Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من Published: June 7, 2013 doi: 10.3791/50371
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Plant Biology and Zürich-Basel Plant Science Center, University of Zürich

Summary

ونحن التقرير وسيلة فعالة وبسيطة لعزل الأجنة في المراحل الأولى من التطوير من

Abstract

في النباتات المزهرة، الجنين يتطور داخل الأنسجة مغذية - السويداء - محاطة integuments البذور الأمهات (أو معطف البذور). ونتيجة لذلك، وعزل الأجنة النباتية في المراحل المبكرة (1 الخلية إلى مرحلة كروي) يمثل تحديا تقنيا بسبب عدم إمكانية الوصول النسبية. هو ضعف كفاءة تشريح دليل في المراحل الأولى بقوة من قبل صغر حجم بذور نبات الأرابيدوبسيس الشباب والإلتصاق من الجنين إلى الأنسجة المحيطة بها. هنا، نحن تصف طريقة التي تسمح للعزلة كفاءة الأجنة نبات الأرابيدوبسيس الشباب، مما أسفر حتى 40 الأجنة في 1 ساعة إلى 4 ساعات، اعتمادا على تطبيق المصب. يتم الإفراج الأجنة في عازلة العزلة عن طريق سحق البذور قليلا 250-750 مع مدقة البلاستيك في أنبوب إيبندورف. كوب microcapillary تعلق إما مختبر ماصة القياسية (عن طريق أنبوب المطاط) أو يتم استخدام microinjector التحكم هيدروليكيا لجمع الأجنة من مكان قطراتد على شريحة متعددة أيضا على ضوء المجهر المقلوب. المهارات الفنية المطلوبة هي بسيطة وقابلة للنقل بسهولة، والإعداد الأساسية لا تتطلب معدات مكلفة. الأجنة التي تم جمعها هي مناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب مثل RT-PCR، RNA تسلسل، تحليلات الحامض النووي، مضان التهجين في الموقع (FISH) في، المناعية، ومراسل المقايسات الجينات.

Introduction

ويحيط الجنين من النباتات المزهرة من السويداء، والأنسجة الغذائية المستمدة من حدث الإخصاب الثانية. ويحيط كل من الجنين والسويداء من قبل عدة طبقات الخلية من معطف البذور. هذه الأنسجة بشكل جماعي تشكيل البذور، التي تنمو داخل الفاكهة. وبالتالي، يعانون من ضعف الأنسجة وتحليلات خلية محددة من الأجنة نبات الأرابيدوبسيس بشدة بسبب عدم إمكانية الوصول لها. ومع ذلك، الأجنة في المراحل المتأخرة كروي أو في وقت لاحق نسبيا قابلة جيدا لتشريح اليدوي باستخدام الإبر التنغستن غرامة بموجب stereomicroscope، أو عن طريق تطبيق ضغط طفيف على البذور باستخدام ملقط لاستخراجها. واستخدمت هذه التقنيات بنجاح لTranscriptome على تحليلات أو التنميط epigenome مثل تهجين ميكروأري، التسلسل بيسلفيت، أو الحمض النووي الريبي التسلسل (على سبيل المثال 1-3). في المقابل، دراسات الأجنة في البيضة الملقحة إلى مرحلة كروية في وقت مبكر تظل تحديا تقنيا. حتى الآن، سوى عدد قليل من الدراسات لديهم معدل تقييمتحليلات Transcriptome على orted على الأجنة الشباب باستخدام إما تسليخ مجهري التقاط الليزر (LCM) من الأنسجة الجنينية من أقسام البذور ثابت 4 أو استخراج دليل من الأجنة الفردية من داخل البذور باستخدام أدوات غرامة 5. ومع ذلك، معدات LCM لا تتوفر عادة واستخراج الجنين دليل في مراحل مبكرة وقتا طويلا وتتطلب مهارات تشريح الممتازة التي هي غير قابلة للتحويل بسهولة. بالإضافة إلى تحليل الجينوم واسعة، الموقع التحليلات التعبير الجيني في هي أيضا من الصعب تنفيذها على الشباب والأجنة كله يشن من نبات الأرابيدوبسيس. إلى حد ما، يمكن الإفراج الأجنة الشباب على شرائح المجهر من قبل ضغط لطيف على البذور واستخدامها لمراسل المقايسات الجين أو البروتين عن طريق الكشف المناعية (انظر على سبيل المثال 6،7). هذا الأسلوب، ومع ذلك، لا يسمح العزلة الجنين عالية الإنتاجية، مما يعيق التحليل الكمي.

لذلك، قمنا بتطوير بروتوكول فعالة وسريعةلعزل الجنين في وقت مبكر من بذور نبات الأرابيدوبسيس التي هي بسيطة لإعداد، للتحويل بسهولة، ومناسبة لمجموعة متنوعة من التطبيقات المصب. المبدأ الأساسي هو سحق بلطف البذور - تشريح من siliques الشباب في أنبوب إيبندورف باستخدام مدقة البلاستيك في وجود مخزن مؤقت العزلة المناسبة. يتم وضع استخراج البذور في قطرات على شريحة متعددة بشكل جيد ويتم فحص لوجود الأجنة صدر في مرحلة المطلوب باستخدام مجهر مقلوب. يتم جمع الأجنة باستخدام الزجاج microcapillary تعلق على microinjector أو ماصة المختبر القياسية. لتطبيقات الجزيئية، يتم غسلها مرتين من قبل الأجنة الإفراج المتكررة إلى قطرات من العازلة العزلة جديدة قبل نقلهم إلى المخزن المؤقت الوجهة في حجم الحد الأدنى. للتطبيقات الخلوي (المقايسات مراسل، المناعية، FISH)، يمكن حذف غسل الخطوات.

الأسلوب يوفر العديد من المزايا: (ط) لأنها تعود 25-40 الأجنة في ~ 45 دقيقة عن التطبيق الخلويlications أو في 3-4 ساعة لتطبيقات الجزيئية (بما في ذلك الخطوات الغسيل)، (الثاني) أنها تتيح العزلة من المراحل الجنينية محددة، (الثالث) فمن السهل نقلها إلى الأشخاص ومختبرات أخرى بسبب الإعداد لها بسيطة، (الرابع) أنه يتطلب معدات متناول الإعداد الأساسية والتي هي قابلة للترقيات، و(V) قد تم استخدامه بنجاح لمختلف التطبيقات المصب مثل RNA تسلسل 8، تحليل الجينات المحددة DNA-مثيلة 9، المقايسات مراسل (10 و Raissig وآخرون، في الإعدادية.)، والأسماك (J. Jaenisch، U. Grossniklaus، C. Baroux غير منشورة، انظر الشكل 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتتلخص الإجراء في المخطط الانسيابي هو مبين في الشكل 1. يتم عرض microcapillaries والإعداد فعال في الشكل 2 والشكل 3، ويتم عرض خطوات نموذجية من العزلة الجنين في الشكل 4.

1. المواد وإعداد الواق

1.1 سيليكون طلاء الزجاج microcapillaries

  1. وضع microcapillaries في 15 مل أنبوب فالكون مع ~ 5 مل من Sigmacote (سيغما) وعكس عدة مرات.
  2. إزالة الحل، وضع أنبوب فالكون يحتوي على الشعيرات الدموية في رقائق الألومنيوم ويخبز لهم لمدة 3 ساعة على 60 درجة مئوية. تخزين في درجة حرارة الغرفة.

1.2 ~ 50-100 ميكرون الحصول قطرها نصائح microcapillary

  1. سحب 1 مم القطر الزجاج الشعيرات الدموية إما يدويا على الموقد بنسن أو باستخدام ساحبة التجارية (العمودي خيوط ساحبة أو مجتذب micropipette).
  2. استخدام الماسالقلم غيض أو شفرة لقطع غيض من سحبت الشعرية لخلق افتتاح المرجوة. حدد على شكل أفضل الشعيرات الدموية تحت المجهر ستيريو. وينبغي أن يكون افتتاح 50-100 ميكرون (الشكل 2).

1.3 إعداد الشرائح

  1. Siliconize الشرائح نظيفة من خلال تغطية جميع الآبار مع Sigmacote (~ 1 مل / الشريحة) لمدة 5 دقائق، وإزالة. خبز 3 ساعة في رقائق الألومنيوم. تخزين في درجة حرارة الغرفة.
  2. غسل متعددة أيضا شرائح زجاجية مجهرية لمدة 10 دقيقة في 10٪ SDS، 2 × 2 دقيقة في nuclease خالية من المياه (تعقيمها DEPC-ده 2 O)، 2 دقيقة في الايثانول 70٪، 2 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100٪، والهواء تجف. تتم جميع الخطوات في الجرار Coplin تعقيمها. الشرائح ويمكن إعادة استخدامه عدة مرات توفير تنظيف شامل بين كل استخدام.
  3. فقط قبل الجنين انتشار العزلة ~ 0.5 ميكرولتر من 10 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) مع ماصة على سطح كامل من كل بئر والهواء الجاف.

1.4 المجهر والإعداد الشعرية

<OL>
  • استخدام مجهر مقلوب مع 10X 20X الهدف والتكبير. تحسين النقيض من الضوء (أجنة شفافة تماما).
  • وضع مياداة مجهرية لعقد الزجاج الشعرية بجوار المجهر. يتم توصيل الزجاج الشعرية إلى microinjector (الشكل 3A) أو إلى العادية P-200 ماصة عن طريق أنبوب من المطاط (الشكل 3B، انظر المناقشة للحصول على وصف مفصل لهذا الإعداد).
  • ضع الشعرية فوق شريحة المجهر في زاوية ~ 70 درجة (الشكل 3) وضبط الموقف أن يكون فتحة في مجال الرؤية.
  • قبيل العزلة الجنين يستغرق والافراج ~ 5-10 ميكرولتر BSA (1 ملغ / مل) لمعطف الشعرية.

    • 1.5 المخازن المؤقتة

    يسرد الجدول 1 العزلة والمقصد مخازن بالاعتماد على التطبيقات المصب.

    1. إعداد ~ 1 مل العازلة العزلة لكل عينة استخدام طازجة قبل وابقائه على الجليد.
    2. إعداد المخزن المؤقت الوجهة في مل أنبوب إيبندورف 0.5 ملزم منخفض على الجليد (تطبيقات الجزيئية) أو على شريحة المجهر (تطبيقات الخلوي) في غرفة رطبة.

    2. تشريح البذور واستخراج الأجنة

    2.1 المزامنة من تطوير البذور

    1. إضعاف الزهور والاحتفاظ بها 2 أيام في غرفة النمو مع تجنب الاتصال من المدقات يتعرض مع غيرها من الزهور، ثم تلقح لهم (على سبيل المثال 11).
    2. اختبار تلك المرحلة من التطور في ظل ظروف النمو الخاص بك عن طريق التحقيق المجهرية من البذور تطهيرها. مع ظروف النمو لدينا (16 ساعة ضوء في 21 ° C، 8 ساعة مظلمة عند 18 درجة مئوية والرطوبة 70٪) جمع البذور 2.5 أيام بعد التلقيح (DAP) أسفرت أساسا 2-4 أجنة الخلية والبذور التي تم جمعها 3،5-4 DAP أسفرت كروي الأجنة.

    2.2 تشريح البذور وتمزق

    1. إزالة الصورةeeds 10-15 siliques (~ 2.5 DAP) تحت stereomicroscope مع ملقط وإبر الأنسولين.
    2. تزج البذور في 20 ميكرولتر العازلة العزلة في 2 مل جولة القاع أنبوب إيبندورف وضعت على الجليد.
    3. سحق بلطف البذور مع مدقة البلاستيك (قبل تنظيفها مع 10٪ SDS، تشطف مع DEPC-ده 2 O وغسلها مع الايثانول 70٪) للافراج عن الأجنة حتى استخراج البذور هو غائم. القوة لتقديم الطلبات هو يحدده كل مستخدم على المحاكمة.
    4. شطف مدقة مع 300 ميكرولتر من العازلة العزلة لغسل مدقة وتمييع العينة.
    5. تدور باستمرار استخراج في 5،000 x ج لمدة 5 ثوانى. resuspend بلطف استخراج مكعبات من قبل pipetting صعودا ونزولا 2-3 مرات.
    6. تحديد استخراج مع شبكة من النايلون 30 ميكرومتر (التي شنت على محولات أنبوب، على سبيل المثال من PartecCelltricks). شطف شبكة مع 200 العازلة ميكرولتر إضافية العزلة.

    3. عزل الجنين

    3.1 إعداد الشرائح

      <لى> مكان نظيف والشرائح المتعددة جيدا BSA المغلفة وsiliconized على مسرح المجهر المقلوب، resuspend واستخراج البذور تمت تصفيتها من قبل pipetting بلطف صعودا ونزولا وماصة 2 قطرات من 40-50 ميكرولتر استخراج البذور في 1 أو 2 الآبار . فحص فقط 1 أو 2 قطرات في وقت يمنع التبخر من العينة.
    1. مكان 50 ميكرولتر من العازلة العزلة الطازجة (1 شارع انخفاض غسل) في بئر من شريحة مختلفة أعدت كما كان من قبل. إبقاء هذه الشريحة في غرفة تجارة وصناعة المغطاة الرطبة لمنع التبخر.

    3.2 الشاشة، وتنظيف، وجمع

    1. فحص قطرات من استخراج البذور من أجل أجنة في مرحلة المطلوب مع هدف التكبير 10x. إذا لزم الأمر، تأكيد المسرح مع التكبير 20X. الأجنة عادة تنزل الى القاع من الشريحة.
    2. إزالة يدويا الحطام حول الجنين مع إبرة التنغستن، إبرة الأنسولين أو معدات مماثلة.
    3. نقل الزجاج الشعرية بالقرب من جنين باستخدام مياداة مجهرية، رأك يصل الجنين مع كحل أقل قدر ممكن.
    4. جمع العديد من الأجنة (على سبيل المثال كل من القطيرات واحدة) وإطلاق سراحهم في 1 شارع انخفاض غسل (تطبيق الجزيئية) أو في المخزن المؤقت الوجهة (تطبيقات الخلوي). يجب أن تبقى كل جولة جمع في غضون 5-10 دقيقة وينبغي جمع الأجنة في حجم الحد الأدنى (الحجم الكلي للجميع الجولات جمع يجب أن يكون <5 ميكرولتر).
    5. تكرار الفحص وجمع حتى يتم جمع المبلغ المطلوب من الأجنة في 1 شارع انخفاض غسل (مركزيا، إذا كان ذلك ممكنا، لتسهيل تذكر).
    6. يتذكر جميع الأجنة في آن واحد من قطرة غسل (إذا نفذت أكثر من الحطام، إزالتها بإبرة قبل تذكر).
    7. الإفراج عن الأجنة إلى قطرة غسل الثانية 2 من 50 ميكرولتر. كرر 3.2.6.
    8. الإفراج عن الأجنة في المخزن المؤقت الوجهة. نقل وينبغي أن تشمل فقط الاتصال، وليس الغمر، من طرف الشعرية.
    9. استبدال microcapilلاري للعينة القادمة.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    لدينا إجراء العزل الجنين (الشكل 1) يسمح العزلة لمدة تصل إلى 40 الأجنة في 4 ساعة إذا يتم تنفيذ يغسل، وعلى سبيل المثال لتطبيقات الجزيئية، أو في أقل من ساعة إذا تم حذف يغسل، على سبيل المثال للتطبيقات الخلوي. يعرض الشكل 2 العالية والمنخفضة نصائح microcapillary الجودة والشكل 3 يبين الإعداد من الجهاز العزلة الجنين. يعرض الشكل 4 عملية عزل الأجنة على مجهر مقلوب.

    طبقنا بنجاح إجراءاتنا لمختلف التطبيقات التي نشرت في عدة مقالات نشرت مؤخرا. وقد تم تطوير هذا الأسلوب أصلا لتحليل مساهمة الوالدين إلى Transcriptome على الجنينية المبكرة. تم عزل الأجنة الهجينة التي تتولد من خلال الصلبان بين اثنين من الانضمام نبات الأرابيدوبسيس مختلفة (ندسبرغ المقف (L إيه) وكولومبيا (COL-0)) في مرحلة الخلية 2-4. تم استخراج الحمض النووي الريبي مجموع، [كدنا]أنتجت المكتبات باستخدام التضخيم الخطية والتسلسل على أرضية صلبة. تم إنشاء transcriptomes أليل محددة على أساس تحليل SNP 8. لسيطرتنا مكتبات [كدنا] الجنينية قبل التسلسل نحن تضخيم النصوص الجنين محددة، WUSCHEL-HOMEOBOX 2 و 8 و 9 (WOX2، WOX8، WOX9) وأكتين 11 (13،14، الشكل 5A).

    بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام هذا الأسلوب لعزل الأجنة الشباب لتحليل أنماط الحمض النووي الجنيني مثيلة في مواضع محددة في الجينوم. تم عزل الأجنة وغسلها في 1X TE-المخزن المؤقت. تم إجراء التسلسل بيسلفيت الصغيرة كما هو موضح 9،15.

    وبالمثل، فقد ثبت العزلة الجنين مفيدة جدا في فحوصات الجينات مراسل مع التعبير الجنينية منخفضة، وحيث يفند غلاف البذرة الأمهات الكشف أو من قبل ملثمين التعبير مراسل في الأنسجة المحيطة بها الجنين (السويداء، ومعطف البذور). الأجنة كار يينغ التحوير مراسل هي الملون (ß غلوكورونيداز؛ المكتب المركزي للاحصاءات) أو تحليلها مباشرة (الأخضر أو ​​الأحمر بروتين الفلورسنت؛ GFP، RFP) بعد العزلة. ويرد مثال في الشكل 5B للأجنة معربا عن الجين مراسل المكتب المركزي للاحصاءات تحت سيطرة المروج MEDEA (ع MEA) 10. سهولة نسبيا مع العديد من الأجنة التي يمكن أن تكون معزولة كما يسمح للتحليل كمي (على سبيل المثال عدد من الأجنة ملطخة في خلفيات وراثية مختلفة، Raissig، Grossniklaus وآخرون. قيد الإعداد).

    وأخيرا، فإننا تطبيقها بنجاح نيون في الموقع التهجين (FISH) والتقنيات المناعية لدراسة الهندسة المعمارية النووية في الأجنة المعزولة جزءا لا يتجزأ من منصات الأكريلاميد على الشرائح. ويرد مثال من الأسماك باستخدام تحقيقات ضد يكرر السنترومير والمناطق تنظيم نويي في الشكل 5C.

    1 "FO: محتوى العرض =" 5IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1highres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1.jpg "/>
    الشكل 1. الرسم البياني من إجراء العزل الجنين وينقسم البروتوكول في ثلاثة أجزاء: 1 - إعداد المواد؛ 2 - تشريح البذور؛ 3 - العزلة الأجنة.

    الشكل 2
    الشكل 2. نصائح Microcapillary. A. نصائح microcapillary عالية الجودة مع افتتاح سلسة من حوالي 100 ميكرون. B. نصائح microcapillary ذات جودة منخفضة مع الانفتاح بشكل اوسع وكفاف غير النظامية (هذه النصائح مقبولة للتطبيقات الخلوي فقط). شريط النطاق: 2 مم.

    ghres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50371/50371fig3.jpg "/>
    الشكل (3). إعداد من العزلة المجهر الجنين. يتم تنفيذ A. B. والفرز على شرائح المجهر تحت مجهر مقلوب. يتم جمع الأجنة باستخدام الزجاج microcapillary ثابتة على micromanipulator للسيطرة على وجه التحديد موقفها (انظر أيضا الشكل 4) ومتصلا إما microinjector (A) أو معيار مختبر ماصة (B). A. ويرتبط زجاج microcapillary إلى التحكم هيدروليكيا ويرد microinjector (على سبيل المثال إيبندورف الخليوي الترام فاريو) لمراقبة دقيقة أثناء الجنين جمع B. الزجاج microcapillary في مستوى P-200 ماصة عن طريق أنبوب من المطاط المرن. يتم التحكم جمع الأجنة والإفراج عن طريق تحريك العجلة معايرة من ماصة. وتستخدم قطع نهاية ماصة نصائح والموصلات ويتم اغلاق التقاطعات مع parafilm. مييتم إصلاح crocapillary على مياداة مجهرية عبر كتل البوليسترين، وأنابيب فالكون والشريط.

    الشكل 4
    الشكل 4. عملية عزل الجنين. A. A تم التعرف 2-4 الجنين الخلية (السهم) في استخراج البذور (قطيرة الفرز) وتحيط بها الحطام (شظايا غلاف البذرة). B. تمت إزالة الأنقاض المحيطة يدويا باستخدام إبرة. C. تم نقل الزجاج الشعرية حق بجوار الجنين (السهم). D. وقد تم جمع الأجنة والآن داخل الشعيرات الدموية (السهم). E. عدة أجنة في آخر قطرة بعد يغسل. نطاق = 50 ميكرون.

    الرقم 5
    F igure 5. تطبيقات المصب من العزلة الجنين A. التحليلات التعبير الجيني: PCR التضخيم من WOX9، WOX2، WOX8 وACTIN11 13،14 في مكتبات [كدنا] (ولدت كما هو موضح 8) 2-4 أجنة الخلية غسلها 1X مرات (حارة 1) وعلى الجيني . الحمض النووي (حارة 2) B. فحص المراسل: الجنين 8 خلايا معزولة من النباتات تحمل ا ف ب MEA :: كانت ملطخة المكتب المركزي للاحصاءات بناء على شريحة في معيار حل تلطيخ المكتب المركزي للاحصاءات (مستنسخة من Raissig وآخرون، 2011 بعد الحصول على إذن من و. الخلية النباتية، ASPB حق المؤلف). C. نيون التهجين في الموضع (FISH): تم تهجين جنين 8 خلايا مع تحقيقات ضد يكرر القسيم المركزي (الحمراء)، ويكرر 45S rDNA (الخضراء) قبل مناعي غير المباشرة 16. تم مضافين الصور FISH ثنائي اللون مع counterstaining دابي والصور DIC (DM6000B المجهر epifluorescence، لايكا، ألمانيا).

    محتوى "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" دائما ">
    تطبيق العازلة العزلة المخزن المؤقت الوجهة
    استخراج الحمض النووي الريبي (مثل التضخيم وtranscriptomics) 1X العازلة الأولى ستراند (إينفيتروجن)، 1 ملم DTT، 4٪ RNAseOUT العازلة استخراج الحمض النووي الريبي
    استخراج الحمض النووي (على سبيل المثال لتسلسل بيسلفيت) 100 ملي تريس، 10 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8 (TE) الحمض النووي استخراج العازلة أو 1X TE العازلة
    تحليل مراسل GFP 1 M Glycin في 0.5X MS 1 1 M Glycin في MS 0.5X
    تحليل مراسل المكتب المركزي للاحصاءات تلطيخ العازلة 2 بدون X-الحلاوة (الركيزة) تلطيخ العازلة مع X-الحلاوة (الركيزة)
    FISH والمناعية 100 ملي الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تنشيط الاكريليك: مزيج Bisacryl (33:3) على Superfrost زائد الشريحة تبلمر لمدة 30 دقيقة

    الجدول 1. يمكن تكييفها العزلة وجهة المخازن المؤقتة للتطبيقات المصب مختلفة. المخازن المؤقتة لمتطلبات تجريبية محددة. 1 Murashig وسكوغ المتوسطة. 2 على سبيل المثال جيفرسون وآخرون، EMBO J. 6 (13)، 3901-3907 (1987).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    وضعنا بروتوكولا العزلة الجنين الذي هو سريع، فعال، ويمكن نقلها بسهولة إلى مختبرات أخرى.

    المعدات وصفها هنا يتكون من مجهر مقلوب، وهو مياداة مجهرية، زجاج microcapillaries، مجتذب خيوط الرأسي وmicroinjector (الشكل 3A). الإعداد هو مماثلة لتلك التي وصفها لاحد العزلة الخلية الحيوانية لتحاليل transcriptomics 17. كما عملنا بنجاح مع إعداد أكثر الأساسية حيث امتدت الزجاج microcapillaries يدويا فوق لهب (وقطع مع الماس شفرة) وتشغيلها عن طريق مختبر ماصة القياسية (Pipetman P-200) بدلا من microinjector (الشكل 3B). في هذه الحالة كان يعلق على microcapillary إلى ماصة عن طريق أنبوب من المطاط. واستخدمت 10 filtertips ميكرولتر لجعل التقاطعات، التي كانت ملفوفة مع parafilm لجعلها محكمة الغلق. الشعرية - التي تحتفظ بها غيض ماصة - تم إصلاح على ميكرذراع omanipulator باستخدام كتل البوليسترين والشريط (الشكل 3B). أثبت هذا الإعداد الأساسي لتكون فعالة وموثوق بها 8. ومع ذلك، كان واحدا من أهم الصعوبات في الحفاظ على تقاطعات محكمة الغلق بين microcapillary وماصة، خاصة عند تغيير الشعرية. التحقق وضبط الضغط في الشعيرات الدموية - لضمان جمع الأجنة صقلها في حجم الحد الأدنى - يمكن أن يكون مضيعة للوقت باستخدام هذا الإعداد الأساسي. تحسين الإعداد مع مياداة مجهرية التحكم هيدروليكيا وساحبة خيوط العمودي هو تحسنا كبيرا ويوفر الوقت.

    المهارات اللازمة لنجاح تطبيق هذه الطريقة قابلة للتحويل بسهولة. خمسة مستخدمين في مختبرنا علمت بنجاح الأسلوب في وقت قصير نسبيا. بعض التبسيط من البروتوكول هي اعتمادا ممكن على سهولة للمستخدم في التلاعب. على سبيل المثال، فمن الممكن لتخطي الخطوات 2.2.5 2.2.6 وبينماتشريح فقط 5 siliques (بدلا من 15) وتنظيف المناطق المحيطة بها الجنين بدقة من الحطام مع إبرة التنغستن (تم تطبيق هذا الإجراء في 8). التزامن من تطوير البذور من خلال خصاء وتأخر التلقيح هو اختياري ولكن الموصى بها لزيادة عدد الأجنة في هذه المرحلة التنموية نفسها، ولا سيما في المراحل المبكرة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التعجيل العزلة الجنين إذا تم حذف غسل الخطوات، على سبيل المثال للتطبيقات الخلوي. وعلاوة على ذلك، siliconization الشريحة (الخطوة 1.3.2) ليس من الضروري للمستخدمين العمل بسرعة، مثل أن الأجنة التي تلتصق على سطح الزجاج مع مرور الوقت ليست مشكلة.

    سواء الترشيح أو يتم تطبيق التنظيف اليدوي، فمن المهم للغاية لتجنب المرحل من الحطام الأنسجة التي تخلق التلوث المحتمل للRNA المصب أو تطبيقات الحمض النووي. وقد أثيرت هذه المسألة مؤخرا في دراسة التنميط Transcriptome على استخدام أسلوب مختلف من العزلة الجنين18. على النقيض من ذلك إلى الجزء الأكبر بروتوكول العزلة الجنين هو موضح هنا، والكتاب تشريح الأجنة نبات الأرابيدوبسيس يدويا من داخل البذور الفردية باستخدام إبر دقيقة، والإجراءات المطولة التي تتطلب مهارات تشريح ممتازة. هذا الإجراء يتطلب على ما يبدو 2 أو أكثر من يغسل لتجنب المرحل من الممكن الخلايا الملوثة من الأنسجة المحيطة البذور، وهو وضع من المرجح مصادفة عند استخدام هذه الطريقة نظرا لصغر حجم الأجنة، والصعوبات في الوصول إليها مع الإبر تشريح، والإلتصاق من الخلايا المحيطة بها. على النقيض من ذلك، لدينا الإجراء يسمح (ط) التخفيف من الأجنة في مقذوف من البذور على سحق والمحيطة الحطام في حجم كبير (500 ميكرولتر) قبل جمع الأجنة، (الثاني) اختيار البصرية للأجنة خالية من مادة لاصقة، وتلويث الحطام، و (ثالثا) التخفيف من تلوث ممكن RNA-تسرب من تمزق الخلايا عن طريق الخطوات الغسيل. في حين أنه من الممكن لاستخدام واحد فقط الخطوة غسل إذا كانتظهر الأجنة نظيفة جدا ويتم جمعها في أقل من 5 ميكرولتر 8، خطوة غسل الثاني هو الموصى بها، وخاصة بالنسبة للمستخدمين لأول مرة قد جمع الأجنة في عدة جولات (أي مع حجم المضافة). وينبغي جمع الأجنة في كحل أقل قدر ممكن، والسماح للتخفيف القصوى من الملوثات المحتملة في كل خطوة الغسيل. يجب أن تبقى كل جولة جمع قصيرة (في غضون 5-10 دقيقة) للسماح أقصى الانتعاش على الإطلاق في انخفاض غسل (وجود أطول في شعري يميل إلى تقليل معدل الاسترداد). وعلاوة على ذلك، ينبغي نقل الأجنة التي تم جمعها في بيئة مستخلص (اتباع الخطوات غسل) تنطوي فقط على الاتصال مع افتتاح غيض microcapillary وليس الغمر من غيض، لأن ذلك قد نقل كذلك الحطام الشائكة على الجدار فوق microcapillary افتتاح. وأخيرا، فإن الشعرية ينبغي تغييرها بين كل مستخلص بذور جديدة.

    لدينا بروتوكول يسمح لعدة هبوطاتطبيقات tream ببساطة عن طريق استخدام وجود مخزن مؤقت العزلة المناسبة التي تحافظ على سلامة الجزيئية من الحمض النووي الريبي والحمض النووي، لونين، مراسل انزيم أو الفلورسنت. نحن معزولة بنجاح الأجنة في عازلة عزل الحمض النووي الريبي واقية لاستخراج الحمض النووي الريبي وتحليلات transcriptomics 8، 1X العازلة TE-لتحليلات الحامض النووي 9، مخزنة 100 ملي الفوسفات المالحة (PBS) للأسماك والمناعية (Jaenisch، Grossniklaus وBaroux، غير منشورة، الشكل 5C)، وحل تلطيخ دون الركيزة لفحوصات مراسل المكتب المركزي للاحصاءات (19، الشكل 5B). التطبيق الأكثر حساسية للظروف العزلة / نوعية الجنين هو بالتأكيد استخراج الحمض النووي الريبي والتضخيم. كانت كمية الحمض النووي الريبي المستخرج من أجنة معزولة منخفضة نوعا ما. من ~ 30 الأجنة في مرحلة الخلية 2-4 (وبالتالي 60-120 الخلايا في الكل) قدرنا مبلغ ~ 1NG من الحمض النووي الريبي مجموع يعتمد على كلا 2100 اجيلنت Bioanalyzer (اجيلنت تكنولوجيز) وو qubit القياسات (إينفيتروجن). Followiنانوغرام استخراج الحمض النووي الريبي، تم التحقق من الحمض النووي الريبي جودة على الحمض النووي الريبي اجيلنت 6000 رقاقة بيكو (اجيلنت تكنولوجيز). ومع ذلك، فإن كمية قليلة من الحمض النووي الريبي المستخرج ليست دائما كافية لإنتاج الملف الشخصي موثوق بها. وبالتالي، يجب أن يتم إجراء مزيد من التجارب على المواد تضخيم ([كدنا]) (مثل PCR الكشف التي تبديها منخفضة، جينات الجنين محددة و / أو الشخصي Bioanalyzer).

    وأخيرا، القدرة على عزل الأجنة وفقا لمعايير البصرية في بروتوكول لدينا هو ميزة كبيرة. الأجنة من نفس silique (فاكهة نبات الأرابيدوبسيس) لا تتطور بشكل متزامن. وهكذا، والعمل على مقتطفات silique كله (على سبيل المثال لتحليل RT-PCR أو المقايسات مراسل الكمي) لا يسمح وجود علاقة مثالية مع المرحلة التنموية معين. عزل الأجنة في مرحلة تنموية محددة يحل هذه المشكلة. وبالإضافة إلى ذلك، يطرح مشكلة مماثلة عند العمل مع المسوخ متخالف حيث تحتوي siliques المورثات الجنين مختلفة. عزل الأجنة بناء على معايير البصرية لدistinguish على سبيل المثال من النوع البري من الظواهر الجنين متحولة يسمح ربط التحليلات المصب مع التركيب الوراثي. ولقد فعلنا ذلك بنجاح لتحليل الحامض النووي في مواضع محددة في المورثات مختلفة 20.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

    Acknowledgments

    ونود أن نشكر تل ناوي ومارتن باير لنصائحهم على العزلة الجنين. MTR، VG، UG وCB ابتكر أجهزة العزلة الجنين. وضعت MTR، VG وCB بروتوكول العزلة الجنين. أنشئت MTR، VG وCB البروتوكول، عزل الأجنة، والجنين ولدت [كدنا]، ينجز VG على JJ PCR، MTR تلطيخ المكتب المركزي للاحصاءات، والتجارب على الأسماك. MTR، VG، CG وUG كتب مخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل جامعة زيوريخ، وزمالة من مؤسسة أبحاث روش (لMTR)، والمنح المقدمة من المؤسسة السويسرية الوطنية (لUG وCB).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    REAGENTS
    Sigmacote SIGMA SL2-100 ml
    RNAse OUT Invitrogen (life technologies) 10777-019
    First- strand buffer Invitrogen (life technologies) 18064-022 contained in Superscript II package
    DTT Invitrogen (life technologies) 18064-022 contained in Superscript II package
    Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml New England Biolabs Inc. Different suppliers will also work
    Thin wall Capillaries 1.0 mm World Precision Instruments TW100F-4
    DNA LoBind tube 0.5 ml Vaudaux-Eppendorf 0030108.035
    CellTricsΔ 30 μm PARTEC 04-0042-2316
    5wells 10 mm diameter slides Electron Microscopy Sciences 63421-10
    Formaldehyde Solution Sigma-Aldrich F1635
    Superfrost Plus slide Thermo Fisher J1800AMNZ Menzel-Gläser
    Tris Amaresco 0497
    EDTA Applichem A2937
    Glycin Fluka 50050
    SDS pellets Roth CN30.3
    Micro Pestle VWR 431-0094
    Microfine insulin syringes BD U-100
    DEPC Sigma-Aldrich D5758
    Ethanol Schaurlau ET00102500
    Forceps N5 Dumont 0108-5
    Bioanalyzer Pico Chip Agilent Technologies 5067-1513
    EQUIPMENT
    Inverted microscope Nikon TMS (Japan),
    Micromanipulator Leitz Leica
    Micomanipulator Post mount LH1 probe Leica microsystems 39430101 Different brand will also do the work
    Vertical filament puller Sutter instrument P-20 model Other model are also suitable
    Cell Tram vario Vaudaux-Eppendorf 5176.000.033
    Bioanalyzer Agilent Technologies 2100
    Qubit Fluorometer Invitrogen (life technologies

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
    2. Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
    3. Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
    4. NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
    5. Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
    6. Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
    7. Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
    8. Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
    9. Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
    10. Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
    11. Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
    12. SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
    13. Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
    14. Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
    15. Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
    16. Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
    17. Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
    18. Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
    19. Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
    20. Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).

    Tags

    بيولوجيا النبات، العدد 76، علم الأحياء الخلوي وعلم الأحياء التطوري، علم الأحياء الجزيئي، علم الوراثة، علم الأجنة، والعزلة الأجنة،
    العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; بذور
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Raissig, M. T., Gagliardini, V.,… More

    Raissig, M. T., Gagliardini, V., Jaenisch, J., Grossniklaus, U., Baroux, C. Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds. J. Vis. Exp. (76), e50371, doi:10.3791/50371 (2013).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter