Summary
我々は、より開発の初期段階で胚を単離するための効率的で簡単な方法を報告する
Abstract
胚乳 - - 母親の種子の外皮（または種皮）に囲まれた顕花植物では、胚は栄養組織内で開発しています。その結果、初期段階（球状ステージに1セル）での植物の胚の分離が技術的にそれらの相対的な到達不能のために挑戦している。早い段階での効率的な手動の郭清が強く若いシロイヌナズナ種子のサイズが小さく、周囲の組織への胚の接着性によって損なわれている。ここでは、下流のアプリケーションに応じて、1時間〜4時間で40胚まで降伏、若いシロイヌナズナ胚の効率的な分離を可能にする方法について説明します。胚はわずかにエッペンドルフチューブ内でプラスチック乳棒で250から750種を粉砕することにより単離緩衝液中に放出される。ガラスピペット（ゴムチューブを介して）または油圧制御マイクロインジェクターを滴場所から胚を収集するために使用される標準的な実験室のどちらかに接続されているマイクロキャピラリー倒立光学顕微鏡にマルチウェルスライド上のD。必要な技術的なスキルは、シンプルかつ簡単に譲渡され、基本的なセットアップは、高価な機器を必要としません。収集された胚は、例えばRT-PCR、RNA配列決定、DNAメチル化分析、in situハイブリダイゼーション（FISH） の蛍光、免疫染色、およびレポーター遺伝子アッセイなどの下流の種々の用途に適している。
Introduction
顕花植物の胚は胚乳、第二の受精イベントから派生した栄養組織に囲まれています。胚と胚乳の両方が種皮のいくつかの細胞層に囲まれています。総称して、これらの組織は、果実内部で開発する種子を形成。このように、組織及びシロイヌナズナ胚の細胞特異的な分析が強く、その到達不能が損なわれている。それにもかかわらず、後期球状以降の段階で胚は比較的よく実体顕微鏡下に細いタングステン針を使用して手動で切開の影響を受けやすい、またはそれらを抽出するために鉗子を使用して種子にわずかな圧力を加えることによってです。このような技術は、正常トランスクリプトームまたはそのようなマイクロアレイハイブリダイゼーション、バイサルファイトシークエンシング、又はRNA配列決定（ 例えば 1-3）としてエピゲノムプロファイリング解析に用いた。これとは対照的に、初期の球状ステージへの受精卵における胚の研究は技術的に困難なままです。現在までに、唯一のいくつかの研究では、担当者が持っている固定シードセクション4ま たは罰金ツール5を使用して、種子の中から個々の胚の手動抽出から胚組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）のいずれかを使用して若い胚でortedトランスクリプトーム解析。しかし、LCM装置は早い段階で一般的に利用可能と手動胚抽出ではないことは、時間が容易譲渡することはできません優れた解剖のスキルを消費して必要である。ゲノムワイドな解析に加えて、 その場遺伝子発現解析は、 シロイヌナズナの若者、ホールマウント胚で実行することも困難である。ある程度まで、若い胚は種子穏やかな圧力によって顕微鏡スライド上に解放することができ、（例えば6,7を参照）免疫染色によりレポーター遺伝子アッセイまたはタンパク質検出に使用される。この技術は、しかしながら、このようにして定量分析を妨げ、高スループット胚を分離することはできません。
したがって、我々は、効率的かつ迅速なプロトコルを開発した、簡単に譲渡、下流の様々なアプリケーションに適した設定が簡単であるシロイヌナズナ種子から初期胚の分離のために。適切な分離バッファにプラスチック乳棒を用いてエッペンドルフチューブの若い長角果から解剖 - 基本的な原理は、優しく、種子を粉砕することです。種子抽出物は、マルチウェルスライド上に液滴内に配置され、倒立顕微鏡を用いて所望の段階で放出胚の存在についてスクリーニングする。胚をマイクロインジェクターまたは標準的な実験室ピペットに装着マイクロキャピラリーガラスを使用して収集されます。分子のアプリケーションでは、胚は最小限のボリュームで宛先バッファに転送する前に、新しい分離バッファの滴に繰り返さリリースで2回洗浄する。細胞学的アプリケーション（レポーターアッセイ、免疫染色、FISH）、洗濯手順については省略することができます。
方法はいくつかの利点を提供します：（i）は、それは細胞学的アプリケーションのための〜45分で25-40の胚が得られlicationsまたは分子アプリケーション用の3-4時間で（洗浄ステップを含む）、（ⅱ）、特定胚の段階の分離を可能にし、（ⅲ）それは、その簡単なセットアップのために他の人や研究室へ簡単に譲渡され、（ⅳ）、それはアップグレードに従順である基本的なセットアップのための手頃な価格の機器が必要であり、および（v）それは正常なRNAシーケン8、遺伝子特異的なDNAメチル化分析9、レポーターアッセイ（10 Raissig らなど、様々なダウンストリームアプリケーションに使用されました）。準備、およびFISH（J.イェーニッシュ、U. Grossniklaus、未発表C. Baroux、 図5を参照）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
手順は、 図1に示すフローチャートに要約されている。マイクロキャピラリーや楽器のセットアップを図2及び図3に示されており、胚の分離の一般的な手順を図4に示す。
1。材料およびバッファの準備
ガラスマイクロキャピラリーの1.1シリコンコーティング
- Sigmacote（シグマ）の〜5mlで15ミリリットルファルコンチューブにマイクロキャピラリーを置き、数回転倒。
- 溶液を除去し、60℃でアルミホイルで毛細血管を含むファルコンチューブを配置し、3時間のためにそれらを焼く室温で保管してください。
1.2〜50〜100μmの直径のマイクロキャピラリーチップを入手
- 手動でブンゼンバーナーの上または商業プラー（垂直フィラメントプラーまたはマイクロピペットプラー）を使用して、どちらか1ミリメートル口径ガラスキャピラリーを引き出します。
- ダイヤモンドを使用してください先端のペンまたは所望の開口部を作成するために引っ張らキャピラリーの先端を切断する刃。実体顕微鏡下で最高の形の毛細血管を選択します。開口部は、50〜100ミクロン（ 図2）である必要があります。
1.3スライドの準備
- 5分間Sigmacote（〜1ミリリットル/スライド）を持つすべての井戸を覆うことにより、クリーンなスライドをシリコーンで覆う、取り外します。アルミホイルで焼く3時間。室温で保管してください。
- 10％SDS、ヌクレアーゼフリー水（DEPC-のddH 2 Oをオートクレーブ）、70％エタノールで2分、100％エタノールで2分間、空気中で2×2分で10分間のマルチウェルガラス顕微鏡スライドを洗う乾いた。すべてのステップはオートクレーブコプリンジャーで行われます。スライドは、各使用の間の徹底したクリーニングを提供することを複数回再利用することができる。
- 直前胚分離普及〜100.5μlのmg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）を各ウェルと空気乾燥の全面ピペットで。
1.4顕微鏡とキャピラリセットアップ
<OL>1.5バッファ
表1は、下流のアプリケーションに応じて分離し、先のバッファを示しています。
- 〜サンプル当たり1ミリリットル分離バッファが新たに前に使用し、氷の上でそれを維持する準備。
- 氷（分子アプリケーション）または湿潤チャンバー内顕微鏡スライド（細胞学的アプリケーション）で0.5ミリリットルエッペンドルフ低結合チューブに宛先バッファを準備します。
2。シード解剖と胚抽出
種子開発の2.1同期
- 花を去勢し、他の花で露光雌しべとの接触を回避しながら、成長室に2日間保管してください、その後、（ 例えば 11）、それらを受粉。
- クリア種子の微視的調査することにより、成長条件の下で開発の段階をテストします。当社の成長条件で（21で16時間明°C、18暗所8時間℃、70％湿度）種子は2.5日受粉後に収集（DAP）は、主に2-4細胞胚および種子は3.5収集もたらした - 4 DAPは球状もたらし胚。
2.2シード解剖と破裂
- Sを削除鉗子とインスリン針で実体顕微鏡下10-15長角果（〜2.5 DAP）からeeds。
- 氷上に置き2ミリリットル丸底エッペンドルフチューブに20μlの分離バッファ内の種子を浸す。
- 穏やか種子抽出物が濁っなるまで胚を放出するプラスチック乳棒（DEPC-のddH 2 Oで洗浄し、70％エタノールで洗浄し、10％SDSで洗浄済み）を用いて種子をつぶす。適用するための力は、トライアルの際、すべてのユーザによって決定されるべきである。
- 杵を洗って、サンプルを希釈する分離バッファ300μlのと乳棒をすすぐ。
- スピンダウン5秒5,000×gで抽出。優しく上下2〜3回ピペッティングしてペレット化エキスを再懸濁。
- 30μmのナイロンメッシュ（PartecCelltricks などから、チューブアダプタに取り付けられた）とエキスをフィルタリング。追加の200μlの分離バッファとメッシュをすすぐ。
3。胚の分離
3.1スライドの準備
- <李>場所倒立顕微鏡のステージ上でクリーン、BSA-コーティングとシリコン処理マルチウェルスライドは、上下に軽くピペッティングによってフィルタリング種子エキスを再懸濁および1または2ウェルに40〜50μlの種子エキスの2滴をピペット。一度に1〜2滴をスクリーニングすると、サンプルの蒸発を防ぎます。
- 前のようにして調製異なるスライドのウェル内の新鮮な分離バッファの代わりに50μlの（1 回目の洗浄の低下）。蒸発を防ぐために覆われ、湿度の高い室内でこのスライドしてください。
3.2画面、きれい、収集
- 10倍の倍率の対物レンズで所望の段階で胚のための種子エキスの液滴を選別。必要であれば、20倍の倍率でのステージを確認。胚は通常スライドの底に沈む。
- 手動タングステン針、インスリン注射針または類似の機器と胚の周り破片を除去。
- T、マイクロマニピュレータを用いた胚の近くにガラスキャピラリーを移動できるだけ少ないソリューションとして持つ胚までAKE。
- いくつかの胚を（ 例えばすべて1滴）を収集及び第 1 洗浄ドロップ（分子アプリケーション）または宛先バッファ（細胞学的ア プリケーション）でそれらを解放。 （すべて収集ラウンドの総容積は<5μlのでなければなりません）、最小限のボリュームに収集することができるべきである各収集ラウンドは5〜10分であり、胚内に保持されるべきである。
- 胚の所望の量を1 回目の洗浄の低下（中心、可能であれば、記憶を容易にする）で収集されるまで、スクリーニングやコレクションを繰り返します。
- 洗浄降下（破片が回想前に針でそれらを削除し、引き継がれている場合）から、一度にすべての胚を思い出す。
- 50μlの2 回目の洗浄ドロップに胚を離します。 3.2.6を繰り返します。
- 宛先バッファに胚を離します。転送は、キャピラリー先端の唯一の接触はなく、浸漬し、関与させるべきである。
- microcapilを交換次のサンプルのためのラリー。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
洗浄、分子のアプリケーションに、または洗浄の細胞学的ア プリケーションのために、たとえば 、省略されている場合、時間足らずで例えば 、実行している場合は私たちの胚の分離手順（ 図1）は、4時間で40胚までの分離を可能にします。2ディスプレイ高低図品質マイクロキャピラリー先端と図3は胚分離機のセットアップを、図4は、倒立顕微鏡で胚の分離のプロセスを表示します。
我々は成功し、いくつかの最近の記事に掲載さ様々なアプリケーションのために私たちの手順を適用した。方法は、もともと初期胚トランスクリプトームに親の貢献を分析するために開発されました。二つの異なるシロイヌナズナアク（ランツベルクエレクタ （L ER）とコロンビア（COL-0））との間で交配を介して生成ハイブリッド胚は2-4細胞の段階で分離した。全RNAを抽出し、cDNAをライブラリは、線形増幅を用いて製造し、固体プラットフォーム上で配列決定した。アレル特異的トランスクリプトームはSNP解析8に基づいて生成された。前の我々は胚特異的転写、WUSCHEL-ホメオボックス2、図8、図9（WOX2、WOX8、WOX9）とACTIN 11（13,14、 図5A）を増幅したシークエンスに当社胚cDNAライブラリーを制御する。
さらに、この方法は、ゲノム中の特定の遺伝子座において胚DNAメチル化パターンを分析する若い胚を単離するために使用した。胚を単離し、1×TE緩衝液中で洗浄した。小規模の重亜硫酸塩配列決定について説明9,15のように行った。
同様に、胚の分離は、低胚の発現とレポーター遺伝子アッセイでは非常に有用であることが証明され、どこ母性種皮が検出を困惑または胚を取り巻く組織におけるレポーター発現（胚乳、種皮）によってマスクされています。胚カー単離した後、（GFP、RFP緑色または赤色フローセントタンパク質）または直接分析、レポーター遺伝子を英するステンドです（GUSβ-グルクロニダーゼ）。例はMEDEAプロモーター （P MEA）10の制御下でGUSレポーター遺伝子を発現するための胚図5Bに示されている。比較的多くの胚をも定量分析（ 例えば 、異なる遺伝的背景、Raissig、Grossniklausら準備中で染色された胚の数）が可能に単離することができる容易さ。
最後に、我々は成功したin situハイブリダイゼーション（FISH）、スライド上のアクリルアミドパッドに埋め込 まれている孤立した胚において核のアーキテクチャを研究するための免疫染色技術で蛍光灯に適用。セントロメア繰り返すと核小体組織化領域に対するプローブを用いるFISHの例を図5Cに示されている。
1 "のfo：コンテンツ幅=" 5インチ "のfo：srcは=" / "SRC =" / files/ftp_upload/50371/50371fig1.jpg "をfiles/ftp_upload/50371/50371fig1highres.jpg />
図1。胚分離手順のフローチャートプロトコルは三つの部分に分かれています：1 -材料の準備、2 -シード·解剖、3 -胚分離。
図2。マイクロキャピラリーのヒント。100μm程度の円滑な開口部Aを高品質のマイクロキャピラリーチップ。B.広い開口部と不規則な輪郭（これらのヒントは、細胞診のみの用途に許容される）と低品質マイクロキャピラリーチップ。スケールバー：2ミリメートル。
ghres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50371/50371fig3.jpg "/>
図3。胚分離顕微鏡のセットアップ。A. B.及びスクリーニングは、倒立顕微鏡下顕微鏡スライド上で実行される。胚は、正確にその位置を（また、 図4を参照）を制御し、マイクロインジェクター（）または標準的な実験室ピペット（B）のどちらかに接続されている。A.マイクロキャピラリーガラスは油圧制御にリンクされているようにマイクロマニピュレータに固定されたマイクロキャピラリーガラスを使用して収集している胚コレクションB.ガラスマイクロキャピラリー中に正確に制御するためのマイクロインジェクター（ 例えばエッペンドルフセルトラムバリオ）はゴムフレックスチューブを介して標準的なP-200ピペットに取り付けられている。胚の収集および放出は、ピペットの校正ホイールを回しによって制御される。カット端ピペットチップは、コネクタとして使用され、接合部をパラフィルムで密封されている。マイルcrocapillaryは、ポリスチレンブロック、ファルコンチューブとテープを介してマイクロマニピュレータに固定されている。
図4。胚分離プロセス。A. 2-4細胞胚（矢印）は、種子抽出物中に同定された（スクリーニング滴）と破片（種皮の断片）に囲まれています。B.周囲の破片を除去し、手動で針を用いて。C.ガラスキャピラリーは、右胚（矢印）の横に移動しました。D.胚を回収し、洗浄後に最後の一滴で毛細血管（矢印）。E.いくつかの胚の中になりました。スケール=50μmである。
F igure 5。胚の分離の下流アプリケーションA.遺伝子発現解析：cDNAライブラリ上WOX9、WOX2、WOX8とACTIN11 13,14のPCR増幅（8説明されているように生成された）2-4細胞胚から1xの回（第1レーン）を洗浄し、ゲノム上DNA（第2レーン）B.レポーターアッセイ：AP MEAを運ぶ植物から分離した8細胞胚:: GUSコンストラクトは標準GUS染色液（Raissig らから再生中にスライド上に染色した、から許可後の2011年。植物細胞 、ASPB著作権）。 C.蛍光in-situハイブリダイゼーション（FISH）を：8細胞胚セントロメア反復（赤）と、間接的な免疫検出16前の45S rDNAの反復（緑）に対するプローブとハイブリダイズさせた。デュアルカラーFISH画像はDAPIで対比とDIC画像（DM6000B落射蛍光顕微鏡、ライカ、ドイツ）を重ねた。
| アプリケーション | 分離バッファ | 宛先バッファ |
| RNA抽出（増幅とトランスクリプトミクスのためなど ） | 1Xファーストストランドバッファ（Invitrogen社）、1mMのDTT、4％RNAseOUT | RNAの抽出緩衝液 |
| DNA抽出 （亜硫酸シング用など ） | 100mMのトリス、10mMのEDTA、pHを8（TE） | DNA抽出バッファーまたは1x TEバッファー |
| GFPレポーター解析 | 0.5倍で1 MグリシンMS 1 | 0.5X MSで1 Mグリシン |
| GUSレポーター解析 | X-Gluc（基板）を使用せずにバッファ2染色 | X-Gluc（基板） と染色バッファー |
| FISH＆免疫染色 | の100mMリン酸緩衝生理食塩水（PBS） | アクティブアクリル：30分間Superfrostプラススライド重合でBisacrylミックス（33:3） |
表1。別のダウンストリーム·アプリケーションのための単離および宛先バッファ。バッファは、具体的な実験の要件に適合させることができる。1 Murashig＆媒体をスクーグ。2 たとえばジェら、EMBO J. 6（13）、3901から3907（1987）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我々は、効果的な、迅速で胚分離プロトコルを開発し、容易に他の研究所に転送することができる。
ここで説明する機器は、倒立顕微鏡、マイクロマニピュレータ、ガラスマイクロキャピラリー、縦フィラメントプラーとマイクロインジェクター（ 図3A）で構成されています。セットアップは、トランスクリプトミクス解析17のための単一の動物細胞の単離のために記載したものと同様である。また、成功したガラスマイクロキャピラリーを手動で炎に掛け（とダイヤモンドブレードで切断）、代わりにマイクロインジェクターの標準的な実験ピペット（ピペットマンP-200）（ 図3B）を介して操作された多くの基本的なセットアップと働いた。その場合、マイクロキャピラリーは、ゴム管を介してピペットに取り付けた。 10μlのfiltertipsはそれらを気密にするためにパラフィルムで包んだ接合を作るために使用された。キャピラリー - ピペットチップによって保持は - MICRに固定されましたポリスチレンブロックとテープを使用omanipulatorアーム（ 図3B）。この基本的なセットアップでは、8効率的で信頼性があることが判明した。それにもかかわらず、主な困難の一つは毛細管を変更する場合は特に、微小ピペットとの間の気密接合を維持することであった。確認と毛細血管内の圧力を調整する - 最小限のボリュームで微調整された胚の収集を確保すること - この基本的なセットアップを使用して時間がかかることがあります。油圧制御マイクロマニピュレータと縦フィラメントプラーとの改善のセットアップはかなりの改善であり、時間を節約できます。
このメソッドが正常にアプリケーションに必要なスキルは簡単に譲渡されています。我々の研究室で5名のユーザが正常に比較的短時間での方法を学んだ。プロトコルのいくつかの簡素化は、操作中に、ユーザーの使いやすさに応じて可能です。例えば、それはステップ2.2.5と2.2.6一方をスキップすることが可能であるわずか5長角果を（代わりに15の）解剖とタングステン針（この手順は8に適用された）で破片から徹底的に胚の周囲を清掃。無力化と遅延受粉を通じて種子開発の同期は通性であるが、特に初期の段階で、同じ発達段階での胚の数を増やすことをお勧め。洗浄工程は、細胞学的なアプリケーションのために、例えば 、省略されている場合だけでなく、胚分離が促進されることができる。さらに、スライドシリコン処理（ステップ1.3.2）は、時間をかけてガラス面に付着する胚は問題ではないように、迅速に作業しているユーザーには必要ありません。
フィルタリングまたは手動掃除が適用されるか否か、それが下流のRNAまたはDNAアプリケーションのための潜在的な汚染を作成し、組織の破片のキャリーオーバーを避けるために非常に重要である。この問題は、胚の分離のさまざまな方法を使用してトランスクリプトームプロファイリング研究で最近育った18。バルク胚分離プロトコルに対照的に著者は、細い針を使用して個々の種子の中から手動で優れた解剖のスキルを必要とする長い手順をシロイヌナズナ胚を解剖し、ここで説明する。この手順では、明らかに胚、解剖針でそれらにアクセスすることの難しさの小さいサイズを指定して、この方法を使用するときに周囲の種子組織、おそらく遭遇した状況から可能な汚染の細胞のキャリーオーバーを避けるために2回以上の洗浄を必要とし、かつ接着性周囲の細胞の。これとは対照的に、我々の手続きは、接着剤を欠いた胚の（ii）の視覚的な選択粉砕と胚の収集前に大容量（500μL）で残骸を取り巻く時種子から胚押出しの（i）の希釈には、汚染、でき破片、および（iii）可能なRNA汚染漏れ破裂から洗浄ステップの細胞ごとの希釈。それは1つしかない場合、洗浄工程を使用することが可能であるが胚は非常にきれいに表示され、以下の5μlの8で収集され、第二の洗浄工程は、特にいくつかのラウンドで胚を収集することが初めてのユーザー（添加量とIE）のために、推奨されます。胚はすべての洗浄工程における潜在的な汚染物質の最大の希釈を可能にし、できるだけ少ないソリューションとしてに収集することができるべきである。各収集ラウンドは洗浄降下（キャピラリーで長く存在回収率が低下する傾向にある）にはリリース時に最大の回復を可能にするために（5〜10分以内）短くする必要があります。これは同様に上記のマイクロキャピラリー壁に付着ゴミを移す可能性があるのでさらに、抽出媒体（洗浄手順に従って）に収集された胚の転送のみ、マイクロキャピラリー先端ではなく、チップの浸漬の開口部との接触を関与させるべきであるオープニング。最後に、キャピラリーはそれぞれの新しい種子エキスとの間で変更する必要があります。
我々のプロトコルは、いくつかの浮き沈みが可能単にRNA、DNA、クロマチン、酵素又は蛍光レポーター分子の完全性を維持する適切な分離緩衝液を用いて、アプリケーションTREAM。我々は成功し、DNAメチル化解析のためのRNA抽出とトランスクリプトミクス解析8、1×TEバッファ用のRNA保護隔離バッファ9に胚を分離した100 mMリン酸は（イェーニッシュ、GrossniklausとBaroux、未発表、 図魚や免疫染色用緩衝生理食塩水（PBS） GUSレポーターアッセイ（19、 図5B）のための基材レス5C）、および染色液。分離条件/胚の品質に最も敏感なアプリケーションでは、確かに抽出と増幅をRNAである。隔離された胚から抽出されたRNAの量はかなり低いものであった。 2-4細胞期（したがって合計で60-120細胞）で約30胚から我々は、Agilent 2100バイオアナライザ（アジレント·テクノロジー）と量子ビット（インビトロジェン）測定の両方に基づいて全RNAの約1ngの量を推定した。 FollowingのRNA抽出、RNAの品質は、Agilent RNA 6000ピコチップ（アジレント·テクノロジー）で検証した。しかし、抽出されたRNAの量が少ないは、常に信頼性の高いプロファイルを生成するのに十分ではない。したがって、さらなるテストが（ 例えば 、PCR、低発現、胚特異的遺伝子および/ またはバイオアナライザプロファイルを検出する）（cDNA）を増幅した材料で行う必要があります。
最後に、我々のプロトコルで視覚的基準によって胚を分離する能力は大きな資産です。同じ長角果（ シロイヌナズナ果実）からの胚は同期発症しない。したがって、全体の長角果エキス（RT-PCR解析や定量レポーターアッセイ用など ）で作業すると、与えられた発達段階で完璧な相関関係を許可していません。特定の発達段階での胚を分離すると、この問題を解決します。長角果が異なる胚の遺伝子が含まれているヘテロ接合体変異で作業するときだけでなく、同様の問題が提示します。 A〜Dの視覚的な基準に基づいて分離する胚変異胚の表現型から、野生型など istinguishは、遺伝子型とダウンストリーム解析を関連付けることができます。我々は20の異なる遺伝子型の特定の遺伝子座でのDNAメチル化を解析するためにこれを正常に行っている。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
私たちは、胚の分離の彼らのアドバイスをタルNawyとマーティンバイエルに感謝したいと思います。 MTR、VG、UGおよびCBは、胚分離装置を考案した。 MTR、VGとCBが胚分離プロトコルを開発しました。 MTR、VGとCBは、プロトコルを確立し胚を単離し、胚cDNAを生成し、VGは、PCR、MTR GUS染色、JJ FISH実験を行った。 MTR、VG、CGとUGは、原稿を書いた。この作品は、チューリッヒ大学、ロシュ研究財団（MTR）に旅の仲間、そしてスイスの建国（UGとCBへ）からの補助金によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Sigmacote | SIGMA | SL2-100 ml | |
| RNAse OUT | Invitrogen (life technologies) | 10777-019 | |
| First- strand buffer | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| DTT | Invitrogen (life technologies) | 18064-022 | contained in Superscript II package |
| Bovine serum albumin (BSA) 100x =10 mg/ml | New England Biolabs Inc. | Different suppliers will also work | |
| Thin wall Capillaries 1.0 mm | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| DNA LoBind tube 0.5 ml | Vaudaux-Eppendorf | 0030108.035 | |
| CellTricsΔ 30 μm | PARTEC | 04-0042-2316 | |
| 5wells 10 mm diameter slides | Electron Microscopy Sciences | 63421-10 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Superfrost Plus slide | Thermo Fisher | J1800AMNZ | Menzel-Gläser |
| Tris | Amaresco | 0497 | |
| EDTA | Applichem | A2937 | |
| Glycin | Fluka | 50050 | |
| SDS pellets | Roth | CN30.3 | |
| Micro Pestle | VWR | 431-0094 | |
| Microfine insulin syringes | BD | U-100 | |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | |
| Ethanol | Schaurlau | ET00102500 | |
| Forceps N5 | Dumont | 0108-5 | |
| Bioanalyzer Pico Chip | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| EQUIPMENT | |||
| Inverted microscope | Nikon TMS (Japan), | ||
| Micromanipulator | Leitz | Leica | |
| Micomanipulator Post mount LH1 probe | Leica microsystems | 39430101 | Different brand will also do the work |
| Vertical filament puller | Sutter instrument | P-20 model | Other model are also suitable |
| Cell Tram vario | Vaudaux-Eppendorf | 5176.000.033 | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | 2100 | |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen (life technologies | ||
References
- Gehring, M., Bubb, K. L., Henikoff, S. Extensive demethylation of repetitive elements during seed development underlies gene imprinting. Science. 324, 1447-1451 (2009).
- Muller, B., Sheen, J. Cytokinin and auxin interaction in root stem-cell specification during early embryogenesis. Nature. 453, 1094-1097 (2008).
- Gehring, M., Missirian, V., Henikoff, S. Genomic analysis of parent-of-origin allelic expression in Arabidopsis thaliana seeds. PLoS One. 6, 23687-23 (2011).
- NSF-Funded Seed Project of Goldberg & Harada Laboratories [Internet]. , Available from: http://estdb.biology.ucla.edu/seed/ (2006).
- Xiang, D., et al. Genome-wide analysis reveals gene expression and metabolic network dynamics during embryo development in Arabidopsis. Plant Physiol. 156, 346-356 (2011).
- Nawy, T., et al. The GATA factor HANABA TARANU is required to position the proembryo boundary in the early Arabidopsis embryo. Dev Cell. 19, 103-113 (2010).
- Baroux, C., Pecinka, A., Fuchs, J., Schubert, I., Grossniklaus, U. The triploid endosperm genome of Arabidopsis adopts a peculiar, parental-dosage-dependent chromatin organization. Plant Cell. 19, 1782-1794 (2007).
- Autran, D., et al. Maternal epigenetic pathways control parental contributions to Arabidopsis early embryogenesis. Cell. 145, 707-719 (2011).
- Wohrmann, H. J., et al. Identification of a DNA methylation-independent imprinting control region at the Arabidopsis MEDEA locus. Genes Dev. 26, 1837-1850 (2012).
- Raissig, M. T., Baroux, C., Grossniklaus, U. Regulation and Flexibility of Genomic Imprinting during Seed Development. Plant Cell. 23, 16-26 (2011).
- Rea, M., et al. Determination of DNA methylation of imprinted genes in Arabidopsis endosperm. J. Vis Exp. 47 (47), e2327 (2011).
- SeedGenes Tutorial [Internet]. , Available from: http://www.seedgenes.org/Tutorial.html#Nomarski_Optics (2010).
- Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M., Laux, T. Differential expression of WOX genes mediates apical-basal axis formation in the Arabidopsis embryo. Dev Cell. 14, 867-876 (2008).
- Kohler, C., Page, D. R., Gagliardini, V., Grossniklaus, U. The Arabidopsis thaliana MEDEA Polycomb group protein controls expression of PHERES1 by parental imprinting. Nature. 37, 28-30 (2005).
- Epigenome NoE - protocol: Bisulfite sequencing of small DNA/cell samples [Internet]. , Available from: http://www.epigenesys.eu/images/stories/protocols/pdf/20111026124522_p35.pdf (2007).
- Fransz, P., De Jong, J. H., Lysak, M., Castiglione, M. R., Schubert, I. Interphase chromosomes in Arabidopsis are organized as well defined chromocenters from which euchromatin loops emanate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14584-14589 (2002).
- Morris, J., Singh, J. M., Eberwine, J. H. Transcriptome analysis of single cells. J. Vis. Exp. (50), e2634 (2011).
- Nodine, M. D., Bartel, D. P. Maternal and paternal genomes contribute equally to the transcriptome of early plant embryos. Nature. 482 (7383), (2012).
- Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. G. U. S. fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907 (1987).
- Schmidt, A., Wöhrmann, H., Raissig, M. T., Arand, J., Gheyselinck, J., Gagliardini, V., Heichinger, C., Walter, J., Grossniklaus, U. The Polycomb group protein MEDEA and the DNA methyltransferase MET1 interact in Arabidopsis to repress autonomous endosperm development. Plant J. 73 (5), In Press (1111).
