Summary
Fototrombose é uma técnica rápida, minimamente invasiva para induzir pequena e bem delimitada infarto em áreas de interesse de maneira altamente reprodutível. É particularmente adequado para o estudo de respostas celulares e moleculares subjacentes plasticidade cerebral em ratinhos transgénicos.
Abstract
O modelo de acidente vascular cerebral photothrombotic visa induzir um dano isquêmico dentro de uma determinada área cortical, por meio de foto-ativação de um corante sensível à luz anteriormente injetado. Após iluminação, o corante é activado e produz oxigénio singuleto que danifica os componentes das membranas das células endoteliais, com subsequente agregação de plaquetas e formação de trombos, a qual, eventualmente, determina a interrupção do fluxo sanguíneo local. Esta abordagem, inicialmente proposto por Rosenblum e El-Sabban em 1977, foi posteriormente melhorado por Watson em 1985, em cérebro de rato e definir a base do modelo atual. Além disso, o aumento da disponibilidade de linhas de camundongos transgênicos contribuiu ainda mais para aumentar o interesse no modelo fototrombose. Resumidamente, um corante fotossensível (Rosa de Bengala) é injectado intraperitonealmente e entra na corrente sanguínea. Quando iluminada por uma fonte de luz fria, o corante torna-se activada e induz lesão endotelial com a activação de plaquetas e trombose, resultando em locaisinterrupção do fluxo sanguíneo. A fonte de luz pode ser aplicada sobre o crânio intactos, sem necessidade de craniotomia, o que permite direccionamento de qualquer área cortical de interesse de uma forma reprodutível e não-invasiva. O rato é então suturada e permitiu acordar. A avaliação do dano isquémico pode ser rapidamente realizada por cloreto de trifenil-tetrazólio e de coloração com violeta cresil. Esta técnica produz enfarte de pequena dimensão e aos limites bem delimitadas, o que é altamente vantajosa para a caracterização de células precisas ou estudos funcionais. Além disso, é particularmente adequado para estudar as respostas celulares e moleculares subjacentes plasticidade cerebral em ratinhos transgénicos.
Introduction
No início do século 21, acidente vascular cerebral isquêmico é uma doença devastadora que representa a segunda causa de incapacidade a longo prazo e uma a segunda causa de mortalidade no mundo, no qual AVC foi responsável por aproximadamente 5,7 milhões de mortes em 2004 2. Apesar dos muitos esforços que foram colocadas em, ainda não existe um tratamento eficaz disponível para melhorar a recuperação funcional após o acidente vascular cerebral. Os modelos animais de acidente vascular cerebral são amplamente utilizados no campo da pesquisa do curso, pois permitem a modelagem da patofisiologia da lesão isquémica e testar a eficácia de diferentes estratégias neuroprotectoras in vivo. A maioria destes modelos visam induzir infartos extensos, interrompendo (temporariamente ou permanentemente) o fluxo de sangue dentro da artéria cerebral média, enquanto que outros modelos foram desenvolvidos para o estudo de lesões de pequeno porte em áreas específicas, normalmente o motor eo córtex somatossensorial. No entanto, vários fatores podem contribuir para gerar acertain grau de variabilidade no curso estudos experimentais, incluindo a estirpe de ratinhos utilizada, a idade e o sexo dos animais incluídos no estudo e, acima de tudo, a técnica utilizada para induzir o dano isquémico. No que diz respeito a este último ponto, a duração e invasividade da cirurgia (isto é, a necessidade de uma craniotomia), assim como a habilidade cirúrgica necessária para o operador para induzir lesão isquémica de forma confiável são determinantes críticos para o sucesso e imparcial em estudo in vivo AVC .
O conceito de fototrombose foi inicialmente proposto por Rosenblum e El-Sabban em 1977 3 e tornou-se famoso pela sua aplicação em cérebro de rato por Watson et al, em 1985, 4 em que a técnica foi amplamente melhorado e definir a base do atual modelo 3. - 6. A abordagem photothrombotic visa induzir um infarto cortical através da foto-ativação de um corante sensível à luz anteriormente entregue no sistema sanguíneo, which resulta em trombose de vasos local nas áreas expostas à luz. Quando o corante é iluminado circulando no comprimento de onda apropriado através de uma fonte de luz fria, liberta energia para as moléculas de oxigénio, o que, por sua vez, geram uma grande quantidade de produtos de oxigénio singlet altamente reactivos. Estes intermediários de oxigénio induzem a peroxidação da membrana de células endoteliais, que conduz à adesão e agregação plaquetária, e, eventualmente, para a formação de trombos, que determina a interrupção do fluxo local cerebral 7.
Fototrombose é um modelo de isquemia não-canônico que não obstruir ou quebrar apenas uma artéria como normalmente acontece em acidente vascular cerebral humano, mas provoca lesões nos vasos mais superficiais, o que resulta em interrupção seletiva do fluxo de sangue nas áreas expostas à luz. Por esta razão, esta abordagem pode ser adequada para estudos celulares e moleculares da plasticidade cortical. A principal vantagem desta técnica reside na sua simplicidade de execução.Além disso, fototrombose pode ser facilmente realizado em cerca de 40 minutos por animal, incluindo a vinte minutos de espera (3 min para a anestesia, 1 min para raspar o couro cabeludo; 3 a 5 min a colocar o animal no aparelho estereotáxico, 2 min para esfregar a couro cabeludo com solução anti-séptica, fazer uma incisão e limpar o crânio; 2 a 4 min para colocar a fibra de luz fria, 1 min para injetar a solução de rosa de bengala, 5 min-espera para a difusão intraperitoneal, 15 min de iluminação, e 5 min para limpar a ferida e sutura do animal). Além disso, nenhum perícia cirúrgica é necessário para realizar esta técnica quanto à lesão é induzida através de simples iluminação do crânio intactos. Ao contrário de oclusão arterial clássica, este método determina oclusões seletivos de microvasos pial e intraparenquimatosa dentro da zona irradiada e reduz a variabilidade entre as lesões que nenhum navio garantia é deixada para fornecer oxigênio na área alvo.
Apesar de sua natureza particular, oações danos photothrombotic mecanismos essenciais que ocorrem em acidente vascular cerebral. Similarmente à oclusão da artéria, em acidente vascular cerebral humano, a agregação de plaquetas e formação de coágulos de determinar a interrupção do fluxo de sangue na área irradiada 7. Do mesmo modo, este modelo também partes essenciais de respostas inflamatórias em oclusão da artéria cerebral média 8. No entanto, por causa dos limites bem delimitada, a zona de penumbra, o que corresponde a uma área de metabolismo parcialmente preservada, é muito reduzida ou inexistente após uma lesão photothrombotic. Esta fronteira clara pode facilitar o estudo de respostas celulares dentro isquêmico ou intacto área cortical. Modelo do rato Indocianina é particularmente adequada para estudos de acidente vascular cerebral em uma variedade de animais transgénicos. Na verdade os modelos clássicos não pode caber para todas as cepas e estudos de longo período na linhagem C57BL / 6 rato relataram uma alta taxa de mortalidade que pode causar viés 9.
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Protocol
1. Pré-cirurgia
- Pesar Rose Bengal em um tubo de 1,5 ml e dissolvem-se em solução salina estéril até atingir uma concentração final de 15 mg / ml. Filtrar através de um filtro de esterilização de 0,2 um e armazenar no escuro à temperatura ambiente até dois meses.
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em autoclave. A área cirúrgica deve ser higienizado menos de uma hora antes do início da cirurgia.
- Anote o peso do corpo do mouse para ajustar a dose de Rosa Bengala para ser injetado. Nós injetado 10 ml / g de peso de animais em mulheres camundongos CD1 12 semanas de idade, no presente protocolo. A quantidade de Rosa de Bengala necessária para produzir o tamanho de lesões corticais desejada pode ser facilmente determinada de um conjunto separado de experiências preliminares, testando diferentes doses (tipicamente de 2 ul / g, 5 ul / g ou 10 ml / g de peso corporal). Note-se que a quantidade de Rosa de Bengala a ser injectado é altamente dependente das condições da experiência, em particular do tipo de fonte de luzutilizado e da duração da exposição à luz. No presente estudo, 10 ul / g (150 ug / g), a dose foi considerado necessário para induzir fototrombose após exposição à luz durante 15 minutos, ao passo que outros grupos relataram que, ou 50 ug / g de 6,8 e 100 mg / g 10 de injecção intraperitoneal era suficiente para induzir uma lesão photothrombotic.
2. Procedimento anestésico
- Anestesiar ratos com isoflurano numa câmara de indução transparente (3,5-4% para indução, 1,5-2% para manutenção) em 50% (v / v) oxygen/50% (v / v) de mistura de gás de monóxido de diazoto. Anestesia gasosa permite uma rápida wake up dos animais eo nível de gás anestésico pode ser ajustado facilmente. Alternativamente, os ratinhos podem também ser anestesiados com uma mistura de cetamina-xilazina.
- Quando é atingida anestesia profunda, remover o animal anestesiado e a partir da câmara de indução, coloque-o na moldura estereotáxica e manter a anestesia utilizando uma máscara facial. Ajuste o isoflurane dose para atingir um nível de anestesia adequada. Monitorar a taxa de respiração durante todo o procedimento e verifique se ele é constante (40 - 60 respirações por minuto).
- Use pitadas toe, a fim de assegurar que o animal é anestesiado profundamente.
- Aplicar pomada ocular, a fim de evitar que os olhos sequem.
- Suavemente inserir a sonda rectal para monitorizar a temperatura durante os procedimentos cirúrgicos. Definir a almofada de aquecimento controlada por realimentação associado para manter a temperatura do corpo do rato, a 37 ± 0,5 ° C.
3. Cirurgia para iluminação da área de destino
- Raspar o couro cabeludo do rato com um barbeador elétrico.
- Fixe de forma segura a cabeça e coloque as barras de ouvido em meato externo. Tenha cuidado para não danificar os tímpanos.
- Desinfectar a pele sobre a superfície com furtos de etanol a 70% e betadine usando cotonetes alternada.
- É um bisturi para fazer uma incisão na linha média do olho level até o pescoço. Aplicar afastadores para manter a pele do crânio exposta.
- Suavemente retrair o periósteo às bordas do crânio com um bisturi e deixar secar a superfície do crânio com cotonetes de algodão estéril. Identificar o bregma e lambda. Coloque uma micropipeta de vidro no bregma como ponto de referência, em seguida, movê-lo para as coordenadas da sua região de interesse. A região de interesse escolhido para este artigo é aproximadamente em forma redonda, centrada aproximadamente 2 mm lateral ao bregma, e que cobre uma área de cerca de 30 mm 2, que inclui uma grande parte do córtex sensorimotor de acordo com o atlas do cérebro do rato e por Franklin Paxinos 11.
- Marque a posição de interesses com pontos de referência e colocar uma fibra óptica em estreito contacto com a superfície do crânio para evitar o espalhamento de luz, mas preste atenção para não exercer pressão sobre ele. A área de iluminação pode ser limitada pela aplicação sobre o crânio de uma máscara com uma pequena abertura ou uma tampa na extremidade da fibra óptica guide.
4. Rosa Bengala Injection e Ativação
- Carregar a solução Rosa Bengala, numa seringa de 1 ml e calcular a quantidade a ser injectado de acordo com uma dose de 10 ml / g de peso corporal.
- Proceder a uma injeção intraperitoneal lento.
- Deixe o difuso corante e entrar na corrente sanguínea. Após 5 min, ligar o iluminador luz fria. Evitar a iluminação do animal por qualquer outra fonte de luz. Usamos iluminador de fibra óptica de 150 W intensidade.
- Após 15 min de iluminação, parar a exposição à luz e suturar a ferida. Cinco minutos de iluminação já produzem infarto e 10 min é provável que suficiente para obter um efeito máximo 12. A fim de minimizar a variabilidade, que escolhemos para iluminar por 15 min.
5. Sutura
- Remova os afastadores de pele e aplicar solução salina estéril para evitar a desidratação.
- Fechar a ferida usando needl corte reversoe de seda ou fio de sutura nylon.
- Interromper a entrega de anestesia, retire cuidadosamente o mouse do aparelho estereotáxico e colocá-lo em uma almofada de aquecimento pré-aquecido até que esteja totalmente desperto, em seguida, devolvê-lo à sua jaula. A temperatura do corpo devem ser cuidadosamente monitorizados durante os procedimentos para limitar a variabilidade da extensão do infarto. De acordo com a concentração e a via de administração, Rosa Bengala pode ainda ser detectado na corrente sanguínea, durante várias horas após a injecção 13. Prefere o cobertor de aquecimento para lâmpada de aquecimento para evitar possíveis danos secundários (Rosa Bengala absorção de comprimento de onda está no espectro verde).
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Representative Results
Este protocolo irá produzir uma lesão cortical que já é visível após dissecação do córtex para o olho nu (Figuras 1A-1C). A lesão photothrombotic desenvolve em superficiais e profundas camadas corticais em que o tecido é suficientemente transparente para permitir a foto-ativação da Rosa Bengala. Medição do grau de enfarte cerebral pode ser realizada rapidamente através de coloração histológica com cloreto de trifenil-tetrazólio (TTC) em tecido fresco ou de violeta cresil, após fixação em 4% de paraformaldeído (PFA). Antes TTC incubação, o cérebro recentemente dissecados, está posicionado num cortador de cérebro e seccionados em fatias de 1 mm de espessura (Figura 1C). TTC rotula tecido intacto em vermelho ao passo que a região enfartada aparece pálida, o que permite uma medição precisa da área de enfarte (figuras 1D-1E). A zona de isquemia incompleta definido como penumbra é muito reduzida ou inexistente em função da dimensão da lesão.
Do mesmo modo, a coloração com violeta cresil permite a identificação de áreas de infarto não corados, em comparação com o tecido circundante manchado de roxo. A proliferação de células e infiltração reactiva (que ocorre durante a primeira semana após a lesão), também podem ser avaliadas (Figuras 2A1-2A2), assim como o aparecimento de uma cicatriz glial (Figuras 2B1-2B2). O controlo negativo é efectuado realizando a mesma cirurgia e a injecção de corante, mas sem a exposição à fonte de luz fria. A lesão é reprodutível em tamanho e localização a diferentes pontos de tempo após a lesão (Figuras 3A-3B). A área de infarto geralmente atinge seu tamanho máximo de 4 a 6 horas após a injeção de Rosa Bengala 14 e, posteriormente, reduz rapidamente a partir de 2 dias a 4 dias após fototrombose. A irradiação ocorre nas camadas mais superficiais, mas grandes vasos em camadas corticais profundas pode também ser tapada por causa dacompressão provocada pela lesão 7. É importante investigar a reprodutibilidade da lesão antes do tratamento, porque a distribuição de pial microvasculatura cerebral pode variar entre os animais de idade ou outra estirpe.
Figura 1. Aspecto macroscópico da lesão photothrombotical no CD1 rato cérebro 4 dias após AB. Vista lateral e frontal fototrombose.. O enfarte superficial (setas) aparece como uma região branco visível a olho nu. C. O cérebro está posicionado em fatiador cérebro rapidamente e seccionados em milímetros de espessura 1. DF. Medição do grau de enfarte cerebral pode ser conseguida por coloração de TTC . O tecido necrosado dentro da lesão trombótica é o caráterzada pela ausência de coloração. Fatias coronais do cérebro ilustrado na AC estão representados na extensão rostral caudal de D a F.
Figura 2. Evolução temporal representante do dano photothrombotic. Cortes coronais de adulto C57BL / 6 cérebro de camundongos foram coradas por violeta cresil. A1, A2. 7 dias após a lesão de um elevado número de células reúne, na fronteira do enfarte. B1, B2. Em 30, o volume da lesão altamente reduzido e formação de cicatriz glial é. A2 e B2 são alta ampliação de A1 e B1, respectivamente. Barras de escala: A1, B1: 1 mm, A2 B2: 0.5 mm.
Figura 3. Aspecto macroscópico do cérebro aos 2, 4 e 16 dias após fototrombose. A. microfotografias de cérebros PFA-perfundidos, preparados para análise imuno. A área enfartada é destacada (linha a tracejado). B. Comparação da área de superfície em 2, 4 e 16 dias após a lesão. n = 4 em cada grupo. * P <0,05 (teste t de Student 's).
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Discussion
As modificações e substituições
Por causa de seu pico de absorção em 562 nm, um laser de luz verde de uma lâmpada de arco de xenônio filtrada foi originalmente escolhido para irradiar o fotossensível Rosa Bengala. Apesar da excitação do laser ainda mediada recently5 foi utilizado, pode ser substituída pela lâmpada de luz fria também assegurar excitação corante 10,15. Fibras ópticas de luz fria são mais fáceis de manipular e menos dispendiosa do que as fontes de laser. No entanto, deve ser notado que os lasers são comumente usados para atingir arteríolas superficiais individuais após craniotomia para testes in vivo específica de coagulação vaso-10.
Entrega de corante sensível é realizado geralmente através de injecção na veia da cauda, o que requer alguma formação para a obtenção de resultados reproduzíveis e homogéneas. Em contraste, a injecção intraperitoneal é mais fácil de executar e Rose Bengal é detectável na corrente sanguínea após alguns minutos 13. Phototh eficazrombosis pode ser conseguida por excitar o corante de 5 minutos após a injecção intraperitoneal 8, no entanto intraperitoneal de doses elevadas de Rose Bengal em ratos mostraram que a concentração de plasma do corante continuar a aumentar até 60 min após a administração 13. Infusão intravenosa de Rose Bengal pode aumentar a reprodutibilidade da lesão 13, no entanto, este modo de administração pode ser associado a hipotensão no caso da infusão é realizada demasiado rapidamente (<1,5 min) ou em elevada concentração de corante 5. Para evitar flutuações na pressão do sangue, outras substâncias fotossensíveis, tais como Eritrosina B pode ser usado para produzir recipientes oclusões, no entanto esta molécula é considerado menos eficiente do que a Rose Bengal para a mesma gama de concentração de 5.
Etapas críticas
Diferentes factores que afectam o tamanho da lesão e profundidade, tais como a concentração do corante sensível, a latência entre o corante injectie em iluminação, a intensidade da fonte de luz, o diâmetro da superfície iluminada, a duração da exposição e a temperatura do corpo durante e após a cirurgia. O ângulo da fonte de luz no crânio também pode influenciar a forma do enfarte. Uma série de experiências preliminares deve ser realizado para testar a reprodutibilidade e para determinar a quantidade mínima de corante e tempo de irradiação, que produzem uma lesão que afecta selectivamente a área-alvo e / ou obter défice comportamental significativa.
Limitações da técnica
Esta técnica foi desenvolvida de modo a imitar a acidente vascular cerebral humano através da indução da agregação de plaquetas como observado durante isquemia cerebral 4. No entanto danos photothrombotic ligeiramente diferente do curso humano. Primeiro de tudo, a trombose é desencadeada em grande número de embarcações na área iluminada, enquanto o curso é normalmente causada pela interrupção do fluxo de sangue dentro de uma artéria de um único terminal. ComoEm conseqüência, algumas regiões do cérebro, cujo metabolismo é parcialmente suportado pela artéria sofrer a interrupção do fluxo sanguíneo são inicialmente menos afetados, pois podem receber suprimento de sangue pelas artérias colaterais e não sofrem morte celular por necrose. Ao contrário do limite bem definido produzido por resultados fototrombose em uma penumbra muito limitada, que é o principal alvo dos agentes neuroprotetores pós-isquemia. Além disso, em um subconjunto de pacientes com AVC, a reperfusão pode ocorrer espontaneamente e provocar danos secundários (incluindo a lesão de reperfusão). Para estudar este aspecto particular da isquemia, os modelos de oclusão transiente são mais apropriadas.
O padrão de si enfarte exibe algumas características que diferem de acidente vascular cerebral humano. MRI mostra um desenvolvimento simultâneo do infarto isquêmico e edema vasogénico em grande lesão photothrombotic Considerando que o desenvolvimento do infarto isquêmico prevalece sobre edema vasogénico em human acidente vascular cerebral 16. Inversamente, fototrombose pode não ser adequado para o estudo de estudos um agente anti-trombóticos, devido ao facto de enfarte photothrombotic também ocorre após o bloqueio das plaquetas ou inibição da via de coagulação intrínseca 17. De facto, tem sido sugerido que, em condições peculiares a coagulação de plaquetas não era necessária para oclusão photothrombotic na qual disrupção da integridade endotelial poderiam induzir edema e compressão associado dos vasos circundantes. Além disso, no mesmo estudo, análise de ressonância magnética não mostrou alteração do tamanho do enfarte após o bloqueio da função das plaquetas ou depleção de plaquetas 17.
Significância em relação aos métodos existentes
Vários modelos bem padronizados de isquemia permanente, transiente, focal e global, mecanicamente ou quimicamente induzidos, foram desenvolvidos em roedores, a fim de imitar de perto a patofisiologia de acidente vascular cerebral humano e desenp novas estratégias neuroprotetoras. O fototrombose como aqui apresentado é um modelo de isquemia focal permanente que consistentemente induz uma lesão do derrame do tamanho desejado, em qualquer local cortical ou subcorticais de uma forma muito reprodutível e minimamente invasivo. Este modelo apresenta uma elevada taxa de sobrevivência que que chegou a 100% em nossos experimentos (25 animais), enquanto que estudos mais amplos obtido 98,4% 18. A lesão photothrombotic pode ser personalizado, a fim de afetar a função precisa de acordo com a área alvo e recuperação comportamental pode ser avaliada por vários testes 6,19. Além disso, esta abordagem não é demorado, caro e pouco pode ser aprendido mais rapidamente já que não é tecnicamente exigente, em oposição a outros modelos, incluindo o modelo de filamento. Além disso, a oclusão vascular é conseguido por induzir a formação local de trombos, que são estruturalmente semelhantes aos observados em acidente vascular cerebral humano. No entanto, a abordagem photothrombotic também foi adaptado para a producing oclusões da artéria cerebral média 20. O modelo da lesão anel foi desenvolvido mais tarde, a fim de obter uma penumbra maior. É constituída por uma iluminação sob a forma de um círculo, no centro da qual a região cortical do tecido viável é rodeado por um tecido danificado circular e partilham as características bioquímicas e moleculares da penumbra isquêmica 21,22. Variantes da técnica também estão disponíveis para a realização de acidente vascular cerebral no cérebro em desenvolvimento de 23 ou 24 no tecido subcortical.
Em conclusão, fototrombose é um fácil de executar modelo isquêmico com alta reprodutibilidade. Além disso, é adequado para um certo número de estudos experimentais tempos, em particular para a avaliação da plasticidade cortical em resposta à lesão cerebral, tanto ao nível celular e molecular.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos Annalisa Buffo para sugestões e comentários perspicazes, e Maurizio Grassano, Marina Boido e Ermira Pajaj para o tiroteio. Este trabalho foi financiado pelo FP7-MC-214003-2 (Marie Curie Initial Training Rede AXREGEN) e da Compagnia di San Paolo, o projeto gliarep.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and chemicals | |||
| Rose Bengal | Sigma, Italy | 330000 | |
| Isoflurane Vet | Merial | 103120022 | |
| Betadine | Asta Medica | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Surgical material and equipment | |||
| Fluosorber Filter | Havard apparatus | 340415 | |
| 150W fiber optic illuminator | Photonic | PL3000 | |
| Temperature Controller for Plate TCAT-2DF | Havard apparatus | 727561 | |
| Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51950 | |
| Operating microscope | Takagi | OM8 | |
| Heating pad | |||
| Oxygen and nitrogen gas | |||
| Surgery Tools | World precision instrument | Optic fiber taps and mask are custom-made | |
References
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