被害株は不可欠なメカニズムは、脳行程で発生する。同様に、ヒト行程における動脈閉塞し、血小板凝集及び血栓の形成が照射領域⁷の血流の中断を決定する。同様に、このモデルはまた、中大脳動脈閉塞⁸のように本質的な炎症反応を共有しています。しかし、よくdelimitated境界、部分的に保存され代謝の領域に対応する半影ゾーンでは、photothrombotic病変の後に非常に低下したり、存在しないです。これは明確な境界線は、虚血性または無傷皮質領域内の細胞応答の研究を容易にすることができる。 Photothrombosisマウスモデルは、トランスジェニック動物の様々な研究のストロークに特に適している。確かにバイアス^9を引き起こす可能性が高い死亡率を報告した古典的なモデルはC57BL / 6マウス系統内の全株と長期研究に合わせることはできません。

Protocol

1。手術前

1. 1.5mlチューブにローズベンガルを秤量し、15 mg / mlの最終濃度に達するまで無菌食塩水に溶解する。 0.2μmのフィルターを通して滅菌をフィルタリングして、最大2ヶ月、室温で暗所に保管してください。
2. オートクレーブですべての手術器具を殺菌する。手術領域は、手術を開始する前に、1時間未満で消毒されるべきである。
3. 注入されるローズベンガルの投与量を調節するために、マウスの体重を記録します。我々は現在のプロトコルで12週齢の雌CD1マウスに10μlの/ gの動物体重を注入した。ローズベンガルの量は、所望の皮質病変の大きさを容易異なる投与量（典型的に2μlの/ gであり、5μlの/ g以上は10g /μlの体重）試験することによって予備実験の別個のセットを決定することができる生成するために必要とされる。注入されるローズベンガルの量は、特に実験条件、光源の種類に大きく依存することに留意使用され、露光の期間。本研究では、10グラム/液（150μgの/ g）の用量は、その他のグループは、報告されたのに対し、15分間露光によりphotothrombosisを誘導するのに必要であることが分かった50μgの/ gの^6,8および100μg/ml/ gのどちら¹⁰腹腔内注射はphotothrombotic病変を誘導するために十分であった。

2。麻酔の手順

1. 50％の透明な誘導室（誘導3.5から4パーセント、維持するための1.5から2パーセント）（v / v）のoxygen/50％（v / v）の一酸化二窒素ガス混合物中のイソフルランでマウスを麻酔。気体の麻酔動物の迅速なウェイクアップを可能にし、麻酔ガスのレベルを容易に調整することができる。また、マウスはまたケタミンキシラジン混合により麻酔することができます。
2. 深い麻酔に到達すると、誘導室から麻酔した動物を除去定位フレームに配置し、フェースマスクを用いて麻酔を維持する。 isofluraを調整十分な麻酔レベルを達成するためにね線量。手続き全体の呼吸速度を監視し、それが一定である（40 - 毎分60回の呼吸）を確認してください。
3. 動物が深く麻酔であることを確認するために、つま先のピンチを使用してください。
4. 乾燥から目を防ぐために、眼軟膏を適用する。
5. 優しく外科手術全体の温度を監視するために直腸プローブを挿入します。 37℃でのマウスの体温を維持するための関連するフィードバック制御加熱パッド±0.5℃に設定する

3。対象領域の照明のための手術

1. 電気かみそりでマウスの頭皮を剃る。
2. しっかりと頭を保護し、外部の道に耳棒を挿入します。損傷鼓膜ないように注意してください。
3. 綿棒を使用して、70％エタノールおよびベタジンのスワイプを交互に表面に皮膚を消毒する。
4. 目ルから正中線に沿って切開をするメスを使用首までVEL。頭蓋骨を露出保つために皮膚のリトラクタを適用します。
5. 優しくメスで頭蓋骨の端に骨膜を撤回し、頭蓋骨の表面は滅菌綿棒を使用して乾燥させます。ブレグマとラムダを識別します。基準点としてブレグマたガラスマイクロピペットを置き、その後、興味のある領域の座標に移動します。この記事のために選択された関心領域は、ほぼ丸く形ですブレグマへ横約2mmを中心に、そしてフランクリンによるマウス脳アトラスによると感覚運動皮質の大部分を含む約30mm ²の領域をカバーし、 Paxinos ^11。
6. 基準点と利益の位置をマークし、光の散乱を防ぐため、それに圧力を発揮しないように注意を払うために頭蓋骨の表面に密着して光ファイバを置く。照射領域は光ファイバーGUIの先端に小さなアパーチャまたはキャップを頭蓋骨にマスクを適用することによって制限することができますデ。

4。ローズベンガルインジェクションとアクティベーション

1. 1ミリリットルの注射器にローズベンガルソリューションをロードし、体重を10μl/ gでの投与量に応じて注入される量を計算。
2. 遅い腹腔内注射に進みます。
3. 染料拡散しましょう​​と、血流を入力してください。 5分後、冷光照明に切り替える。光の他のソースによって動物の照明を避けてください。私たちは、150 Wの強さの光ファイバ照明器を使用していました。
4. 照射の15分後、露光を停止し、創傷を縫合。照明分は既に心筋梗塞を生成し、10分で最大効果^12を得るのに十分である可能性が高い。ばらつきを最小限にするために、我々は15分間照射することを選択する。

5。縫合

1. 皮膚トラクターを取り外し、脱水症状を避けるために、滅菌生理食塩水を適用します。
2. 逆切断needlを使って傷を閉じるまでeとシルクやナイロン縫合糸。
3. 麻酔の配信を中断し、慎重に定位固定装置からマウスを削除して、それが完全に目を覚ましになるまで予め温め加熱パッドの上に置くと、そのケージに戻します。体温は、梗塞拡張の変動を制限するための手順全体を注意深く監視する必要があります。濃度および投与経路に従って、ベンガルはまだ¹³注射後数時間の血流を検出することができるローズ。潜在的な二次的な損害（ローズベンガル吸収波長は緑色スペクトルにある）を回避するために、温暖化ランプに加熱毛布を好む。

Representative Results

このプロトコルは、すでに肉眼（ 図1A-1C）の皮質の解剖時に表示されている皮質病変を生成します。 photothrombotic病変組織がローズベンガルの光活性化を可能にするために十分に透明である浅と深い皮質層に発症。脳梗塞の程度の測定を4％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定した後、新鮮な組織、あるいは、クレシルバイオレットによるトリフェニルテトラゾリウムクロリド（TTC）を用いて組織学的染色によって迅速に行うことができる。 TTCのインキュベーションの前に、新たに解剖脳は、脳スライサーに配置されており、厚さ1mmのスライス（ 図1C）に区分。梗塞領域が梗塞面積（ 図1D-1E）の正確な測定を可能にする、淡い現れるのに対し、TTCは赤で無傷の組織にラベルを付けます。ペナンブラとして定義された不完全な虚血のゾーンは、病変の大きさに応じて非常に減少もしくは存在しないです。

同様に、クレシルバイオレット染色は紫染色周囲の組織に比べて染色梗塞領域の識別を可能にします。反応性増殖と細胞浸潤は（病変に続く最初の週の間に発生している）また、同様にグリア瘢痕（ 図2B1-2B2）の出現として、（ 図2A1-2A2）評価することができる。陰性対照は、同じ手術や染料注入を行うことにより、しかし冷光源に曝露することなく行われる。病変は病変後の異なる時点（ 図3A-3B）でサイズと位置に再現性がある。梗塞領域は、一般的にローズベンガル注射¹⁴後4〜6時間で最大サイズに達し、その後、2日から4日後photothrombosisに迅速に軽減します。照射は、より浅層に発生しますが、深い皮質層で大型船も原因の閉塞されることがあり病変⁷によって引き起こさ圧縮。脳軟膜微小血管の分布が異なる年齢や株の動物の間で変えることができるので、治療の前に病変の再現性を調べることが重要です。

図1。 4日間photothrombosis後CD1マウス脳におけるphotothrombotical病変の巨視的外観。AB。側面と正面。表面的な心筋梗塞（矢頭）は肉眼に見える白色の領域として表示されます。C.は、脳が脳スライサーに配置し、厚さ1mmのセクションに速やかに区分されている。DF。脳梗塞の程度の測定はTTC染色することによって達成することができる。血栓性病変内の壊死組織は文字です染色の欠如によって局所化。 ACに示す脳の冠状切片をDからFまで尾延長に吻側で表されます。

図2。 photothrombotic損傷の代表的時間発展。成体C57BL / 6マウス脳の冠状切片は、クレシルバイオレットで染色した。A1、A2。 7日間損傷後の細胞の数が多い梗塞境界で収集します。B1は、B2を 。 30で、病変体積は非常に減少し、グリア瘢痕が形成されています。A2とB2はそれぞれA1とB1の高倍率です。スケールバー：A1、B1：1ミリメートル; A2 NG>、B2：0.5ミリメートル。

図3。 2での脳の巨視的外観は、photothrombosis後4〜16日。PFA-灌流脳のA.顕微鏡写真は、さらに免疫組織学的分析のために用意しました。梗塞領域（破線）がハイライトされている。B.、病変後2,4及び16日目の表面積の比較。各群n = 4。 * P <0.05（スチューデントのt検定）。

Discussion

修正や代用

なぜなら562 nmでの吸収ピークから、濾過キセノンアークランプからの緑色光レーザーは、もともと感光ローズベンガルを照射するように選ばれた。レーザー媒介励起がまだrecently5を用いたが、それはまた、色素の励起^10,15を確実に冷光ランプに置き換えることができます。冷光光ファイバは、レーザー光源より操作しやすく、安価である。しかし、レーザーは、一般的に生体内で血管固有凝固¹⁰のため開頭後に個々の表面の細動脈を標的とするために使用されていることに気づいたことがあります。

感受性色素の送達は、通常、均一で再現性のある結果を得るためのいくつかの訓練を必要と尾静脈注射によって達成される。対照的に、腹腔内注射によって行うことが容易で、ローズベンガル、数分¹³後の血流中の検出可能である。実効photothrombosisを色素5分間腹腔内注射した後^、8励磁することによって達成することができる、ラットにおけるローズベンガルしかしながら高い腹腔内投与量は、色素の血漿濃度は、投与後¹³でも、60分を増加し続けることを示した。ローズベンガルの注入静脈注射は、しかし、この投与方法は点滴があまりにも急速に（<1.5分）、または高色素濃度⁵で実行された場合に低血圧に関連付けることができ、病変¹³の再現性を高めることができます。血圧の変動を回避するため、例えば、エリスロシンBのような他の感光物質が血管の閉塞を生成するために使用することができるが、この分子は、濃度⁵同じ範囲のためのローズベンガルより効率考えられる。

重要なステップ

さまざまな要因は、このような感受性色素の濃度として病変の大きさと深さ、染料injecti間の待ち時間に影響を与えるオンと照明光源の強度、手術中および後の賢明な表面は、露光期間及び体温の直径。頭蓋骨上の光源の角度はまた、梗塞の形状に影響を与えることができる。予備実験一連の再現性をテストし、選択的に標的領域に影響を及ぼす病変を生成および/または意味のある行動の欠損を取得染料と照射時間の最小量を決定するために行われるべきである。

技術の限界

この技術は、脳虚血⁴の間に観察された血小板凝集を誘導することによって、人間の脳梗塞を模倣するために開発された。しかしphotothromboticダメージは少し人間のストロークとは異なります。ストロークは通常、単一の端末動脈内の血流の中断によって引き起こされるのに対し、まず、血栓症は、照明領域における血管多数のトリガされる。としてこれにより、代謝部分的にのみ血流の中断を経動脈に支持されている脳の一部の地域では、最初に、それらが副動脈により血液供給を受けることができ、壊死性細胞死を起こさないように患部以下である。非常に限られた半影でphotothrombosis結果によって生成された、明確に定義された境界の反対で、それは虚血後神経保護薬の主なターゲットです。また、脳卒中患者のサブセットで、再灌流は、自発的に発生し、二次被害を（再灌流障害を含む）を引き起こす可能性があります。虚血のこの特定の側面を研究するために、一時的な閉塞モデルがより適切である。

梗塞自体のパターンは人間のストロークとは異なるいくつかの特性が表示されます。虚血性梗塞の開発はフーマーにおける血管原性浮腫に優先するのに対し、MRIは大きなphotothrombotic病変における虚血性梗塞と血管原性浮腫の同時開発を示していますnはストローク^16。逆に、photothrombosisはphotothrombotic梗塞が血小板または内因性凝固経路¹⁷の阻害のブロッキング後にも発生しているという事実に起因する抗血栓剤研究の研究のために十分でないかもしれません。確かにそれが独特の条件で血小板凝固が周囲の血管の浮腫と関連する圧縮を誘発する内皮インテグリティのどの混乱にphotothrombotic閉塞する必要はなかったことが示唆されている。また同じ研究MRI解析で血小板¹⁷の血小板機能や枯渇の遮断後に梗塞サイズの変更を示さなかった。

既存の方法に関して意義

、永久的な一過性、焦点と虚血の多数のよく標準化されたモデルは、機械的又は化学的に誘発され、密接に人間の脳卒中の病態を模倣し、develoにするために、げっ歯類で開発されたP新しい神経保護戦略。ここで提示されるようphotothrombosisは一貫非常に再現性と低侵襲な方法で任意の皮質や皮質下のサイトに必要なサイズのストローク傷害を誘発する恒久的な局所的虚血のモデルである。このモデルは、より広範な研究が98.4パーセント^18を取得している間（25匹）我々の実験では100％に達したことを、高い生存率を示しています。 photothrombotic病変は、複数のテスト^6,19によって評価することができる対象地域と行動回復に応じて正確な機能に影響を及ぼすために、カスタマイズすることができる。さらに、この方法は、高価で時間のかかる、いくつかではなく、フィラメントモデルなどの他のモデルとは対照的に、それは技術的に要求していないので迅速に学習することができる。また血管閉塞は、ヒト行程で観察されたものと構造的に類似している血栓の局所形成を誘導することによって達成される。しかし、photothromboticアプローチもPRのために適合された中大脳動脈²⁰のoducing閉塞。リング病変モデルは、後でより大きい半影を得るために開発された。これは、実行可能な組織の皮質領域が円形の損傷した組織に囲まれており、虚血性ペナンブラ^21,22の生化学と分子特性を共有しているの中心に、円の図形の下照明で構成されています。技術の亜種は脳の発達²³や皮質下組織²⁴でストロークを実行するためにも利用できます。

結論として、photothrombosisは、高い再現性虚血モデルを実行することは容易である。また、両方の細胞および分子レベルで、脳損傷に応答して、特に皮質可塑性の評価のために、実験的脳梗塞の多くの研究に適している。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions and chemicals
Rose Bengal	Sigma, Italy	330000
Isoflurane Vet	Merial	103120022
Betadine	Asta Medica
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Surgical material and equipment
Fluosorber Filter	Havard apparatus	340415
150W fiber optic illuminator	Photonic	PL3000
Temperature Controller for Plate TCAT-2DF	Havard apparatus	727561
Stereotaxic Instrument	Stoelting	51950
Operating microscope	Takagi	OM8
Heating pad
Oxygen and nitrogen gas
Surgery Tools	World precision instrument		Optic fiber taps and mask are custom-made