Summary
Kunststoff-Folien mit der Bezeichnung "biologisch abbaubar" sind im Handel erhältlich für die landwirtschaftliche Nutzung als Mulch. Bodenbearbeitung stellt eine attraktive Methode zur Verfügung, aber Abbau unter Feldbedingungen ist wenig bekannt. Der Zweck dieser Studie war es, Methoden zur Isolierung von Mutterboden Pilze und Bakterien, die Plastik Mulchfolien nach Feld Bestattung kolonisieren zu entwickeln.
Abstract
Fungi heimisch landwirtschaftlichen Böden, die im Handel erhältlichen biologisch abbaubaren Mulch (BDM) Filme kolonisiert wurden isoliert und auf eine mögliche Potenzial, Kunststoffe zersetzen. Normalerweise, wenn Formulierungen von Kunststoffen bekannt sind und eine Quelle des Ausgangsmaterials vorhanden ist, kann pulverförmigen Kunststoff in Agar-basierten Medien-und Abbau durch Visualisierung von Clearing-Zonen bestimmt ausgesetzt werden. Doch dieser Ansatz schlecht imitiert in situ Abbau von BDMs. Zuerst werden BDMs nicht als kleine Teilchen durch den Boden dispergiert. Zweitens werden BDMs nicht im Handel als reine Polymere erhältlich, sondern als Folien, die Zusätze (z. B. Füllstoffe, Weichmacher und Farbstoffe), die das mikrobielle Wachstum beeinflussen können. Die hier beschriebenen Verfahren wurden Isolate aus Boden vergraben Mulchfolien erworben werden. Pilz-Isolate aus ausgegraben BDMs erworben wurden einzeln für Wachstum auf einem Stück neue, entwesten BDMs oben definierten Medium ohne Kohlenstoffquelle e festgelegten getestetXCEPT Agar. Isolate, die auf BDMs wuchsen, wurden weiter in einem flüssigen Medium, wo BDMs waren die einzige hinzugefügt Kohlenstoffquelle getestet. Nach etwa zehn Wochen wurden Pilzbesiedlung und BDM Abbau durch Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Isolate wurden durch eine Analyse der ribosomalen RNA-Gen-Sequenzen identifiziert. Dieser Bericht beschreibt die Methoden zum Pilz isoliert, sondern auch Bakterien isoliert wurden mit diesen Methoden durch Einsetzen geeigneter Medien für Bakterien. Unsere Methodik sollte sich als nützlich erweisen für Studien, die Aufschlüsselung der intakten Kunststofffolien oder Produkte, für die Kunststoff-Rohstoffe sind entweder unbekannt oder nicht verfügbar. Doch unser Ansatz nicht ein quantitatives Verfahren zum Vergleich von Preisen BDM Abbau.
Introduction
Der Abbau ist historisch betrachtet worden eine unerwünschte Eigenschaft von Kunststoff-Polymere, weil Aufschlüsselung verkürzt Produkt Lebensdauer und Haltbarkeit. Vor kurzem hat das Bewusstsein für die Umweltprobleme durch Plastikmüll in der natürlichen Umgebung präsentiert 1,2,3 gemacht biologisch abbaubare Kunststoffe eine attraktive Alternative zu herkömmlichen Kunststoffen. Degradation (definiert als strukturelle Veränderungen, Fragmentierung und Reduktion im Molekulargewicht, Integrität und Stärke 4,5) erfolgt über eine Reihe von Veranstaltungen, darunter sowohl abiotische Prozesse (thermische Belastung, Photo-Oxidation, Hydrolyse, Erosion und mechanischer Belastung), und biologischen Abbau 6. Während abiotische Prozesse das Fragment Größe und die Eigenschaften von Kunststoffen verändern können, sind Mikroorganismen für ihre ultimative Mineralisierung zu Wasser und Kohlendioxid (unter aeroben Bedingungen) und / oder Methan (unter anaeroben Bedingungen) erforderlich.
Eine wesentliche Nische fürbiologisch abbaubare Kunststoffe gibt es in der Landwirtschaft, wo Kunststoff Mulch verwendet werden, um Unkraut zu verhindern, um die Bodenfeuchtigkeit zu erhalten und zu erhöhen Bodentemperaturen 7,8. Hunderttausende von Hektar in den Vereinigten Staaten allein sind mit Kunststoff Mulch 9, einschließlich Mulch aus biologisch abbaubarem Kunststoff abgedeckt. Nach einer Ernte Vegetationsperiode, sind die Optionen für die Entsorgung von biologisch abbaubaren Mulch (BDM) Entsorgung in einer Deponie, Verbrennung zur Energierückgewinnung 10, Abbau über Kompostierung oder Abbau im Boden nach Bodenbearbeitung 11. Von diesen sind die wenigsten arbeitsintensive Schicksal Pflügen BDMs in den Boden, aber ohne effizienten Abbau und Mineralisierung während der Nicht-crop Monate (in der Regel im Winter), konnte Kunststoff Fragmente bleiben und stören Landmaschinen im Frühjahr Bodenbearbeitung und Pflanzung, und verbleiben in der Umwelt, wo sie erhebliche Auswirkungen auf Wildtiere, Pflanzen und microbiota 1,2,3,10.
12 aufgetreten. Im Winter würde Bodentemperaturen an den meisten Standorten niedriger sein als entweder von diesen Temperaturen, vermutlich was zu noch niedrigeren mikrobielle Aktivität und folglich weniger Mineralisierung. Neben Abbauraten verlangsamen, hat Missbrauch des Begriffs "biologisch abbaubar" zu misstrauen dieser Produkte durch die Verbraucher 13,14, einschließlich der in der Landwirtschaft geführt. Biologischer Abbau ist die Umwandlungvon Polymeren zu Kohlendioxid (und / oder Methan) und Wasser 14 durch natürlich vorkommende Mikroorganismen 4. Daher müssen biologischen chemisch gemessen werden, die körperliche Vereinigung von Mikroorganismen mit einem Substrat bedeutet nicht, mikrobiellen Abbau dieses Materials.
Als Teil der Bemühungen um eine nachhaltige Nutzung von BDMs in der Landwirtschaft untersuchen, diese Studie auf die Entdeckung Mikroorganismen stammt aus landwirtschaftlichen Böden, die sie besiedeln und zersetzen handelsüblichen BDMs konzentriert. Standard-Prüfverfahren wurden für chemisch Messung der Abbau von biologisch abbaubaren Kunststoffen durch abiotische und biologische Mittel 15,16,17 veröffentlicht. Allerdings sind diese Methoden nicht auf Abbau von Kunststoffen durch individuelle mikrobielle Spezies, oder stellen Methoden für ihre Isolation. Die Methodik hierin ähnelt mehr Standard-Methoden entwickelt, um Kunststoffe für die Resistenz gegen mikrobiellen Abbau nach Impfen Proben mit Pilzsporen bewerten18,19.
Wenn Formulierungen von Kunststoffen bekannt sind und eine Quelle des Ausgangsmaterials vorhanden ist, kann pulverförmigen Kunststoff in Agar-basierten Medien-und Abbau durch Visualisierung von Clearing-Zonen 13 bestimmt ausgesetzt werden. Diese Methode wurde bereits von Mikroorganismen, dass Polymere wie Polyurethan 20 verschlechtern, Poly (butylensuccinat-co-adipat) 21 und Poly (Milchsäure) 22 zu identifizieren. Ein ähnliches Verfahren beinhaltet das Suspendieren reinen pulverförmigen Kunststoff in flüssigem Medium, in dem der Kunststoff die einzige Kohlenstoffquelle 20,23. Während diese Verfahren den Vorteil einer definierten System haben, sie schlecht zu imitieren in situ Abbau von BDMs. Zuerst wird die Oberfläche anders, weil BDMs nicht in kleine Teilchen durch den Boden dispergiert sind, sondern, verkauft und verwendet wie Folien verteilt. Zweitens ist die chemische Zusammensetzung von BDMs aus reinem Polymeren. BDMs enthalten in der Regel Additive, wieFüllstoffe, Weichmacher und Farbstoffe, und diese Additive beeinflussen kann mikrobielles Wachstum und damit die Geschwindigkeit der Mineralisierung. Aus diesem Grund, und weil die Zusammensetzung bestimmter kommerzielle Filme in dieser Studie waren proprietär, Kunststoff-Folie in diesem Bereich bereits Form wurde verwendet, um Pilze und Bakterien zu isolieren. Der Einfachheit halber werden die folgenden Methoden nur für Pilze beschrieben, mit Änderungen hingewiesen gegebenenfalls für bakterielle Isolierungen.
In einer aktuellen Studie 24 wurden drei kommerziell erhältlichen BDMs und ein experimenteller Film auf landwirtschaftlichen Standorten in drei verschiedenen Regionen der Vereinigten Staaten für eine Vegetationsperiode, und anschließend in mesh (250 Mikrometer) Taschen gelegt und begraben für einen Winter im Boden an den gleichen Standorten. Die 250 micron Maschen erlauben Pilzhyphen zu durchdringen, während ohne Wurzeln und die meisten Bodenfauna und der Minimierung der Eingriffe Boden 25,26. Nylon Materialien zu verhindern Beutel Abbau im Boden. Nach Aushub, fungal Isolate wurden vom BDM Stücke gewonnen und beurteilt für Wachstum auf Minimalmedium ohne Kohlenstoffquelle außer dem Agar und einem 5 cm x 5 cm Oberfläche desinfiziert Quadrat neu, unbenutzt BDM Film, der pre-entwesten war. Die meisten Kunststoffe wie Folien nicht ohne Verlust der Integrität autoklaviert werden, so wurde UV-Licht verwendet werden, um mikrobielle Zellen, die sich auf die Kunststoff töten. ISO 846 19 empfiehlt Oberfläche Entwesung in 70% Ethanol und anschließender Trocknung, aber wenn mit dieser Methode, muss man sicherstellen, dass keine Komponente oder Zusatzstoff des Films negativ wird von der Ethanol betroffen. Seit BDMs vermutlich hergestellt von Sonnenlicht zu widerstehen, wurde UV als Dekontaminationsmethode gewählt.
Isolate, die auf BDM Stück besser als auf Minimalmedium alleine wuchsen, wurden zur weiteren Untersuchung ausgewählt. Agar, ein Polysaccharid durch Meeresalgen produziert, wird verwendet, um mikrobielle Medien verfestigen, da es in der Regel nicht genutzt metabolisch von landwirtschaftlich und medizinisch nichtkönnen Mikroorganismen, jedoch haben Agar-Hydrolyse Enzyme aus marinen Bakterien 27 und Agar-Hydrolyse Bakterien haben auch aus dem Boden 28 isoliert isoliert worden. BDM Polymeren und Agar sowohl erwartet seltenen Substrate für Enzyme, die durch Boden-Pilze, die in Umgebungen, in denen diese Polymere als potentielle Nährstoffquellen enthalten entwickelt haben sezerniert werden, aber beide Substrate sind in der Platte Bioassay hier (Schritt 7). Pilze, die BDMs aber nicht Agar verwenden als Kohlenstoffquelle aus Pilzen, die Agar verwenden nur unterschieden werden, indem das Wachstum auf Agar-verfestigtem Medium, enthaltend i) keinen zusätzlichen Kohlenstoffquelle außer Agar (negative Kontrolle), ii) BDM Filme (experimentell) und iii) Glucose (positive Kontrolle). Wachstum der Isolate auf Minimalmedium mit Glukose erwartet; Pilze nicht entstehende Glucose-enthaltenden Platten möglicherweise nicht in der Lage ist Wachstum auf dem bestimmten Minimal-Medium in dem Experiment verwendet. Potential BDM Abbauern sollte auf Agar verfestigten Minimalmedium + BDM Film besser als sie auf Agar verfestigten Minimalmedium wachsen allein wachsen. Pilze wachsen auf Minimalmedium Platten sind Agar-Abbauern oder oligotrophs und werden voraussichtlich auch auf dem Agar mit BDM Filme in Bioassay Platten verbunden wachsen, aber nicht auf die Filme selbst (es sei denn, sie glücklicherweise auch verschlechtern BDM Polymere).
Um die Möglichkeit zu sehen, das mikrobielle Wachstum durch die Nutzung von Agar und nicht die von BDMs beseitigen, folgten wir unseren ersten Test zum BDM Kolonisation auf Agar-Platten mit einem Biotest in definierten Brühemedium (Schritt 9). BDM Stücke repräsentiert die einzige bekannte Kohlenstoffquelle in dem Bioassay Rohre.
Nach dem ersten Screening und auf die Wiederbelebung Glycerin Aktien der Isolate, einige knappe, aber sichtbare Myzel in flüssigem Medium, das definiert keine bekannte Kohlenstoff-Quelle gebildet. Diese Ergebnisse legen nahe, dass einige der erworbenen Isolate waren oligotrophs - Organismen, die durch Abfangen sehr geringe Mengen an Kohlenstoff, Stickstoff und andere Nährstoffe, entweder in der wässrigen Umgebung oder bestehenden flüchtigen in der Luft gelöst 29,30,31 wachsen. Species Identifizierung über 18S ribosomalen DNA-Analyse unterstützt diese Ansicht, da viele der Isolate abgestimmt Pilzgattungen zuvor berichtet Oligotrophie 32 ausstellen. Oligotrophs, die gewöhnlich sind saprophytes erfordern ein breites Spektrum von metabolischen Funktionen für die Nutzung Substrat in einem Bereich von 30 Umgebungen. So ist es nicht verwunderlich, dass wir die gleichen Pilze isoliert von BDMs (vermutlich erfordern ungewöhnliche enzymatischen Fähigkeiten) nährstoffarmen Kapazitäten demonstriert und konnten sich auf Spurenstoffe wie Hautfett vor Fingerabdrücken, Staub oder flüchtige Spuren in der Luft wachsen. Durch die Isolierung von oligotrophs schlossen wir, dass das Wachstum auf einer BDM Oberfläche allein nicht verwendet werden, um BDM Aufschlüsselung abzuleiten. Die hier beschriebenen Verfahren beziehen sich auf unsere Bemühungen, screen nativen BDM Kolonisatoren aus landwirtschaftlichen Böden für bona fide BDM Zusammenbruch.
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Protocol
Dieses Verfahren erfordert mindestens mehrere Monate für die Inkubation von BDM Filme im Boden, und mehrere Monate für sequentielle Bioassays sowohl auf Agar-Platten und Agar-frei, chemisch definierten Brühe Kolonisation und Abbau zu bewerten. Die einzelnen Methoden werden in der Reihenfolge, wie sie durchgeführt werden aufgelistet.
1. Inkubation von BDM Films im Boden
Integrieren BDM Filme in den Boden unter Bedingungen imitiert diejenigen, unter denen sie erwartet, dass sie abgebaut werden. Erwerben Sie 400 g (Trockengewicht Äquivalent) der gebietsansässigen Boden und Sandwich eine 10 cm x 10 cm BDM mit dem Boden in einem 13 x 13 cm Nylon-Mesh (250 Mikron) Tasche. Schließen Sie mit Nylonfaden. Inkubationszeiten sind bei der Experimentator nach eigenem Ermessen. Überwachen und / oder zu modifizieren relevanten Parameter mikrobielle Aktivität (zB Bodentemperatur, Nährstoffe und Feuchtigkeit) in regelmäßigen Abständen während der Inkubationszeit entsprechend.
2. Vorbereitung der Medienund Reagenzien
Um zu vermeiden, die Einführung Nährquellen versehentlich in Medien und Kultur Röhren verwenden analysenreine Reagenzien, neu gekaufte Kultur Rohre, Typ I Reinstwasser (zB Nanopure) Wasser und stringent gewaschenen Gläser zum Mischen von Medien. Kreuzkontamination von Reagenzien - ist es am besten, einen dedizierten Satz Reagenzien verwenden und zu diesem Zweck Glaswaren. Man beachte, dass es möglich ist, dass Pilze isoliert werden, deren Wachstum von einem Bestandteil in den unten aufgeführten Reagenzien gehemmt werden. Wenn das geschieht, können einige Optimierung erforderlich.
- Vor der Durchführung Medien, waschen alle notwendigen Glaswaren mit einem Labor Waschmittel und dann Acid-Wash (zB über Nacht einweichen in 10% HCl). Spülen mindestens zwölfmal in destilliertem Wasser und zweimal in Reinstwasser. Decken alle Gläser mit sauberem Aluminiumfolie zu Staub auszuschließen. Tragen Sie Handschuhe und berühren Sie nicht die Innenseite und Kanten von Schiffen Hautöle vor Fingerabdrücken auszuschließen. Um keine Seife Resi vermeidenAbgaben und Kratzern in Glas, die Kolonisierung, Kultur Pilze in neu gekauft (unbenutzt), gespült und autoklaviert Glas Kultur Röhren und Kappen erleichtern.
- Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) wird für die anfängliche Isolierung von Pilzen aus dem Boden verwendet wird, und für die Errichtung der einzelnen isolierten Kolonien und die Erzeugung von Inokulum für Langzeitlagerung. Bereiten Sie die Medien nach den Anweisungen des Herstellers und nach dem Autoklavieren (bei 50 ° C gekühlt), Add Chloramphenicol (von 10 mg / ml Stammlösung in EtOH) bis zu einer Endkonzentration von 30 pg / ml, um Bakterien auszuschließen. Dieses Medium wird nun als PDA chl 30 bezeichnet.
- Pilz-Minimalmedium (FMM) als solide Basis für BDMs mit potentiellen Pilz Kunststoff Abbauern geimpft werden. Abgesehen von der Agar (wenn verwendet, um das Medium erstarren) ist es kohlenstofffreie. Um etwa 800 ml entionisiertem H 2 O, fügen Sie 6,0 g NaNO 3, 0,52 g KCl, 0,52 g MgSO 4 · 7H2 O, 1,52 g KH 2 PO 4 und 1 ml Hutner die Spurenelemente Stammlösung (2,2 g ZnSO 4 · 7H 2 O, 1,1 g H 3 BO 3, 0,5 g MnCl 2 · 4H 2 O, 0,5 g FeSO 4 · 7H 2 O, 0,16 g CoCI2 · 5H 2 O, 0,16 g CuSO 4 · 5H 2 O, 0,11 g (NH 4) 6Mo 7 O 24 · 4H 2 O und 5,0 g Na 4 EDTA in 100 ml destilliertem H 2 O 33 , 34. Den pH-Wert auf 6,5 mit NaOH, und bringen Volumen auf 1 L. Für die flüssige Bioassay, Filter-sterilisieren FMM zur Ausfällung von Salzen zu vermeiden. Falls festes Medium gewünscht wird, fügen Sie 16 g Agar und Autoklaven. Beim halbfesten Agar erforderlich, verringern Agar bis 8 g / L. Wenn bis 50 ° C abgekühlt, fügen Chloramphenicol in einer Endkonzentration von 30 pg / ml. Dieses Medium wird nun als FMM chl 30 bezeichnet. Als Kontrolle, um sicherzustellen, dass in Pilzisolate wachsen Dieses Medium sollte FMM ma seinde wie oben, jedoch mit 10 g Glukose pro Liter. Dies wird als Glucose-Minimalmedium 35 (GMM).
- Phosphat-gepufferte Salzlösung 36 (PBS) wird verwendet, um Schmutzpartikel und mikrobiellen Zellen in der ersten Verdünnungsreihe des Bodens ausgesetzt BDMs auszusetzen. Um PBS machen, fügen 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na 2 HPO 4 und 0,24 g KH 2 PO 4 auf 800 ml destilliertem Wasser. Man löst Salze und pH-Wert auf 7,4 mit HCl. Bringen Gesamtvolumen auf 1 L mit Reinstwasser. Füllen sauber Kultur Röhrchen mit 9,5 ml und 4,5 ml PBS pro Röhrchen. Autoklav.
- 30% (v / v) Glycerin wird kryokonservierten Bakterien und Hefe-Zellen, Sporen und Pilzmyzel während der Lagerung auszusetzen bei -80 ° C Machen Sie diese Lösung in Reinstwasser. Autoklav.
- 0,01% (v / v) Triton X-100 wird verwendet, um Schimmelsporen auszusetzen; das Waschmittel wirkt als ungiftig Netzmittel für hydrophobe Sporen. Lösen Sie 100 ul Triton X-100 In 1 L Reinstwasser. Autoklav.
- 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) als Lösungsmittel für Glutaraldehyd während SEM Fixierung verwendet. Mix 68,4 ml 1 M Na 2 HPO 4 und 31,6 ml 1 M NaH 2 PO 4 und bringen Gesamtvolumen auf 1 L mit Reinstwasser 36.
3. Herstellung von Bioassay Materialien: Oberflächendekontamination von BDM Films
- Weil Reste von Verunreinigungen wie Papier und Klebeband auf SCHNEIDARTIKEL Potenzial Kohlenstoffquellen sind, verwenden Sie neu gekaufte oder frisch Schere Rasierklingen, und einen anorganischen Oberfläche zum Schneiden. Tragen Sie Handschuhe, um eine Verunreinigung des BDM Filme mit Hautfett zu vermeiden. Cut BDM Filme in kleine Quadrate (4,25 x 4,25 cm). Diese Größe passt in einen quadratischen Standard 100 x 15 mm Petrischale.
- Verwenden Sie eine keimtötende UV-Lampe (Emissionswellenlänge = 253,7 nm) bis BDM Filme dekontaminieren. Eine solche Lampe ist oft in einem Standard Biosicherheitswerkbank gefunden. Stellen Sie sicher, dass, wenndas UV-Licht in Betrieb ist, gibt es keinen Strom von Außenluft in den Biosicherheitswerkbank, die BDM Filme kontaminieren könnten.
- Wet Oberflächen im Inneren der Haube mit 70% EtOH und lassen Gebläse Lauf für 15 min an der Luft zu spülen. Schließen Sie dann die Schärpe und dekontaminieren Haube Oberfläche mit UV für 2 Stunden.
- Legen Sie die Filme in der BDM dekontaminiert Kapuze, in Reihen. Lassen Sie das UV-Licht auf Filme für 2 Stunden glänzen.
- Verwenden Sie eine saubere, sterilisierte Pinzette, um die BDM Filme drehen. Beginnen Sie an der ersten Reihe und die Arbeit an der hinteren Reihe zu Zeit, dass Hände und Arme direkt über den neu dekontaminiert BDM Flächen sind zu minimieren. Wenn Spiegeln BDMs, legen Sie die neu entwesten Seite nach unten auf eine saubere Fläche UV-Licht ausgesetzt, aber bislang noch nicht in Kontakt mit der nicht-entwesten Seite des Films.
- Nach 2 Stunden der UV-Behandlung auf jeder Seite, nehmen Sie die Filme aus dem BDM Biosicherheitswerkbank mit einer sterilen Pinzette arbeiten wieder von vorne nach hinten zu vermeiden, dass die Hände und Arme über bereits dekontaminiertNAT-Filme. Legen Sie die BDM Filme in sterile, trockene, überdachte Behälter wie Folie abgedeckten Becher. Lagern bei RT in Dunkelheit.
4. Teller Bioassay-Setup
Führen Sie alle Schritte in einer sterilen Transfer Haube unter aseptischen Bedingungen.
- Legen Sie die UV-entwesten BDM Stücke auf der Oberfläche des Agar-Platten. Stellen Sie sich eine Ecke zuerst, und sanft ließ den Rest des Platzes Rolle in Kontakt mit dem Agar. Vermeiden Sie Falten. Einige Filme bilden Falten während der Lagerung, das ist unvermeidlich. Besonders dünne Filme können die Verwendung von zwei Zangen in dem Bemühen, das Stück flach.
- Platz Perlen halbfeste FMM chl 30 Agar oben auf der Kunststoff-Folie, um eine Wasser-und Nährstoff-Quelle für die erste Besiedlung des hydrophoben Kunststoffen bieten. Perlen sind nicht notwendig für wasserdurchlässige Filme. Re-schmelzen der Agar in der Mikrowelle, und verwenden Sie einen Mikropipettierer zu vier 10 ul Tropfen von geschmolzenem Agar auf den Mulch übertragen (eine in jedem corner). Berühren Sie nicht die Spitze der Pipette direkt auf die Mulch, wie es kann Punktion. Nicht mehr als 10 ul pro Tropfen, weil Übergewicht auf dem Mulch kann Kunststoff von der Agaroberfläche ziehen, wenn Platten invertiert werden.
- Lassen Sie die Platten sitzen rechts oben mit Deckel über Nacht vollständig zu verfestigen, und speichern Sie dann versiegelt Ärmel Agar-Seite nach oben bei 4 ° C im Dunkeln. Wenn Sie bereit sind, um die Biotest (Schritt 7) durchzuführen, verwenden i) eine Platte FMM chl 30 (negative Kontrolle), ii) einem Bioassay Platte mit vier 10 ul Tropfen halbfeste FMM chl 30 auf Kunststoff-Folie, und iii) eine Platte GMM (positive Kontrolle). Auf diese Weise repliziert vier je Isolat kann je Platte Medium getestet werden.
5. Flüssige Bioassay-Setup
- Befolgen Sie die Anweisungen für BDM Schneiden in Schritt 3.1. Vor dem Schneiden Kunststofffolien für die Flüssigkeit Bioassay ein Format wählen, in die Kultur Rohr passt.Das Gebiet muss eine einheitliche Masse auf mehrere Arten erreichen Kunststoff wird von der Schichtdicke ab. Wir fanden, dass Stücke entspricht 0,0175 g gut passen in 15 x 150 mm Rohre Kultur.
- Oberflächen-Dekontamination Filme mit UV-Licht, wie in Schritt 3 beschrieben.
- Für jede Wiederholung eines mikrobiellen isolieren, bereiten drei Röhren zur Inokulation: i) 5 ml FMM mit einem BDM Fragment der vorbestimmten Größe (experimentell), ii) 5 ml FMM ohne Kohlenstoffquelle (negative Kontrolle), und iii) 5 ml GMM (positive Kontrolle). Darüber hinaus bereiten replizieren Rohre FMM enthält jedes BDM getestet werden soll, aber nicht impfen sie. Diese Kontrolle Rohre wird zeigen keine mikrobielle Wachstum durch Kontamination.
6. Isolierung von Pilzen
Nach Bodeninkubation und Probenentnahme sind Pilze aus dem Boden, die den BDM Filmen haftet isoliert. Falls gewünscht, können Bakterien simultaneously isoliert mit der gleichen Methode unter Verwendung von Medien geeignet zur Isolierung von Bodenbakterien, wie 1/10x verdünnter CASO Hefe-Agar mit 50 ug / ml Cycloheximid zur Abschreckung Pilzwachstum 37 ergänzt werden. Wenn definiertem Medium für bakterielle Isolierungen in den Schritten 5 und 7 ist erforderlich M9 38 (zuzüglich Cycloheximid) ist eine gute Wahl.
- Vor der Verarbeitung, bereiten PBS und PDA chl 30. Erlauben PDA chl 30 Platten zum Trocknen (unbagged) bei Raumtemperatur für etwa 24 Stunden, um Kondensation auf den Deckeln und dem Agar-Oberfläche zu beseitigen. Pre-label PDA chl 30 Tafeln.
- Ausheben Mesh-Taschen mit BDM Stücke aus Grabstätten in Schritt 1 gewählt. Schiff und lagern bei 4 ° C nicht mehr als 48 Stunden nach der Gewinnung aus dem Boden.
- Mit einer sterilen Spatel und Pinzette vorsichtig entfernen Boden bis Kunststoff ausgesetzt ist, aber nicht abbürsten Boden, die BDM Filmoberfläche Festhalten wird. Cut BDM Film in 1 cm2 Teile bis 0,5 g Material wird für jede der insgesamt vier Wiederholungen gewonnen. Übertragen 0,5 g BDM Film und die angeschlossenen Boden zu 25 ml Kultur Röhrchen 9,5 ml PBS. Wenn der Mulch ist vollständig abgebaut oder ein Boden-Steuerung nur verarbeitet wird, mit 0,5 g Boden der PBS; wenn möglich, wählen Sie Stücke, die noch aus dem restlichen Mulch sind verfärbt.
- Vortex die Kulturröhrchen mit 9,5 ml PBS und 0,5 g Mulch für 30 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit in einem Wasserbad Ultraschallbehandlung für 10 min, und Wirbel wieder für 30 Sekunden beschallt. Das Rühren wird bestimmt auseinander zu brechen Biofilmen, physisch entfernen Zellen oder die Einhaltung Mulch Stücke eingebettet, und erstellen Sie eine homogene Suspension.
- Bereiten Sie sich seriell verdünnen PBS / Bodenlösung auf einzelne Kolonie-bildenden Einheiten von Beschichtungen zu erhalten. Für jede Probe in einem Laminarströmungshaube einer Kultur Rohr mit 4,5 ml sterilem PBS gefüllt. Für jede Probe füllen drei Vertiefungen einer Tief-Well-Platte mit 96 Vertiefungen mit 450 ul PBS gefüllt.
- Die ursprüngliche Kunststoff / Boden-Suspension (0,5 g Mulch plus 9,5 ml PBS-Lösung) stellt eine 5,0 x 10 -2 Verdünnung von mikrobiellen Material Einhaltung der Kunststoff. 0,5 ml Suspension aus diesem ursprünglichen Rohr bis 4,5 ml steriler PBS in einer Kultur Rohr eine 5,0 x 10 -3 Verdünnung erhalten. Vortex für 30 Sekunden bei hoher Geschwindigkeit. In 50 ul bis 450 ul PBS in der 96-Well-Platte. Wiederholen Sie dies für alle Proben / repliziert. Verwenden Sie einen Mehrkanal-Pipette, um Proben en masse zu verdünnen. Mischen Sie jede neue Verdünnung durch Auf-und Abpipettieren zehnmal. Ändern Sie Tipps zwischen Verdünnungen. Die Verdünnungen bis zu 5,0 x 10 -6.
- (Optional) Bakterielle Isolate waren häufiger als Pilzisolate in Proben beschrieben; wenn also gleichzeitig isolieren Bakterien, dann führen serielle Verdünnungen bis zu 5 x 10 -8 in Schritt 6.6 oben.
- Gleichmäßige 100 ul von jedem der 5,0 x 10 -3 durch die 5,0 × 10 -6Verdünnungen auf der Agar-Oberfläche von PDA chl 30 Platten mit einer Flamme sterilisiert gebogene Glasstäbe. Shop Platten für 30 Minuten aufrecht zu lassen Flüssigkeit in einweichen, dann versiegeln Platten mit Parafilm um das Entweichen von Sporen aus unbekannten Isolate vermeiden. Inkubieren invertierten Platten bei 20 ° C in der Dunkelheit für 5 Tage, damit beide schnell und langsam wachsenden Pilze, um Kolonien zu bilden.
7. Initial Selection of Plastic-abbauenden Pilze
Wichtig: Alle Kulturen von diesem Punkt an sollte nur in einem Biosicherheitswerkbank (kein Laminarströmungshaube), um eine Kontamination der Umwelt mit Sporen von unbekannter Identität vermeiden geöffnet werden. Einige Boden Pilze und Bakterien sind potentielle menschliche Krankheitserreger.
- Untersuchen Verdünnung Platten mit gut isolierte Kolonien. Wählen Sie eine Kolonie, die sich nicht berühren, ist eine weitere Kolonie.
- Mit einer einzigen sterilen Zahnstocher, sanft berühren eine Kolonie und dann den Agar von FMM (hergestellt in Schritt 2.3 Schritt 4) und GMM (hergestellt in Schritt 2.3) Platten, in dieser Reihenfolge. Um Agar Perlen Spitze Kunststofffolien impfen, reiben Sie die Zahnstocher sanft auf der Oberfläche des Agar-Punkt und dann Streichen über die Kunststoff-Folie. Wiederholen der Inokulation von der gleichen Quelle Kolonie bis es vier replizieren Streifen auf jeder Platte sind.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.2 bis mehrere Replikate von jedem visuell einzigartige Kolonie sind aus jedem BDM Stichprobe ausgewählt.
- Seal Platten mit Parafilm, invertieren, und Inkubation bei 20 ° C im Dunkeln für 5 Tage.
- Identifizieren Isolate, die auf BDMs besser als sie auf FMM wachsen wachsen. Wenn das Wachstum ist nicht offensichtlich, sehen die Probe unter einem Binokular die Kolonisierung oder deren Fehlen (Abbildung 1) zu überprüfen. Halten Sie den Deckel auf, wenn der Deckel Kondensation mit einem neuen Deckel ersetzen, sondern tun dies in der Biosicherheitswerkbank.
- Sobald potenzielle BDM Abbauern ausgewählt sind, verwenden Sie alsterile Zahnstocher Inokulum aus dem Pilz die Kolonisierung der Kunststoff selbst kratzen und Streifen für die Isolierung von einzelnen Kolonie-bildenden Einheiten auf PDA-chl 30 Tafeln.
- Seal Platten mit Parafilm und Inkubation PDA chl 30 Platten mit Kunststoff-abbauenden Isolate bei 20 ° C geimpft für 5 Tage in der Dunkelheit.
- Nun, dass einzelne isolierte Kolonien gereinigt werden, sicherzustellen, dass sie wirklich in der Lage, um die Kunststoff-Folien getestet besiedeln. Sammeln Inokulum (Sporen, Hefezellen oder Hyphen) aus einer einzelnen Kolonie bildende Einheit mit einem sterilen Zahnstocher. Wiederholen Sie die Schritte 7.2 bis 7.5. Nach 5 Tagen Inkubation bei 20 ° C, prüft die Bioassay Platten für Pilzwachstum. Wenn das Isolat wächst auf einem BDM Folie besser als es auf FMM wächst in sowohl der ersten (7,5) und zweiten (7,8) Versuche, dann speichert das Isolat wie unter Schritt 8 beschrieben.
8. Langfristige Aufbewahrung von Kunststoff Abbauern Insgesamt werden Kunststoff-abbauenden Isolate in der Platte Bioassay (7.5) getestet werden, um einzelne isolierte Kolonie-bildenden Einheiten (7,6), in der Platte wieder Bioassay (7.8) getestet erneut gereinigt, und schließlich, in der Flüssigkeit Bioassay getestet ( 9,1-9,5). Während des Tests sollten Isolate frische Medien übertragen werden jeden Monat und arbeiten stock Platten bei 4 ° C gelagert, sobald genügend Wachstum sichtbar ist. Isolate sollten auch wie Glycerin bei -80 ° C, und / oder als getrocknete Sporen auf sterilem Filterpapier Platten bei 4 ° C gelagert werden Beide Speicher sind nachfolgend beschrieben.
- Für jedes Isolat, wuchs auf einem BDM Folie besser als es auf FMM wuchs in sowohl der ersten (7,5) und zweiten (7,8) Platte Bioassays bereiten zwei PDA chl 30 Platten mit zwei oder drei sterilisiert Filterpapierscheiben, etwa 1 cm im Durchmesser , auf der Oberfläche. Impfen diese beiden Platten ausdas gleiche einzelne Kolonie in Schritt 7.8 oben gewählt. Einen Rasen durch die Verbreitung Inokulum gleichmäßig über den Agar Wachstum zu maximieren. Seal Platten mit Parafilm und Inkubation bei 20 ° C für 5 Tage. Dieser Schritt kann gleichzeitig mit dem Schritt 7.8 für Effizienz eingeleitet werden.
- Der Filter Scheibe auf der Agar-Oberfläche sollte mit Myzel / Sporen abgedeckt werden. Entfernen Sie die Filterscheiben aus der Agar-Oberfläche mit sterilisierten Pinzette, und in einen sterilen Eppendorf-Röhrchen. Der Luft trocknen Filterscheiben über Nacht in der Eppendorf-Röhrchen (mit Kappe) in einem Biosicherheitswerkbank oder anderen trockenen, sterilen Umgebung mit minimaler Luftbewegung, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Dann mit Parafilm und speichern versiegeln bei 4 ° C.
- Verwenden Sie eine sterile Wattestäbchen oder Zahnstocher, um Sporen und Mycel aus dem Rasen Platten ernten. Suspend Sporen und Hyphen in 30% Glycerin in Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff und speichern Flash-einfrieren bei -80 ° C.
9. Strenge Confirmation of Plastic Utilization über Flüssig Bioassay
- Generieren frischen Sporen und / oder Zellen, mit denen flüssigen Kulturen zu impfen: impfen PDA chl 30 Platten mit Sporen von potenziellen Kunststoff abbauenden Isolate. Verschließen Sie die Platten mit Parafilm und inkubieren bei 20 ° C bis Pilzsporen sichtbar sind.
- In einer Biosicherheitswerkbank, Ernte Sporen durch Waschen der Platte mit 0,01% Triton X-100 (5 ml pro 15 x 100 mm Petrischale funktioniert gut) und Waschen der Sporen (oder Hefezellen) von der Oberfläche mit einem sterilen Glasstab abgebogenen . Aspirate Spore (oder Zelle) Suspension und Transfer in einen sterilen Behälter.
- Graf Sporen oder Zellen mit einem Hämazytometer und bestimmen das entsprechende Volumen auf 5 ml Brühe FMM für insgesamt 1 x 10 6 Sporen / Rohr. Das Volumen sollte weniger als 10 ul. Verdünnen von Konzentraten Sporensuspensionen in 0,01% Triton X-100 erforderlich sein.
- In einer sterilen Transfer Kapuze, impfen Kultur Rohre hergestellt in
- Myzelwachstum von Pilzen an Kunststofffolien sichtbar sein innerhalb der ersten Woche nach der Inokulation, insbesondere an den Kanten der Folien. Für planktonic Hefe (wie durch trübe Medien belegt), kann das Wachstum durch optische Dichte bei 600 nm überwacht werden. Da Pilze wahrscheinlich direkt auf das Kunststoff-Folie sind, kann das Wachstum mit dem Auge beurteilt werden, und kann durch Lichtmikroskopie und / oder Rasterelektronenmikroskopie (SEM) bestätigt werden.
- In FMM-Kontrollen nur für winzige weiße Flecken, die zu klein, um eine Veränderung in der optischen Dichte mit spektrophotometrischen Methoden registrieren sind zu suchen. Diese Flecken können mit einer Pasteurpipette abgesaugt werden und beobachtet mit Differential-Interferenz (DIC)-Mikroskopie. Flecks sind oft nicht identifizierbare Präzisionpitate, aber in manchen Fällen können sie Klumpen des ursprünglichen Impfmittel die gekeimt hatte aber nicht wesentlich gewachsen sein.
- Verwenden Sie visuelle und mikroskopische Beobachtungen Kolonisierung der experimentellen Proben und Kontrollen zu vergleichen und zuordnen Bewertungen für das Wachstum auf jeder Probe von BDM Film. Da viele BDMs in Farbe sind dunkel und ermöglichen minimale Beobachtung über Mikroskopie, außer an den Rändern, und Schichtdicke verbietet Beobachtung unter einem Öl-Immersions-Objektiv, ist SEM sinnvoll, schätze ich) das Vorhandensein von mikrobiellen Wachstum, über das Rating-System beschrieben in zB Tabelle 1, und ii) das Ausmaß der BDM Abbau.
10. SEM Probenvorbereitung
- Verwenden Sie saubere, sterile Schere in kleine Stücke des BDM aus Parallelproben geschnitten. Fix BDMs durch Eintauchen in 2,5% Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,2) für 24-48 Stunden.
- Während Fixierung auftritt, dehydrieren reinen 100% Ethanol durch Zugabe von 5-10% volumen 3 Å Molekularsieb (aktiviert in einem Trockenschrank bei 175-260 ° C abgekühlt und in einem Exsikkator), und lassen Sie sie bei Raumtemperatur über Nacht sitzen insgesamt Austrocknung zu gewährleisten.
- Tauchen BDMs in 0,1 M Natrium-Phosphat-Puffer (pH 7,2) für vier Wäschen von je 15 min.
- Tauchen BDMs in Reinstwasser für drei Waschungen von jeweils 5 min.
- Entwässern BDM Proben in einem Ethanol-Serie, Eintauchen für 20 min bei jeder Konzentration: 50%, 70%, 80%, 90%, 95% und 100%. Spülen BDMs zweimal in 100% Ethanol für 20 min pro Spülung.
- Betreff Proben kritischen Punkt Trocknung und Sputterbeschichtung.
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Representative Results
In einer aktuellen Studie 24, repliziert jeweils vier von drei kommerziell erhältlichen BDMs Bezeichnung "biologisch abbaubar", sowie einen experimentellen Film und eine herkömmliche Kunststoff-Kontrolle wurden über Boden als Mulch für Tomaten-Produktion im Frühjahr 2010 gelegt in Mount Vernon, WA, Knoxville, TN, und Lubbock, TX. Im Herbst 2010 wurden BDM Film Quadrate von jeweils verwitterten Mulch in vier replizieren Grundstücke geschnitten und Mutterboden wurde aus direkt unter dem Bereich, wo die Mulch Probe herausgeschnitten entfernt hatte. Jeder verwitterten BDM Quadrat im Boden wurde in einem Nylon-Mesh-Tasche eingeklemmt wie in Schritt 1 beschrieben. Ein Boden-only-Kontrolle wurde ebenfalls enthalten. Taschen wurden unter 7,5 cm des Bodens in den gleichen Plots und Zeilen zuvor durch den Mulch abgedeckt begraben, und am Ort belassen, bis Frühjahr 2011 Bodenbearbeitung, sieben Monate später. Taschen wurden dann aus den Parzellen mit einer Schaufel angehoben, platziert in Ziplock Plastiktüten, und an das Labor auf Eis Packs für Lieferung am nächsten Tag.
<p class = "jove_content"> Hier berichten wir über repräsentative Ergebnisse aus unserer Studie. Ureinwohner Bodenpilzen wurden von jedem BDM an allen drei Standorten isoliert, für einen Gesamtbetrag von 54 Isolaten. Wir beschreiben Isolaten aus zwei der kommerziellen Produkte an einem Standort (Mount Vernon) verwendet. Eines der Produkte wurde ein biologisch abbaubarer Kunststoff genannt BioAgri. Dieser schwarze Folie wird als "Stärke-Basis" bezeichnet (BioAgri, Palm Harbor, FL) und aus Biokunststoff Mater-Bi von Novamont (Terni, Italien). Mater-Bi ist eine Mischung aus "Maisstärke und biologisch abbaubare Polymere erhalten sowohl aus nachwachsenden Rohstoffen und fossilen Rohstoffen" ( http://www.novamont.com/default.asp?id=505 ). Das andere Produkt war nicht aus Plastik, sondern ein braun "Papier-ähnliches Material aus speziell entwickelten Zellulosefasern hergestellt" (WeedGuard Plus SunShine Paper Co, Aurora, CO), ( http://www.weedguardplus.com/faqs.php ). Diese ProKanal wurde ursprünglich als eine Steuer-und Abbau der Zellulose-Komponenten wurde erwartet, enthalten.Mit der Platte Bioassay hierin beschrieben, wurden drei potentielle BDM-abbauenden Isolate aus WeedGuard Plus und drei aus BioAgri erholt. Dreifach - Diese Isolate wurden auf die Flüssigkeit Bioassay (9,7 obigen Schritten 9.1) unterzogen. Obwohl einige Pilzwachstum sichtbar war entlang der Kanten BDMs nach einer Woche in der Flüssigkeit Bioassay wurden die Proben für 68 Tage vor der Ernte und letzte Beobachtung inkubiert. Mit SEM wurden Pilzhyphen auf allen Proben mit Ausnahme XX und YY, wo wir beobachtet stabförmigen Zellen (Tabelle 2). Weil XX und YY in Hefe Formular PDA chl 30 wachsen, wurde diese Beobachtung erwartet.
Für die WeedGuard Plus-Isolate wurde kein Wachstum in den FMM-only Kontrollen beobachtet. Die BDM-Abbau wurde in den Proben beobachtet Kolonisierten durch Isolieren SS. In der ungeimpften controls für die WeedGuard Plus-Mulch (2A), Rest tracheidalen Elemente der pflanzlichen Fasern sind nur nachweisbar als gering Pock-Kennzeichnung in Reihen auf einige der Fasern gesehen. Obwohl Pilzhyphen in allen drei Proben beobachtet wurden geimpft waren tracheidalen Elemente deutlich sichtbar nur in der SS-Proben (2B), was darauf hindeutet, dass die Verdauung von Zellulose-Material die verholzten tracheidalen Elemente offenbart unter. Isolieren SS wurde vorläufig identifiziert mit 18S ribosomalen DNA als sordariomycete innerhalb der Ordnung Sordariales.
Für die BioAgri Isolate wurde keine signifikante Wachstum in den FMM-only Kontrollen beobachtet. Einzelne weiße Flecken sichtbar auf die wirbelnden Kultur Rohre von Isolaten VV und ZZ wurden mittels DIC-Mikroskopie. Für Isolieren VV, war der Fleck eine Spore Masse (nicht gezeigt), vermutlich Rest von der ersten Impfung. Für Isolieren ZZ wurde die Masse von losen Netz von Hyphen etwa 0,2 mm Durchmesser zusammengesetzt, Was darauf hindeutet, dass die ursprüngliche Spore Inokulum hatte gekeimt, aber noch nicht über die Masse in 3A abgebildeten gewachsen.
In den ungeimpften Kontrollen für die BioAgri Mulch (3B), wird eine holprige Textur beobachtet. Die Identität der weiß Features ist unbekannt, aber sie sind abwesend in einem Film Kolonisierten durch Isolieren VV (3C). Sowohl die weißen Partikel und Unebenheiten werden in einem Film Kolonisierten durch Isolieren ZZ (3D) gegangen. Außerdem zeigten diese Probe eine einheitliche Auftreten von Rissen in der Oberfläche BDM. Isolate VV und ZZ wurden vorläufig identifiziert mit 18S ribosomalen DNA als Penicillium sp. (VV) und eine sordariomycete innerhalb des Auftrag Hypocreales (ZZ) verbunden sind.
| Ergebnis | Aussehen des mikrobiellen Wachstums |
| 0 | Kein Wachstum deutlich von Auge oderdurch Mikroskopie |
| 1 | Germinated Sporen aber keine offensichtliche anschließende Wachstum |
| 2 | Wachstum abdecken ≤ 25% der Testfläche oder Medium |
| 3 | Wachstum abdecken ≤ 50% der Testfläche oder Medium |
| 4 | Wachstum abdecken ≤ 75% der Test-Oberfläche oder Medium |
| 5 | Wachstum Abdeckung> 75% der Test-Oberfläche oder Medium |
Tabelle 1. Scoring-System für die Bewertung mikrobielles Wachstum auf Proben von Kunststofffolien.
| Isolieren | BDM | FMM-only-Kontrolle (score) | FMM enthält 0,0175 g BDM (Partitur und / oder Comments) | ||
| Visuelle Beurteilung | Lichtmikroskopie | SEM | |||
| SS | WG | 0 | Hyphen und BDM Fasern unterscheiden | Hyphen und BDM Fasern unterscheiden | 2; Pilzhyphen sichtbar |
| TT | WG | 0 | Hyphen und BDM Fasern unterscheiden | Hyphen und BDM Fasern unterscheiden | 2; Pilzhyphen sichtbar |
| XX | WG | 0 | Bouillon bewölkt | Nur wenige Zellen in Brühe beobachtet | 2; Rod-förmigen Zellen auf der Oberfläche |
| VV | BA | 1 | Feine Myzel sichtbar am Rand | 4; Produktive Hyphen und Konidiophoren | |
| YY | BA | 0 | Bouillon bewölkt | Nur wenige Zellen in Brühe beobachtet | 2; Rod-förmigen Zellen auf der Oberfläche |
| ZZ | BA | 1 | Luxuriöse Myzelwachstum auf gesamten Oberfläche | Hyphen sichtbar am Rand | 5; Produktive Hyphen |
Tabelle 2. Beobachtungen und Bewertungen für Wachstum Pilzisolate erhalten von verwitterten BDM Filme in Parzellen von Herbst 2010 bis Frühjahr 2011 begraben (7 Monate) am Mount Vernon, später auf unverwitterte BDM Material inokuliert und für 68 Tage bei 20 ° C in der Dunkelheit . WG = WeedGuard Plus-, BA = BioAgri. Siehe Tabelle 1 für Wachstum Bewertungsschema.
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Abbildung 1. Colonization von BioAgri Mulch in der Platte Bioassay in Schritt 7 beschrieben, wie unter einem Binokular bei 20-facher Vergrößerung betrachtet.
Abbildung 2. Aussehen WeedGuard Plus-Mulch nach 68 Tagen in FMM aber nicht geimpft (A), oder geimpft mit isolieren ZZ, vorläufig als Chaetomium sp. (B). Beachten Sie die tracheidalen Elementen (Pfeile), die kaum zu unterscheiden sind in A, aber deutlich in B gesehen. Kein Wachstum sichtbar war in der FMM-only-Steuerung für die Chaetomium isolieren. Die Proben wurden mit Au / Pd beschichtet mit einem Quorum SC7640 Sputter Coater und abgebildet bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV auf einem Tescan VEGA 5136 MM SEM.
Abbildung 3. Erscheinung BioAgri Mulch nach 68 Tagen in der Flüssigkeit Biotest. Eine einzelne Büschel der gekeimten Sporen wurde in der FMM-only-Steuerung für die ZZ isolieren, vorläufig als Sordariomycete (A) identifiziert beobachtet. BioAgri Mulch in ungeimpften FMM inkubiert (B), mit Mulch BioAgri isolieren VV geimpft, vorläufig als Penicillium sp. (C) identifiziert und mit Mulch BioAgri isolieren ZZ (D) inkubiert. Die Proben wurden mit Au / Pd beschichtet mit einem Quorum SC7640 Sputter Coater und abgebildet bei einer Beschleunigungsspannung von 15 kV auf einem Tescan VEGA 5136 MM SEM.
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Discussion
Die hier beschriebene Verfahrensweise stellt einen First-Pass-Technik zur Isolierung von potenziellen BDM Abbauern aus dem Boden und wurde erfolgreich eingesetzt, um Pilze aus BDMs im Boden für sieben Monate begraben isolieren. Fungi wuchs, als auf frische BDM Material des gleichen Typs überimpft, das anzeigt, dass die isolierten Pilzen Tat waren Kolonisatoren, und daß die Filme waren nicht hemmend für Pilzwachstum. Isolation von Kunststoff-abbauende Pilze und Bakterien könnten potenziell ihre Verwendung führen, einzeln oder in Kombination, für Änderungen an Boden oder Kompost, wo Kunststoffe müssen abgebaut werden.
In ihrer Heimat Bodenumgebung, haben mikrobielle Spezies nicht isoliert existieren. Plastic Abbauern und sogar Organismen wachsen auf nährstoffarmen BDMs, aber mit anderen Kohlenstoff-und Energiequellen, könnte keystone Spezies in der Besiedlung dieser widerspenstigen Nahrungsquellen. In dem Bemühen, BDM Abbau in vitro zu bewerten, sondern besser zu imitieren ein echter Boden microbial Gemeinschaft, die hier beschriebenen Methodik konnte für die Prüfung von Mischungen verändert werden, sondern als reine Isolate von pilzlichen und bakteriellen Inocula.
Zu beachten ist, isoliert TT, XX, VV und YY erreicht minimale Verschlechterung der BDMs, aber jeder zeigte sichtbar BDM Kolonisierung sowohl Platte und Flüssigkeit Bioassays. So habe sichtbar Kolonisation nicht unbedingt bedeuten BDM Polymerabbaus. Trennt TT, XX, VV und YY sind wahrscheinlich oligotrophs vertreten, dass erhalten Nährstoffe aus der Umgebung sowie aus dem BDM 29,30,31.
Endgültigen Beweis, dass Pilze mit einem bestimmten BDM als Kohlenstoffquelle erfordert die Messung des Abbaus mittels chemischer Methoden. Evolution Kohlendioxid während der Inkubation von Kunststoffen mit microogranisms zeigt Atmung, und kann als ein indirektes Maß für Polymerabbau 15,16,39 verwendet werden. Verschiedene Methoden werden verwendet, um Informationen über die Größe und Struktur von Polymeren, inkl. gewinnenuding Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Größenausschlusschromatographie, Differentialscanningkalorimetrie, thermogravimetrischer Analyse, kernmagnetische Resonanzspektroskopie Röntgenbeugung und Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie. Studien zur CO 2-Entwicklung und Polymer Aufschlüsselung beurteilen würde eine logische Weiterentwicklung aus dem Screening-Verfahren beschrieben. Jedoch können chemische Methoden zur Messung Polymergrößen nicht unterscheiden enzymatischen Abbau durch Hydrolyse von organischen Säuren während des Wachstums von Pilzen und Bakterien sezerniert. Implikation eines enzymatischen Mechanismus in Kunststoff Zusammenbruch würde die Isolierung eines reinen Enzym (e), der zum Abbau Polymere in vitro.
Die hier beschriebenen Verfahren sollte breit anwendbar für jeden Kunststoff, der in einem Film Konformation, wie Verpackungsmaterial für Lebensmittel oder Müllsäcke verwendet wird. Diese Verfahren haben mehrere Vorteile. Zunächst werden die Kunststoff-Folien in der bioA verwendetssay sind in ihrer handelsüblichen Form, wie zum Kauf auf dem Markt und eventuellen Abbau in der Umwelt. Ein Nachteil ist, dass Kunststoffe verwendet, wie die BDMs nach 2010 Vegetationsperiode in dieser Studie geerntet, kann mehr als verwitterte neue Kunststoff-Folien in der in vitro Bioassays verwendet. Vor mikrobiellen Befall, UV-, Wind-, Abrieb von Boden Partikel, chemische Hydrolyse über anorganische Komponenten Boden, und Bodenfauna alle gegen Oxidation und Fragmentierung von Polymeren beitragen, Änderung der Effizienz der enzymatischen Wirkung auf BDM 11 Filme. Ein zweiter Vorteil besteht darin, dass dieses Verfahren verwendet werden kann, ob die einzelnen Bestandteile der proprietären Kunststoffprodukte bekannt sind und / oder in reiner Form für die Prüfung. Allerdings ist eine Einschränkung der Verwendung von Kunststoffen mit mehreren oder unbekannte Bestandteile, die sichtbare Verschlechterung nicht eindeutig einem einzelnen Bestandteil zugeordnet werden. Zum Beispiel kann der Abbau in 3D darstellen Stärke breakdown ohne Abbau der mehr widerspenstigen Polymere in der "Stärke-Basis" BioAgri Film. In einer früheren Studie auf in-Boden-Abbau von Stärke-Fassung Kunststofffolien, Kohlendioxid Evolution Preise spiegelten die Mengen an Stärke und Farbstoff hinzugefügt, um Filme, während unverändert Polymermolekulargewichte unterstützt die Hypothese, dass Zusatzstoffe nicht Polymere, würden von Mikroorganismen genutzt 39. Schließlich wird dieses Verfahren auf in vitro Abbau fokussiert, wodurch eine weitere definierte System als die derzeit in Standard-Einsatz 15,16. Es wird erwartet, dass die Proben erniedrigender in chemisch definiertem Medium erweisen wird leichter zu beurteilen, über chemische Verfahren als erniedrigender Proben im Boden oder Kompost. Solche Einschätzungen sind der aktuelle Fokus dieser Arbeit.
Dieses Verfahren war erfolgreich für die Isolierung von BDM-abbauende Pilze und Bakterien aus vier Arten von BDM Filme an drei Standorten in den Vereinigten Staaten (TN, WA, und TX), mit unterschiedlichen wirather, Bodentypen und mikrobiellen Gemeinschaft Strukturen. Dieser Vorgang dauert eine reduktionistische Sicht, die sich auf einzelne Isolate mit einer Kapazität für Wachstum auf, und Aufteilung der BDMs. Allerdings zeigen die Ergebnisse die Bedeutung der mikrobiellen Gemeinschaft Analyse betonen, um die getrennten und verknüpfte Rollen von nährstoffarmen Kolonisatoren, bona fide BDM depolymerizers und anderen Community-Mitgliedern zu beschreiben, werden alle von denen erwartet werden in dem Ziel der vollständigen Abbau von Kunststofffolien wichtig Biomasse, Kohlendioxid und / oder Methan und Wasser.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Dr. Stephen Alderman, Dr. David Blatt, und Erin Macri sind dankbar für die Hilfe bei der Mikroskopie anerkannt. Diese Forschung wurde durch einen Zuschuss aus dem NIFA Specialty Crops Research Initiative, USDA-SCRI SREP Bewilligung von Fördermitteln Nr. 2009-02484 finanziert. Briana Kinash, Kevin Kinloch, Megan Leonhard Joseph McCollum, Maria McSharry und Nicole Sallee lieferte hervorragende technische Unterstützung und nachdenklich Diskussionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potato Dextrose Agar | Becton Dickinson | 8X05491 | |
| Agar | Fisher | BP 1423-2 | |
| Chloramphenicol | Acros Organics | 200-287-4 | |
| Glutaraldehyde | Electon Microscopy Sciences | 16216-10 | Toxic |
| Molecular sieve | Fisher | M-8892 | |
| Ethanol | Pharmco-Aaper | E200 | |
| Contrex | Decon Labs, Inc. | 5204 | |
| Parafilm M | Pechiney Plastic Packaging | S37440 | |
| Mineral salts for buffers and media | Fisher | Various | Various vendors sell these reagents |
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