Summary
אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח מ
Abstract
בצמחים פורחים, העובר מתפתח בתוך רקמה מזינה - האנדוספרם - מוקפת נעשה עור הזרעים האימהי (או מעיל זרע). כתוצאה מכך, את הבידוד של עוברי צמחים בשלבים מוקדמים (שלב 1 עד תא כדורי) הוא מבחינה טכנית מאתגר בשל הנגישות היחסית שלהם. נתיחת שימוש יעילה בשלבים מוקדמים הנו פגומה מאוד על ידי הגודל הקטן של זרעי ארבידופסיס צעירים והדביקות של העובר לרקמות שמסביב. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת בידוד יעיל של עוברי ארבידופסיס צעירים, מניב עד 40 עוברים בשעות 1 עד 4 שעות, תלוי ביישום במורד הזרם. עוברים משתחררים לחיץ בידוד על ידי ריסוק מעט 250-750 זרעים עם העלי פלסטיק בצינור Eppendorf. זכוכית microcapillary קשורה הוא למעבדת פיפטה סטנדרטית (דרך צינור גומי) או microinjector נשלט הידראולי משמש כדי לאסוף עובר ממקום טיפותד בשקופית רב גם במיקרוסקופ אור הפוכה. את הכישורים הטכניים הנדרשים הם פשוט והעברה בקלות, וההתקנה הבסיסית אינה דורשת ציוד יקר. עוברים שנאספו מתאימים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם, כגון מבחני גן כתב RT-PCR, RNA רצף, ניתוחי מתילציה DNA, הקרינה הכלאה באתרו (FISH), immunostaining, ו.
Introduction
העובר של צמחים פורחים מוקף האנדוספרם, רקמה תזונתית הנגזרת מאירוע הפריה שנייה. גם העובר והאנדוספרם מוקפים בכמה שכבות תאים של קליפת הזרע. ביחד רקמות אלה יוצרים זרעים, אשר יפתחו בתוך הפרי. לפיכך, רקמות וניתוחים ספציפיים של תאי עוברי ארבידופסיס לקויים בשל חוסר הנגישות שלהם בחום. עם זאת, עובר בשלבים מאוחר הכדוריים או במאוחר הם טוב יחסית נוחים לנתיחה ידנית על ידי שימוש במחטים עדינות תחת טונגסטן סטראו, או על ידי הפעלת לחץ קל על הזרע באמצעות מלקחיים כדי לחלץ אותם. טכניקות כאלה היו בשימוש בהצלחה לtranscriptome או ניתוחי אפיון epigenome כמו הכלאה microarray, רצף bisulfite, או RNA רצף (לדוגמה, 1-3). לעומת זאת, המחקרים של עוברים בשלב הזיגוטה לכדורי מוקדם יישארו מאתגרים מבחינה טכנית. נכון להיום, רק כמה מחקרים יש נציגניתוחי transcriptome orted על עוברים צעירים או באמצעות microdissection לייזר לכידה (LCM) של רקמות עוברי מסעיפי זרעים קבועים 4 או מיצוי ידני של עוברים נפרדים מתוך זרעים באמצעות כלים עדינים 5. עם זאת, ציוד LCM אינו זמין בדרך כלל והפקת מדריך לעובר בשלבים מוקדמים הוא זמן רב ודורשים מיומנויות נתיחה מצוינות כי הם לא בקלות להעברה. בנוסף לניתוחי הגנום כולו, בניתוח ביטוי גנים באתרו הם גם קשה לביצוע בעוברים של ארבידופסיס צעירים, כל ההר. במידה מסוימת, ניתן לשחרר עוברים צעירים על שקופיות מיקרוסקופ על ידי לחץ עדין על הזרעים ומשמשים למבחני גן כתב או זיהוי חלבון על ידי immunostaining (לדוגמה ראה 6,7). טכניקה זו, עם זאת, אינה מאפשרת בידוד עובר תפוקה גבוהה, ובכך פוגע בניתוחים כמותיים.
לכן, פיתחנו פרוטוקול יעיל ומהירלבידוד עובר מוקדם מזרעי ארבידופסיס כי הוא פשוט להתקנה, להעברה בקלות, ומתאים למגוון רחב של יישומים במורד הזרם. העיקרון הבסיסי הוא לרסק את הזרעים בעדינות - גזור מsiliques צעיר בצינור Eppendorf באמצעות העלי פלסטיק בחיץ בידוד מתאים. תמצית הזרעים ממוקמת בטיפין בשקופית רב גם, והוא הוקרן בנוכחותם של עוברים שפורסמו בשלב הרצוי באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. עוברים נאספים באמצעות זכוכית microcapillary המצורפת microinjector או פיפטה מעבדה סטנדרטית. עבור יישומים מולקולריים, עוברים נשטפים פעמיים על ידי שחרורו חזר לטיפין של חיץ בידוד חדש לפני העברתם למאגר שהיעד בנפח מינימאלי. עבור יישומי ציטולוגיה (מבחני כתב, immunostaining, דגים), ניתן להשמיט שלבי כביסה.
השיטה מציעה מספר יתרונות: (i) זה מניב 25-40 עוברים ב~ 45 דקות לאפליקצית ציטולוגיהlications או בשעות 3-4 עבור יישומים מולקולריים (כולל שלבי הכביסה), (ב) שהוא מאפשר בידוד של שלבים עובריים ספציפיים, (iii) הוא בקלות להעברה לאנשים אחרים ומעבדות עקב ההתקנה הפשוטה שלה, (ד) אותה דורש ציוד במחיר סביר עבור ההתקנה הבסיסית, הניתנת לשדרוג, ו( V) זה היה בשימוש בהצלחה ליישומים שונים במורד הזרם, כגון RNA רצף 8, גן ספציפי ניתוח ה-DNA מתילציה 9, מבחני כתב (10 וRaissig et al., בהכנה.), ודגים (ג'Jaenisch, ע Grossniklaus, ג Baroux לא פורסם, ראו איור 5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ההליך מסוכם בתרשים הזרימה שמוצגת באיור 1. Microcapillaries והתקנת אינסטרומנטלי מוצגים באיור 2 ואיור 3, וצעדים אופייניים של בידוד עובר מוצגים באיור 4.
1. חומר והכנת המאגר
1.1 ציפוי הסיליקון של זכוכית microcapillaries
- הנח את microcapillaries בצינור פלקון 15 מ"ל עם ~ 5 מ"ל של Sigmacote (סיגמא) ולהפוך כמה פעמים.
- הסר את הפתרון, במקום צינור פלקון המכיל את נימי הדם ברדיד אלומיניום ואופה אותם ל3 שעות ב 60 ° C. לאחסן בטמפרטורת חדר.
השיגו 1.2 ~ 50-100 טיפים microcapillary מיקרומטר בקוטר
- משוך 1 מ"מ בקוטר זכוכית נימים באופן ידני מעל מבער בונזן או באמצעות חולץ מסחרי (אנכי נימה חולץ או micropipette חולץ).
- השתמש ביהלומיםעט קצה להב או לחתוך את הקצה של הנימים משכו כדי ליצור את הפתיחה הרצויה. בחר את נימי הדם בצורת הטובה ביותר תחת מיקרוסקופ סטריאו. הפתיחה צריכה להיות 50-100 מיקרומטר (איור 2).
הכנת מצגת 1.3
- רכיבי סיליקון שקופיות נקיות על ידי כיסוי כל הבארות עם Sigmacote (~ מיליליטר שקופית 1 /) במשך 5 דקות, להסיר. שעות 3 אופים ברדיד אלומיניום. לאחסן בטמפרטורת חדר.
- שטוף את שקופיות הזכוכית המיקרוסקופיות רב גם למשך 10 דקות ב10% SDS, דקות 2 X 2 במי nuclease (autoclaved DEPC שDDH 2 O), 2 דק 'ב 70% אתנול, 2 דקות ב 100% אתנול, אוויר ייבוש. כל הצעדים נעשים בצנצנות Coplin autoclaved. שקופיות יכולות להיות שימוש חוזרת מספר פעמים מתן ניקוי יסודי בין כל שימוש.
- רק לפני התפשטות בידוד עובר ~ 0.5 μl של 10 מ"ג / מיליליטר אלבומין בסרום שור (BSA) עם טפטפת על כל פני השטח של כל טוב והאוויר יבש.
1.4 מיקרוסקופ והתקנת נימים
<ol>1.5 חוצצים
טבלה 1 מפרטת את מאגרי הבידוד ויעד בהתאם ליישומים במורד הזרם.
- הכן ~ בידוד חיץ 1 מ"ל לדגימה טרי לפני שימוש ולשמור אותו על קרח.
- הכן את חיץ היעד בצינור נמוך מחייב מיליליטר אפנדורף 0.5 על קרח (יישומים מולקולריים) או בשקופית מיקרוסקופ (יישומי ציטולוגיה) בתא לח.
2. Dissection הזרע וחילוץ העובר
2.1 סנכרון של פיתוח זרעים
- לסרס פרחים ולשמור אותם 2 ימים בחדר הצמיחה תוך הימנעות ממגע של עליים שנחשפו עם פרחים אחרים, ולאחר מכן האביק אותם (למשל 11).
- בדוק את השלב של התפתחות בתנאי הצמיחה שלך על ידי חקירה מיקרוסקופית של זרעים מנוקים. עם תנאי הגידול שלנו (אור 16 שעות ב21 מעלות צלזיוס, 8 שעות חשכה על 18 מעלות צלזיוס ו -70% לחות) זרעים נאספו 2.5 ימים לאחר האבקה (DAP) הניבו בעיקר 2-4 עוברים סלולריים וזרעים נאספים 3.5-4 DAP הניב כדורי עוברים.
Dissection זרע 2.2 ושבר
- הסר את יםeeds 10-15 siliques (~ 2.5 DAP) תחת stereomicroscope עם מלקחיים ומחטים לאינסולין.
- לטבול את הזרעים ב20 חיץ בידוד μl בצינור הונח על קרח מ"ל מסביב לתחתית אפנדורף 2.
- בעדינות למחוץ את הזרעים עם העלי פלסטיק (טרום לנקות עם 10% SDS, שטף עם DEPC שDDH 2 O ונשטף עם אתנול 70%) כדי לשחרר את העוברים עד תמצית הזרעים היא חלקית. כוח ליישם הוא שייקבע על ידי כל משתמש על פי דין.
- יש לשטוף את העלי עם 300 μl של חיץ בידוד כדי לשטוף את העלי ולדלל את הדגימה.
- ספין למטה התמצית ב 5000 XG במשך 5 שניות. בעדינות resuspend תמצית pelleted על ידי pipetting למעלה ולמטה 2-3 פעמים.
- סנן את התמצית עם רשת ניילון 30 מיקרומטר (רכוב על מתאמי צינור, למשל, על פי PartecCelltricks). יש לשטוף את הרשת עם חיץ בידוד μl 200 נוסף.
3. בידוד עובר
הכנת מצגת 3.1
- <li> מקום שקופית רב גם נקי, BSA מצופה וsiliconized על הבמה של מיקרוסקופ ההפוכה, resuspend תמצית הזרעים המסוננים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה ופיפטה 2 טיפות של תמצית 40-50 μl זרע לתוך בארות 1 או 2 . הקרנה רק 1 או 2 טיפות בכל פעם מונעת אידוי של המדגם.
- מקום μl 50 של חיץ בידוד טרי (1 טיפת st לשטוף) בבאר של שקופית אחרת מוכנה כמו בעבר. שמור את השקופית הזו בתא מכוסה ולח על מנת למנוע אידוי.
3.2 מסך, לנקות, לאסוף
- מסך טיפות של תמצית זרעים לעוברים בשלב הרצוי עם המטרה בהגדלה 10x. במידת צורך, לאשר את הבמה עם הגדלת 20x. את העוברים לרוב לשקוע בתחתית של השקופית.
- להסיר באופן ידני פסולת סביב העובר עם מחט טונגסטן, מחט אינסולין או ציוד דומה.
- הזז את נימי הזכוכית ליד העובר באמצעות micromanipulator, לאהאייק את העובר עם כפתרון קטן ככל האפשר.
- אסוף כמה עוברים (למשל כל טיפה אחת) ולשחרר אותם בטיפה לשטוף -1 (יישום מולקולרי) או במאגר היעד (יישומי ציטולוגיה). כל סיבוב איסוף צריך להיות כל הזמן בתוך דקות ועובר 5-10 צריכים להיות שנאסף בנפח מינימאלי (הנפח הכולל של כל סבבי האיסוף צריך להיות <5 μl).
- חזור על ההקרנה והגבייה עד לכמות הרצויה של עוברים שנאספה בירידת 1 st לשטוף (מרכזי, אם אפשר, כדי להקל על זכירה).
- זוכר את כל העוברים בבת אחת מהירידה לשטוף (אם הפסולת מתבצעת מעל, להסיר אותם עם מחט לפני הזיכרון).
- שחרר את העוברים לירידה לשטוף 2 nd של 50 μl. חזור על 3.2.6.
- שחרר את העוברים במאגר היעד. ההעברה צריכה להיות כרוכה רק קשר, ולא טבילה, של קצה הנימים.
- החלף את microcapilלארי למדגם הבא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הליך בידוד העובר שלנו (איור 1) מאפשר בידוד של עד 40 עוברים בשעה 4 אם שוטף מבוצע, למשל עבור יישומים מולקולריים, או בפחות משעה אם שוטף מושמט, למשל עבור יישומי ציטולוגיה. מציג איור 2 גבוה ונמוך טיפים microcapillary איכות ואיור 3 מציג את ההגדרה של המכונה בידוד העובר. איור 4 מציג תהליך של בידוד עובר במיקרוסקופ ההפוכה.
אנחנו מיושמים בהצלחה ההליך שלנו עבור יישומים שונים שפורסמו בכמה מאמרים אחרונים. השיטה פותחה במקור כדי לנתח את תרומת ההורים לtranscriptome העוברי המוקדם. עוברים היברידיים שנוצרו באמצעות הכלאות בין שתי הצטרפויות ארבידופסיס שונות (לנדסברג erecta (L ER) וקולומביה (Col-0)) היו מבודדים בשלב התא 2-4. סך RNA הופק, cDNAספריות הופקו באמצעות הגברה ליניארית ורצף על פלטפורמה מוצקה. את transcriptomes האלל הספציפי היו שנוצר בהתבסס על ניתוח SNP 8. כדי לשלוט בספריות cDNA העובריים שלנו לפני שאנחנו רצף מוגבר תמלילי עובר ספציפיים, WUSCHEL-homeobox 2, 8 ו -9 (WOX2, WOX8, WOX9) ותקטין 11 (13,14, איור 5 א).
בנוסף, בשיטה זו נעשתה שימוש כדי לבודד עוברים צעירים כדי לנתח את דפוסי ה-DNA מתילציה העובריים בלוקוסים ספציפיים בגנום. עוברים היו מבודדים ורחצו ב1x TE-חיץ. רצף bisulfite בקנה מידה קטן בוצע כפי שתואר 9,15.
בדומה לכך, בידוד העובר הוכיח מאוד שימושי במבחני גן כתב עם ביטוי נמוך עוברי, ושבו מעיל האימהי הזרע מבלבל את זיהוי או שהוא רעול פנים על ידי ביטוי עיתונאי ברקמות הסובבות את העובר (האנדוספרם, מעיל זרע). עוברי קאר יינג transgene הכתב מוכתם (SS-glucuronidase; גאס) או ישירות ניתחו (חלבון ניאון ירוק או אדום, GFP, RFP) לאחר בידוד. דוגמה לכך היא נתון באיור 5 ב לעוברים להביע גן כתב גאס תחת השליטה של אמרגן MEDEA (עמ 'MEA) 10. יחסית קלות שבה ניתן לבודד עוברים רבים גם מאפשרת לניתוחים כמותיים (לדוגמא מספר העוברים המוכתמים ברקע גנטי שונה, Raissig, Grossniklaus et al. בהכנה).
לבסוף, אנו מיושמים בהצלחה ניאון הכלאה באתר (דגים) וטכניקות immunostaining לחקר הארכיטקטורה הגרעינית בעוברים מבודדים מוטבעת ברפידות acrylamide בשקופיות. דוגמה של דגים באמצעות בדיקות נגד חוזר centromere ואזורי ארגון nucleolar מוצגת באיור 5 ג.
1 "עבור: תוכן-width =" 5IN "עבור: src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1.jpg "/>
איור 1. תרשים זרימה של הליך בידוד עובר הפרוטוקול מחולק לשלושה חלקים: 1 - הכנת חומר; 2 - נתיחת זרעים; 3 - בידוד העובר..
איור 2. טיפים microcapillary. טיפים microcapillary באיכות גבוהה עם א פתיחה חלקה של כ -100 מיקרומטר. טיפים microcapillary נמוך באיכות B. עם פתח רחב יותר וקווי מתאר לא סדיר (הטיפים האלה הם מקובלים עבור יישומי ציטולוגיה בלבד). בר סולם: 2 מ"מ.
ghres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50371/50371fig3.jpg "/>
איור 3. הגדרה של המיקרוסקופ בידוד העובר. א 'וההקרנה ב' מתבצעת על שקופיות מיקרוסקופ תחת מיקרוסקופ הפוכה. עוברים נאספים באמצעות זכוכית microcapillary קבוע על micromanipulator לשלוט במדויק את עמדתה (ראה גם איור 4) ומחוברים לשני microinjector () או הסטנדרטית המעבדה פיפטה (ב '). א זכוכית microcapillary קשורה לשליטה הידראולית microinjector (למשל Eppendorf הסלולרי חשמלית Vario) לשליטה מדויקת בזמן עובר האוסף B. כוס microcapillary מחובר לפיפטה באמצעות צינור גמיש גומי סטנדרטי P-200. אוסף העובר ושחרורו נשלט על ידי סיבוב גלגל הכיול של פיפטה. טיפים פיפטה Cut-end משמשים כמחברים וצומת חתומים עם parafilm. מיילcrocapillary קבוע על micromanipulator באמצעות בלוקים קלקר, צינורות דיה ועל קלטת.
איור 4. תהליך בידוד עובר. א עובר תא 2-4 (חץ) זוהה בתמצית הזרעים (טיפת הקרנה) והוא מוקף בפסולת (שברי מעיל זרע). ב 'הפסולת שמסביב הוסרה באופן ידני באמצעות מחט. ג נימי הזכוכית הועברה לצד ימין את העובר (חץ). ד העובר נאסף ועכשיו בתוך כמה העוברים. E. הנימים (חץ) בטיפה האחרונה בעקבות שוטף. סולם = 50 מיקרומטר.
F igure 5. יישומים במורד הזרם של בידוד עובר ניתוחי התבטאות גנים א:. ההגברה PCR של WOX9, WOX2, WOX8 וACTIN11 13,14 בספריות cDNA (שנוצר כמתואר 8) בין 2-4 עוברים סלולריים שטפו 1x פעמים (מסלול 1) ועל הגנומי assay-DNA (מסלול 2) ב 'כתב:. עובר 8 תאים מבודדים מצמחים שנשאו AP MEA :: גאס המבנה היה מוכתם בשקופית בפתרון מכתים גאס סטנדרטי (לשכפל מRaissig et al, 2011 לאחר אישור. תא צמח, ASPB זכויות יוצרים). ג פלורסנט הכלאה באתרו (דגים): 8 תאי עובר היה הכלאה עם בדיקות חוזרת נגד centromeric (אדום), ו45s חזרות של rDNA (ירוק) לפני immunodetection העקיף 16. את תמונות הדגים כפולי הצבע היו מעולף עם counterstaining DAPI ותמונות DIC (מיקרוסקופ DM6000B epifluorescence, לייקה, גרמניה).
| בקשה | חיץ בידוד | חיץ יעד |
| RNA חילוץ (למשל להגברה וtranscriptomics) | 1x חיץ ראשון סטרנד (Invitrogen), 1 מ"מ DTT, 4% RNAseOUT | חיץ מיצוי RNA |
| מיצוי DNA (לדוגמה עבור סידור bisulfite) | 100 מ"מ טריס, 10 mM EDTA, pH 8 (TE) | ה-DNA מיצוי חיץ או 1x TE חיץ |
| ניתוח כתב ה-GFP | 1 M Glycin ב0.5x 1 MS | 1 M Glycin ב-MS 0.5x |
| ניתוח כתב גאס | מכתים את החיץ 2 בלי ה-X Gluc (מצע) | מכתים את החיץ עם X-Gluc (מצע) |
| פיש & Immunostaining | פוספט 100 מ"מ נאגר מלוח (PBS) | תמהיל Bisacryl (33:3) על Superfrost פלוס שקופית פלמר למשך 30 דקות: הופעל אקריל |
טבלת מס '1. ניתן להתאים בידוד ויעד עבור יישומים במורד הזרם מאגרים שונים. מאגרים לדרישות ניסוי ספציפיים Murashig 1 & Skoog בינוני. 2 למשל ג'פרסון et al., EMBO 6 (13) י, 3901-3907 (1987)..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פיתחנו פרוטוקול בידוד עובר שהוא מהיר, יעיל, וניתן להעביר בקלות למעבדות אחרות.
הציוד המתואר כאן מורכב ממיקרוסקופ ההפוך, micromanipulator, זכוכית microcapillaries, חולץ נימה אנכי וmicroinjector (איור 3 א). ההתקנה דומה לזה שתואר לבידוד תא בעלי חיים יחיד לניתוחי transcriptomics 17. כמו כן, אנו עובדים בהצלחה עם התקנה בסיסית יותר שבו זכוכית microcapillaries נמתחו באופן ידני על אש (ולחתוך עם סכין יהלום) ומופעלת באמצעות מעבדה פיפטה סטנדרטית (Pipetman P-200) במקום microinjector (איור 3). במקרה שmicrocapillary מצורף לפיפטה באמצעות צינורית גומי. 10 filtertips μl שמשו כדי להפוך את צמתים, שהיו עטופים עם parafilm כדי לגרום להם אוויר חזק. נימי - שנערך על ידי קצה פיפטה - הייתה קבועות בMICRזרוע omanipulator באמצעות קוביות קלקר וקלטת (איור 3). הגדרה בסיסית זה הוכיח להיות יעיל ואמין 8. עם זאת, אחד הקשיים העיקריים היה השמירה של אוויר חזק צמתים בין microcapillary ופיפטה, במיוחד כאשר שינוי הנימים. אימות והתאמת לחץ בנימים - מנת להבטיח גביית עובר מכוילת בנפח מינימאלי - יכולה להיות זמן רב באמצעות ההתקנה הבסיסית הזה. ההתקנה המשופרת עם micromanipulator נשלט הידראולי וחולץ מנימים אנכי היא שיפור ניכר וחוסכת זמן.
את המיומנויות הנדרשות ליישום המוצלח של שיטה זו הן בקלות להעברה. חמישה משתמשים במעבדה שלנו למדו את השיטה בהצלחה בזמן קצר יחסית. כמה הפשטות של הפרוטוקול הן אפשרית בהתאם לנוחותו של המשתמש במניפולציה. לדוגמה, אפשר לדלג על השלבים 2.2.5 ו2.2.6 תוךלנתח רק 5 siliques (במקום 15) ולנקות את סביבת העובר ביסודיות מלכלוך עם מחט טונגסטן (הליך זה הוחל ב8). סנכרון של פיתוח זרעים באמצעות סירוס והאבקה מתעכבת הוא פקולטטיבי אך מומלץ להגדיל את מספר העוברים באותו שלב התפתחותי, במיוחד בשלבים מוקדמים. בנוסף, יכול להיות מזורז בידוד עובר אם שלבי כביסה מושמטים, למשל עבור יישומי ציטולוגיה. יתר על כן, שקופית siliconization (שלב 1.3.2) אינו הכרחי למשתמשים שעובדים במהירות, באופן שבו עוברים להיצמד למשטח הזכוכית על פני זמן הוא לא בעיה.
בין אם סינון או ניקוי ידני מוחל, זה מאוד חשוב כדי למנוע לשאת מעל הרקמה של פסולת שיוצרת פוטנציאל לזיהום במורד הזרם או יישומי RNA-DNA. סוגיה זו הועלתה לאחרונה במחקר אפיון transcriptome בשיטה של בידוד עובר שונה18. בניגוד לפרוטוקול בידוד העובר בתפזורת שתואר כאן, החוקרים ניתח באופן ידני מעוברי ארבידופסיס בתוך זרעים בודדים באמצעות מחטים עדינות, תהליך ארוך הדורש מיומנויות נתיחה מצוינות. הליך זה נדרש, ככל הנראה 2 או יותר שוטף, כדי למנוע לשאת מעל תאים מזהמים אפשריים מרקמת זרעים שמסביב, מצב סביר נתקל בעת שימוש בשיטה זו בהתחשב בגודל הקטן של העוברים, הקשיים בגישה אליהם עם מחטים לנתיחה, והדביקות של תאים סמוכים. לעומת זאת, ההליך שלנו מאפשר (אני) הדילול של עוברים-נמתח מהזרעים על הריסוק והסביבה פסולת בנפח גדול (500 μl) לפני אוסף עובר, (ii) את הבחירה החזותית של עוברים נטולי דבק, זיהום פסולת, וכן (iii) דילול אפשרי RNA-זיהום דולף מקרע תאים אחר שלבי הכביסה. בעוד שניתן להשתמש רק בשלב לשטוף אחד אםהעוברים מופיעים נקיים מאוד, ונאספים בפחות מ -5 μl 8, שלב שני הוא שטיפה מומלץ, במיוחד עבור משתמשים בפעם הראשונה שעשויות לאסוף את העוברים במספר סבבים (כלומר עם נפח תוסף). עוברים צריכים להיות שנאסף כבפתרון קטן ככל האפשר, ומאפשרים דילול המקסימאלי של מזהמים פוטנציאליים בכל צעד וכביסה. כל סיבוב איסוף צריך להיות כל הזמן קצר (תוך 5-10 דקות), כדי לאפשר התאוששות מקסימלי עם שחרור לתוך הירידה לשטוף (נוכחות רבה יותר בנימים נוטה להקטין את שיעור ההחלמה). יתר על כן, ההעברה של העוברים שנאספו לתוך מדיום החילוץ (בעקבות הצעדים לשטוף) צריך רק להיות כרוכה במגע עם הפתיחה של קצה microcapillary ולא הטבילה של הקצה, כמו זה יכול גם להעביר את הפסולת דבוקה על הקיר מעל microcapillary הפתיחה. לבסוף, הנימים צריכים להיות שונה בין כל תמצית החדשה זרע.
הפרוטוקול שלנו מאפשר לכמה ירידותיישומי tream פשוט על ידי שימוש חיץ בידוד מתאים, כי לשמור על שלמות מולקולרית של RNA, ה-DNA, הכרומטין, כתב אנזים או פלורסנט. אנחנו מבודדים בהצלחה עובר בחיץ בידוד RNA-RNA מגן למיצוי וניתוחי transcriptomics 8, 1x TE-חיץ עבור ניתוחי מתילציה DNA 9, פוספט 100 מ"מ שנאגרו מלוח (PBS) לדגים וimmunostaining (יאניש, Grossniklaus וBaroux, לא פורסם, איור , פתרון מכתים ו5C) ללא מצע למבחני כתב גאס (19, איור 5). היישום רגיש ביותר לתנאי בידוד / איכות עובר בהחלט RNA מיצוי והגברה. הכמות של RNA חילוץ מעוברים מבודדים הייתה נמוכה למדי. מ ~ 30 עוברים בשלב התא 2-4 (ובכך 60-120 תאים בסך הכל) שנאמדו בסכום של ~ 1ng של רנ"א הכל מבוסס על שני Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) וקיוביט (Invitrogen) מדידות. Following-RNA חילוץ, RNA איכות אומתה על צ'יפ פיקו-RNA Agilent 6000 (Agilent Technologies). עם זאת, כמות הנמוכה של RNA חילוץ לא תמיד מספיק כדי לייצר פרופיל אמין. לפיכך, בדיקות נוספות חייבים להיעשות על החומר המוגבר (cDNA) (לדוגמא ה-PCR איתור גנים נמוכים באו לידי ביטוי, עובר ספציפי ו / או פרופיל Bioanalyzer).
לבסוף, היכולת לבודד עוברים על ידי קריטריונים חזותיים בפרוטוקול שלנו היא נכס אדיר. עוברים מאותה Silique (פירות ארבידופסיס) לא לפתח סינכרוני. לפיכך, עובד על כל תמציות Silique (למשל עבור ניתוחי RT-PCR או מבחני כמותיים כתב) אינו מאפשר התאמה מושלמת עם שלב התפתחותי נתון. בידוד עוברים בשלב התפתחותי מסוים פותר בעיה זו. בנוסף, מציגה בעיה דומה בעת עבודה עם מוטציות הטרוזיגוטיים בי siliques מכילים גנוטיפים עובר שונים. בידוד עוברים על פי קריטריונים חזותיים לדistinguish למשל פראי סוג מפנוטיפים עובר מוטציה מאפשר correlating ניתוחי המשך בעלי גנוטיפ. אנחנו עשינו את זה בהצלחה לנתח מתילציה DNA בלוקוסים ספציפיים בגנוטיפים שונים 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לטל Nawy ומרטין באייר לעצתם בבידוד עובר. MTR, VG, UG וCB פיתחו ציוד בידוד העובר. MTR, VG ו CB פיתחה פרוטוקול בידוד העובר. MTR, VG ו CB הקים את הפרוטוקול, בודד את העוברים, ועובר שנוצר cDNA, VG ביצע PCR, MTR מכתים גאס, ג'יי ג'יי ניסויי הדגים. MTR, VG, CG וUG כתבו את כתב היד. עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת ציריך, אחוות קרן מחקר רוש (לMTR), ומענקים מהקרן הלאומית שוויצרי (לUG וCB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
References
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).
