Summary
Riportiamo un metodo semplice ed efficace per isolare gli embrioni nelle prime fasi di sviluppo da
Abstract
In piante da fiore, l'embrione si sviluppa all'interno di un tessuto nutriente - l'endosperma - circondato dai tegumenti seminali materni (o tegumento). Come conseguenza, l'isolamento di embrioni vegetali nelle fasi (1 cellula per stadio globulare) è tecnicamente difficile a causa della loro relativa inaccessibilità. Efficiente dissezione manuale a stadi precoci è fortemente compromessa dalla piccola dimensione di giovani semi di Arabidopsis e l'adesività dell'embrione ai tessuti circostanti. Qui, descriviamo un metodo che permette l'isolamento efficiente di giovani embrioni di Arabidopsis, cedendo fino a 40 embrioni in 1 ora a 4 ore, a seconda dell'applicazione a valle. Gli embrioni vengono rilasciati nel buffer di isolamento di poco schiacciamento 250-750 semi con un pestello di plastica in una provetta Eppendorf. Un bicchiere microcapillare collegato a entrambi una pipetta di laboratorio standard (tramite un tubo di gomma) o di un microinjector comando idraulico viene utilizzato per raccogliere gli embrioni da luogo gocciolined su una diapositiva multi-pozzetto su un microscopio a luce invertita. Le competenze tecniche richieste sono semplici e facilmente trasferibili, e l'impostazione di base non richiede attrezzature costose. Gli embrioni raccolti sono adatti per una varietà di applicazioni a valle, come la RT-PCR, l'RNA sequenziamento, analisi di metilazione del DNA, ibridazione in situ fluorescente (FISH), immunoistochimica, e saggi di geni reporter.
Introduction
L'embrione di piante da fiore è circondato dal endosperma, un tessuto nutritivo derivato da un secondo evento fecondazione. Sia dell'embrione e dell'endosperma sono circondati da diversi strati di cellule del tegumento. Collettivamente questi tessuti formano un seme, che si sviluppano all'interno del frutto. Così, tessuti e cellule specifiche analisi di embrioni di Arabidopsis sono fortemente compromesse a causa della loro inaccessibilità. Ciò nonostante, gli embrioni nelle fasi tardo-globulari o poi sono relativamente ben suscettibili di dissezione manuale utilizzando aghi sottili di tungsteno con lo stereomicroscopio, o applicando una leggera pressione sul seme con pinze per estrarre loro. Tali tecniche sono state utilizzate con successo per l'analisi del trascrittoma o profilazione epigenoma come ibridazione di microarray, sequenziamento bisolfito, o RNA sequenza (ad esempio 1-3). Al contrario, gli studi di embrioni allo stadio di zigote globulare precoce restano tecnicamente impegnativo. Ad oggi, solo pochi studi hanno reported analisi trascrittoma sui giovani embrioni utilizzando sia microdissezione laser-capture (LCM) di tessuti embrionali di sezioni semi fissi 4 o estrazione manuale di singoli embrioni da dentro i semi utilizzando strumenti raffinati 5. Tuttavia, attrezzature LCM non è comunemente disponibile e l'estrazione manuale embrione nelle fasi iniziali in termini di tempo e che richiedono ottime capacità di dissezione che non sono facilmente trasferibili. Oltre alle analisi genome-wide, analisi in situ di espressione genica sono anche difficili da eseguire sui giovani, tutto il montaggio embrioni di Arabidopsis. In una certa misura, i giovani embrioni possono essere rilasciati su vetrini da microscopio con una leggera pressione sui semi e utilizzati per i saggi reporter gene o il rilevamento di proteine di immunoistochimica (per esempio vedi 6,7). Questa tecnica, tuttavia, non consente l'isolamento embrione ad alta produttività, ostacolando analisi quantitative.
Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo efficiente e rapidaper l'isolamento embrione precoce dai semi di Arabidopsis che è semplice da installare, facilmente trasferibile, e adatto per una varietà di applicazioni a valle. Il principio di base è quello di schiacciare delicatamente i semi - sezionato da giovani silique in una provetta Eppendorf con un pestello di plastica in un buffer di isolamento adeguato. L'estratto di semi viene posto in goccioline in una diapositiva multi-pozzetto ed esaminato per la presenza di embrioni rilasciate nella fase desiderata utilizzando un microscopio invertito. Gli embrioni sono raccolti utilizzando un bicchiere microcapillare attaccato ad un microinjector o una pipetta di laboratorio standard. Per applicazioni molecolari, gli embrioni vengono lavati due volte mediante ripetute rilascio in gocce di nuovo buffer isolamento prima di trasferirli al buffer di destinazione in un volume minimo. Per le applicazioni citologici (saggi di giornalista, immunoistochimica, FISH), fasi di lavaggio possono essere omessi.
Il metodo offre numerosi vantaggi: (i) cede 25-40 embrioni in ~ 45 min per app citologicacazioni o in 3-4 hr per applicazioni molecolari (comprese le fasi di lavaggio), (ii) permette l'isolamento degli stadi embrionali specifici, (iii) è facilmente trasferibile ad altre persone e laboratori grazie alla sua semplice configurazione, (iv) richiede attrezzature conveniente per la configurazione di base che è suscettibile di aggiornamenti, e (v) è stato utilizzato con successo per varie applicazioni a valle come RNA sequenziamento 8, gene-specifico DNA-metilazione analisi 9, saggi Reporter (10 e Raissig et al., in prep.) e FISH (J. Jaenisch, U. Grossniklaus, C. Baroux inedito, vedi figura 5).
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Protocol
La procedura è riassunto nel diagramma di flusso mostrato in Figura 1. Il microcapillari e il setup strumentale sono mostrati in Figura 2 e Figura 3, e fasi tipiche di isolamento embrioni sono mostrati in Figura 4.
1. Materiale e Buffer Preparazione
1.1 Silicon rivestimento di vetro microcapillari
- Collocare il microcapillari in una provetta Falcon 15 con ~ 5 ml di Sigmacote (Sigma) e capovolgere varie volte.
- Rimuovere la soluzione, porre la provetta Falcon contenente i capillari in un foglio di alluminio e cuocere per 3 ore a 60 ° C. Conservare a temperatura ambiente.
1.2 Ottenere ~ 50-100 micron di diametro punte microcapillare
- Pull 1 millimetro di diametro in vetro capillari sia manualmente su un becco Bunsen o utilizzando un estrattore commerciale (verticale filamento estrattore o micropipetta estrattore).
- Utilizzare un diamante-punta penna o la lama per tagliare la punta del capillare tirato per creare l'apertura desiderata. Selezionare la migliore forma di capillari in un microscopio stereo. L'apertura dovrebbe essere 50-100 micron (Figura 2).
1.3 Preparazione del vetrino
- Siliconize vetrini puliti coprendo tutti i pozzetti con Sigmacote (~ 1 ml / slide) per 5 minuti, togliere. Cuocere 3 ore in un foglio di alluminio. Conservare a temperatura ambiente.
- Lavare i multi-pozzetto di vetro preparati microscopici per 10 min a 10% SDS, 2 x 2 min in acqua priva di nucleasi (autoclave DEPC-DDH 2 O), 2 min in etanolo al 70%, 2 min a 100% di etanolo, aria asciugare. Tutti i passaggi sono fatti in autoclave vasetti Vaschette. Le diapositive possono essere riutilizzati più volte fornendo un'accurata pulizia tra ogni utilizzo.
- Appena prima di embrione isolamento diffusione ~ 0,5 ml di 10 mg / ml di sieroalbumina bovina (BSA) con una pipetta su tutta la superficie di ogni pozzetto e asciugare.
1.4 Microscopio e configurazione capillare
<ol>1.5 Buffer
La tabella 1 riporta l'isolamento e la destinazione buffer a seconda delle applicazioni a valle.
- Preparare ~ 1 ml di tampone di isolamento per campione al momento dell'uso e tenerlo in ghiaccio.
- Preparare il buffer di destinazione in una provetta Eppendorf ml basso legame 0,5 su ghiaccio (applicazioni molecolari) o su un vetrino da microscopio (applicazioni citologici) in una camera umida.
2. Seed Dissection e Embryo Estrazione
2.1 Sincronizzazione di sviluppo del seme
- Evirare fiori e tenerli 2 giorni in camera di crescita, evitando il contatto dei pistilli vista con altri fiori, poi li (ad esempio 11) impollinare.
- Provare la fase di sviluppo sotto le condizioni di crescita da parte di indagine microscopica di semi liquidati. Con le nostre condizioni di crescita (16 ore luce a 21 ° C, 8 ore al buio a 18 ° C e 70% di umidità) semi raccolti 2,5 giorni dopo l'impollinazione (DAP) ha prodotto principalmente 2-4 embrioni di cellule e semi raccolti 3,5-4 DAP prodotto globulare embrioni.
2.2 Seed Dissection e rottura
- Rimuovere il seeds 10-15 silique (~ 2,5 DAP) sotto uno stereomicroscopio con una pinza e aghi di insulina.
- Immergere i semi in 20 microlitri di buffer di isolamento in una provetta Eppendorf da 2 ml a fondo rotondo posto sul ghiaccio.
- Schiacciare delicatamente i semi con un pestello in plastica (pre-puliti con il 10% SDS, sciacquati con DEPC-DDH 2 O e lavato con etanolo al 70%) per liberare gli embrioni fino a quando l'estratto di semi è nuvoloso. La forza da applicare è determinato da ogni utente al momento di prova.
- Lavare pestello con 300 ml di buffer di isolamento per lavare il pestello e diluire il campione.
- Spin-down l'estratto a 5.000 xg per 5 sec. Risospendere delicatamente l'estratto pellet pipettando su e giù 2-3 volte.
- Filtrare l'estratto con una rete di nylon 30 micron (montati su adattatori di tubo, ad esempio da PartecCelltricks). Sciacquare la maglia con un buffer di isolamento supplementare di 200 microlitri.
3. Embrione di isolamento
3.1 Preparazione del vetrino
- <li> Inserire una pulita, BSA-rivestito e siliconato slitta multi-bene sul palco del microscopio invertito, risospendere l'estratto di semi filtrato pipettando delicatamente su e giù e pipettare 2 gocce di estratto di semi di 40-50 ml in 1 o 2 vasche . Vagliatura solo 1 o 2 gocce alla volta impedisce l'evaporazione del campione.
- Luogo 50 ml di tampone di isolamento fresco (1 ° goccia lavaggio) in un pozzo di una diapositiva diversa preparato come prima. Mantenere questa diapositiva in una coperta, camera umida per evitare l'evaporazione.
3.2 schermo, pulire, raccogliere
- Schermare le gocce di estratto di semi di embrioni allo stadio desiderato con l'obiettivo di ingrandimento di 10x. Se necessario, confermare il palco con l'ingrandimento 20x. Gli embrioni di solito si depositano sul fondo della diapositiva.
- Rimuovere manualmente i detriti intorno all'embrione con un ago di tungsteno, un ago da insulina o apparecchiature simili.
- Spostare il capillare di vetro vicino l'embrione con il micromanipolatore, take l'embrione con il minimo soluzione possibile.
- Raccogliere diversi embrioni (p.es. tutti un'unica goccia) e rilasciarli in 1 st goccia del lavaggio (applicazione molecolare) o in buffer di destinazione (applicazioni citologici). Ogni round di raccolta deve essere mantenuta entro 5-10 min e gli embrioni devono essere raccolti in un volume minimo (il volume totale di tutti i giri di raccolta deve essere <5 ml).
- Ripetere lo screening e raccolta fino alla quantità desiderata di embrioni viene raccolto in 1 ° goccia il lavaggio (centralmente, se possibile, per facilitare il raccoglimento).
- Ricordare tutti gli embrioni in una volta dalla caduta di lavaggio (se i detriti sono riportati, rimuoverli con un ago prima di raccoglimento).
- Rilasciare gli embrioni in una goccia di lavaggio 2 ° di 50 microlitri. Ripetere 3.2.6.
- Rilasciare gli embrioni nel buffer di destinazione. Il trasferimento dovrebbe coinvolgere solo un contatto, e non ad immersione, della punta capillare.
- Sostituire il microcapilLary per il campione successivo.
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Representative Results
Nostra procedura di isolamento embrione (Figura 1) consente l'isolamento di fino a 40 embrioni in 4 ore se lavaggi vengono eseguiti, ad esempio per applicazioni molecolari, o in meno di un'ora se lavaggi sono omessi, ad esempio per applicazioni citologici. Figura 2 visualizza alta e bassa punte microcapillari qualità e la Figura 3 mostra la configurazione della macchina isolamento embrione. Figura 4 mostra il processo di isolamento embrione sul microscopio invertito.
Abbiamo applicato con successo la nostra procedura per varie applicazioni pubblicate in diversi articoli recenti. Il metodo è stato originariamente sviluppato per analizzare il contributo dei genitori per primi trascrittoma embrionale. Embrioni ibridi generati attraverso incroci tra due diverse accessioni di Arabidopsis (Landsberg erecta (L er) e Columbia (Col-0)) sono stati isolati nella fase cellula 2-4. L'RNA totale è stato estratto, cDNAle biblioteche sono state prodotte utilizzando amplificazione lineare e sequenziati su una solida piattaforma. Le trascrittomi allele-specifici sono stati generati sulla base di analisi di SNP 8. Per controllare le nostre librerie di cDNA embrionali prima del sequenziamento abbiamo amplificato trascrizioni embrione-specifici, WUSCHEL-homeobox 2, 8 e 9 (WOX2, WOX8, WOX9) e ACTIN 11 (13,14, Figura 5A).
Inoltre, questo metodo è stato usato per isolare giovani embrioni per analizzare i modelli embrionali DNA-metilazione in loci specifici nel genoma. Gli embrioni sono stati isolati e lavati in 1x TE-buffer. Su piccola scala sequenziamento bisolfito è stata eseguita come descritto 9,15.
Allo stesso modo, l'isolamento embrione è rivelato molto utile in saggi di geni reporter con bassa espressione embrionale, e dove il tegumento materna confonde rilevamento o è mascherato da giornalista espressione nei tessuti che circondano l'embrione (endosperma, tegumento). Embrioni carr ying il transgene giornalista sono macchiati (ß-glucuronidasi, GUS) o analizzato direttamente (verde o rosso fluorescente proteine; GFP, RFP) a seguito di isolamento. Un esempio è dato in Figura 5B per embrioni che esprimono un gene reporter GUS sotto il controllo del promotore MEDEA (p MEA) 10. La relativamente facilità con cui molti embrioni possono essere isolati permette anche per le analisi quantitative (ad esempio il numero di embrioni tinto in diversi background genetici, Raissig, Grossniklaus et al., In preparazione).
Infine, abbiamo applicato con successo ibridazione in situ fluorescente (FISH) e di tecniche di immunoistochimica per studiare l'architettura nucleare in embrioni isolati incorporati in pastiglie acrilamide su diapositive. Un esempio di utilizzo di sonde FISH contro le ripetizioni del centromero e regioni organizzando nucleolari è mostrato in Figura 5C.
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Figura 1. Diagramma di flusso della procedura di isolamento embrione Il protocollo è diviso in tre parti: 1 - Preparazione del materiale; 2 - Seed dissezione; 3 - isolamento Embrione..
Figura 2. Punte microcapillare. A. suggerimenti microcapillari di alta qualità con una progressiva apertura di circa 100 micron. B. suggerimenti microcapillare bassa qualità con ampia apertura e contorno irregolare (quelle punte sono accettabili solo per applicazioni citologici). Barra di scala: 2 mm.
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Figura 3. Impostare dell'isolamento microscopio dell'embrione. A. e B. Screening viene eseguita su vetrini da microscopio sotto un microscopio invertito. Embrioni vengono raccolti usando un bicchiere microcapillare fissato su un micromanipolatore per controllare con precisione la sua posizione (vedi anche figura 4) e collegamento sia ai microinjector (A) o standard di laboratorio pipetta (B). A. Il vetro microcapillare è collegato a una controllata idraulicamente microinjector (es Eppendorf cellulare tram Vario) per un controllo preciso durante embrione raccolta B. Il vetro microcapillare è attaccato ad una P-200 pipetta standard attraverso un tubo di gomma flessibile. Di raccolta di embrioni e il rilascio è controllato girando la ruota di calibrazione della pipetta. Cut-end puntali sono utilizzati come connettori e le giunzioni sono sigillate con parafilm. Il microcapillary è fissato sul micromanipolatore tramite blocchi di polistirolo, tubi Falcon e nastro.
Figura 4. Processo di isolamento degli embrioni. A. Un 2-4 cellule dell'embrione (freccia) è stato identificato nel estratto di semi (screening di goccia) ed è circondato da detriti (frammenti di semi cappotto). B. I detriti circostante è stato rimosso manualmente utilizzando un ago. C. Il capillare di vetro è stato spostato accanto dell'embrione (freccia). D. L'embrione è stato raccolto ed è ora all'interno del capillare (freccia). E. Diversi embrioni all'ultima goccia dopo lavaggi. Di scala = 50 micron.
F igura 5. Applicazioni a valle di isolamento embrione A. analisi di espressione genica:. Amplificazione PCR di WOX9, WOX2, WOX8 e ACTIN11 13,14 su librerie di cDNA (generato come descritto 8) 2-4 embrioni di cellule lavate 1x volte (prima corsia) e sulla genomica . DNA (2 ° corsia) B. saggio di Reporter: un embrione di 8 cellule isolate da piante che portano ap MEA :: GUS costrutto era macchiato su un vetrino in una soluzione colorante GUS standard (riprodotto da Raissig et al, 2011 dopo il permesso del. Plant Cell, ASPB copyright). C. Ibridazione fluorescente in situ (FISH): un embrione di 8 cellule è stato ibridato con sonde contro ripetizioni centromeriche (rosso) e 45S rDNA ripete (verde) prima immunorilevazione indiretto 16. Le immagini FISH a due colori sono stati sovrapposti con la colorazione di contrasto DAPI e immagini DIC (DM6000B epifluorescenza microscopio, Leica, Germania).
| Applicazione | Buffer di isolamento | Il buffer di destinazione |
| Estrazione di RNA (ad esempio per l'amplificazione e la trascrittomica) | 1x tampone First-Strand (Invitrogen), 1 mM DTT, 4% RNAseOUT | Tampone di estrazione dell'RNA |
| Estrazione del DNA (ad esempio per sequenziamento bisolfito) | 100 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 8 (TE) | DNA estrazione tampone o 1x tampone TE |
| Analisi giornalista GFP | 1 M Glycin a 0.5x MS 1 | 1 M Glycin a 0.5x MS |
| Analisi giornalista GUS | colorazione tampone 2 senza X-Gluc (substrato) | colorazione buffer con X-Gluc (substrato) |
| FISH & Immunocolorazione | Tampone 100 mM fosfato (PBS) | attivato Acryl: mix Bisacryl (33:3) su un Superfrost Plus. slide-polimerizzare per 30 min |
Tabella 1. Isolamento e la destinazione buffer per diverse applicazioni a valle. Gli ammortizzatori possono essere adattati alle esigenze sperimentali specifici. 1 Murashig & Skoog. 2 ad es Jefferson et al., EMBO J. 6 (13), 3901-3907 (1987).
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Discussion
Abbiamo sviluppato un protocollo di isolamento embrione che è rapido, efficace, e possono essere facilmente trasferiti ad altri laboratori.
L'apparecchiatura descritta qui consiste di un microscopio invertito, un micromanipolatore, vetro microcapillari, un estrattore verticale filamento e un microinjector (Figura 3A). La configurazione è simile a quella descritta per l'isolamento singola cellula animale per transcrittomica analisi 17. Abbiamo anche lavorato con successo con una configurazione più semplice dove il vetro microcapillari stati tesa manualmente su una fiamma (e tagliare con una lama di diamante) e gestito tramite una pipetta di laboratorio standard (Pipetman P-200) al posto di un microinjector (Figura 3B). In quel caso il microcapillare era attaccato alla pipetta tramite un tubo di gomma. Filtrini 10 microlitri sono stati utilizzati per effettuare le giunzioni, che sono state avvolte con parafilm per renderli a tenuta d'aria. Il capillare - detenuta dalla punta della pipetta - è stato fissato sul micrbraccio omanipulator con blocchi di polistirolo e nastro (Figura 3B). Questa configurazione di base ha dimostrato di essere efficiente e affidabile 8. Tuttavia, uno dei maggiori difficoltà fu il mantenimento delle giunzioni ermetiche tra il microcapillare e la pipetta, soprattutto quando cambia il capillare. Verifica e regolazione della pressione nel capillare - per garantire una raccolta di embrioni messo a punto in un volume minimo - può richiedere molto tempo con questa configurazione di base. La migliore configurazione con un micromanipolatore a comando idraulico e un estrattore verticale filamento è un notevole miglioramento e fa risparmiare tempo.
Le competenze richieste per l'applicazione di successo di questo metodo sono facilmente trasferibili. Cinque utenti nel nostro laboratorio appreso correttamente il metodo in un tempo relativamente breve. Alcune semplificazioni del protocollo sono possibile a seconda facilità dell'utente in manipolazione. Ad esempio, è possibile saltare i passaggi 2.2.5 e 2.2.6, mentredissezione solo 5 silique (invece di 15) e la pulizia dei dintorni embrioni accuratamente da residui con un ago di tungsteno (questa procedura è stata applicata in 8). Sincronizzazione di sviluppo del seme attraverso evirazione e ritardato l'impollinazione è facoltativo ma consigliato per aumentare il numero di embrioni, allo stesso stadio di sviluppo, in particolare nelle fasi iniziali. Inoltre, l'isolamento embrione può essere accelerato se i lavaggi vengono omessi, ad esempio per applicazioni citologici. Inoltre, siliconizzazione scivolo (punto 1.3.2) non è necessario per gli utenti che lavorano in modo rapido, in modo tale che gli embrioni che si attaccano alla superficie del vetro nel tempo non è un problema.
Se il filtro o la pulizia manuale viene applicata, è estremamente importante per evitare il riporto di detriti dei tessuti che crea una potenziale contaminazione di RNA a valle o le applicazioni del DNA. Questo problema è stato sollevato di recente in uno studio del trascrittoma profilazione utilizzando un diverso metodo di isolamento embrione18. Per contrasto con il protocollo di isolamento embrione massa qui descritto, gli autori sezionati gli embrioni di Arabidopsis manualmente all'interno dei singoli semi utilizzando aghi sottili, una lunga procedura che richiede ottime capacità di dissezione. Questa procedura, apparentemente richiesto 2 o più lavaggi per evitare il riporto di eventuali cellule contaminanti dal tessuto circostante seme, una situazione probabilmente incontrato quando si utilizza questo metodo data la piccola dimensione degli embrioni, le difficoltà di accesso con gli aghi di dissezione e l'adesività delle cellule circostanti. Per contro, la nostra procedura consente (i) la diluizione della embrioni-estruso dai semi-upon frantumazione e detriti circonda in un volume grande (500 microlitri) prima raccolta di embrioni, (ii) la selezione visuale di embrioni privi di adesivo, contaminando detriti, e (iii) la diluizione di possibili contaminazioni RNA-fuoriuscita dalla rottura di cellule-by le fasi di lavaggio. Mentre è possibile utilizzare una sola fase di lavaggio se ilembrioni appaiono molto pulito e sono raccolti in meno di 5 ml 8, una seconda fase di lavaggio è consigliato, soprattutto per i nuovi utenti che possono raccogliere gli embrioni in più turni (cioè con volume di additivo). Gli embrioni devono essere raccolti in appena soluzione possibile, consentendo la diluizione massima di potenziali contaminanti in ogni fase di lavaggio. Ogni turno di raccolta dovrebbe essere breve (entro 5-10 minuti) per consentire il massimo recupero al rilascio nella goccia di lavaggio (presenza più nel capillare tende a ridurre il tasso di recupero). Inoltre, il trasferimento degli embrioni prelevati nel mezzo di estrazione (seguendo le fasi di lavaggio) dovrebbe comportare un contatto soltanto con l'apertura della punta microcapillare e non immersione della punta, poiché questa potrebbe anche trasferire i detriti attaccare sulla parete sopra microcapillare l'apertura. Infine, il capillare dovrebbe essere cambiato tra ogni nuovo estratto di semi.
Il nostro protocollo consente per diversi downsapplicazioni tream, semplicemente utilizzando un buffer di isolamento appropriato che preservare l'integrità molecolare di RNA, DNA, cromatina, giornalista enzima o fluorescente. Abbiamo isolato con successo gli embrioni nel buffer di isolamento dell'RNA-protettivo per l'estrazione dell'RNA e analisi trascrittomica 8, 1x TE-tampone per le analisi di metilazione del DNA 9, 100 mM tampone fosfato (PBS) per il pesce e immunoistochimica (Jaenisch, Grossniklaus e Baroux, inedito, Figura 5C), e la soluzione di colorazione senza substrato per Gus saggi reporter (19, figura 5B). L'applicazione più sensibili alle condizioni di isolamento / qualità embrione è certamente Estrazione di RNA e amplificazione. La quantità di RNA estratto da embrioni isolati piuttosto basso. Da ~ 30 embrioni allo stadio di 2-4 cellule (quindi 60-120 cellule in tutto) abbiamo stimato un importo di ~ 1NG di RNA totale basati sia Bioanalizzatore Agilent 2100 (Agilent Technologies) e qubit misure (Invitrogen). Following estrazione di RNA, l'RNA di qualità è stato verificato su un Agilent RNA 6000 Pico Chip (Agilent Technologies). Tuttavia, la bassa quantità di RNA estratto non è sempre sufficiente a produrre un profilo affidabile. Pertanto, gli ulteriori controlli dovranno essere effettuati sul materiale amplificato (cDNA) (es. PCR di rilevazione a bassa espresso geni dell'embrione-specifici e / o un profilo Bioanalyzer).
Infine, la capacità di isolare gli embrioni da criteri visivi nel nostro protocollo è una grande risorsa. Embrioni della stessa siliqua (frutto Arabidopsis) non si sviluppano in sincronia. Così, lavorando su estratti Silique interi (ad esempio, per le analisi di RT-PCR o saggi giornalista quantitativi) non consente una perfetta correlazione con un determinato stadio di sviluppo. Isolamento di embrioni in una fase di sviluppo specifico risolve questo problema. Inoltre, un problema simile presenta quando si lavora con mutanti eterozigoti dove silique contengono differenti genotipi embrionali. Isolando gli embrioni in base a criteri visivi per distinguish esempio wild-type da fenotipi embrioni mutanti permette correlare le analisi a valle con il genotipo. Lo abbiamo fatto con successo per l'analisi di metilazione del DNA in loci specifici nei diversi genotipi 20.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Tal Nawy e Martin Bayer per i loro consigli su isolamento embrione. MTR, VG, UG e CB inventato l'attrezzatura isolamento embrione. MTR, VG e CB sviluppato il protocollo di isolamento embrione. MTR, VG e CB stabilito il protocollo, isolati gli embrioni, e embrione generato cDNA, VG eseguito la PCR, MTR la colorazione GUS, JJ esperimenti il pesce. MTR, VG, CG e UG ha scritto il manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dall'Università di Zurigo, una borsa di studio della Fondazione per la Ricerca Roche (a MTR), e sovvenzioni dal Fondo nazionale svizzero (di UG e CB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
References
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