Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

عزل الكائنات الدقيقة في التربة الأصلية مع المحتملة لتحطيم القابلة للتحلل أفلام الجرثومة البلاستيكية المستخدمة في الزراعة

Published: May 10, 2013 doi: 10.3791/50373
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 2, 2, 1
1Biology Department, Western Washington University, 2Washington State University Northwestern Research and Extension Center, 3Department of Plant and Soil Science, Texas Tech University

Summary

الأفلام البلاستيكية المسمى "تحلل" متوفرة تجاريا للاستخدام الزراعي والجراثيم. الحرث يمثل طريقة التخلص جذابة، ولكن تدهور في الظروف الميدانية غير مفهومة. وكان الغرض من هذه الدراسة إلى تطوير أساليب لعزل الفطريات التربة الأصلية والبكتيريا التي تستعمر الأفلام نشارة البلاستيك بعد الدفن المجال.

Abstract

الفطريات الأصلي إلى التربة الزراعية التي استعمرت المهاد (BDM) الأفلام القابلة للتحلل متاحة تجاريا تم عزل وتقييمها لإمكانية التحلل والبلاستيك. عادة، عندما يكون معروفا تركيبات من مواد بلاستيكية ومصدرا من المواد الأولية المتاحة، البلاستيك مسحوق يمكن تعليقها في وسائل الاعلام القائمة على أجار وتدهور يحددها التصور مناطق المقاصة. ومع ذلك، فإن هذا النهج يحاكي سيئة تدهور الوضع الطبيعي من BDMs في. أولا، لا تفرق BDMs كما الجسيمات الصغيرة في جميع أنحاء مصفوفة التربة. ثانيا، لا تباع BDMs تجاريا باسم البوليمرات نقية، ولكن بدلا عن الأفلام التي تحتوي على مواد مضافة (مثل الحشو، والمواد البلاستيكية والأصباغ) التي قد تؤثر على نمو الجراثيم. واستخدمت الإجراءات الوارد ذكرها هنا للالعزلات تم الحصول عليها من الأفلام المهاد دفن التربة. تم اختبار العزلات الفطرية المكتسبة من BDMs حفرها بشكل فردي للنمو على قطعة من جديد، BDMs تطهيرها وضعت فوق المتوسطة المحددة التي لا تحتوي على الكربون مصدر هxcept أجار. تم اختبار العزلات التي نمت على BDMs أخرى في وسط سائل حيث كانت BDMs الوحيد مصدر الكربون المضافة. بعد ما يقرب من عشرة أسابيع، تم تقييم الاستعمار الفطرية وتدهور BDM بواسطة المجهر الإلكتروني. وقد تم تحديد العزلات عبر تحليل الحمض النووي الريبي الريباسي تسلسل الجين. يصف هذا التقرير الأساليب لعزل الفطرية، ولكن تم عزل البكتيريا أيضا استخدام هذه الأساليب عن طريق استبدال وسائل الإعلام المناسبة للبكتيريا. منهجيتنا يجب أن تكون مفيدة للدراسات التحقيق في انهيار الأفلام البلاستيكية سليمة أو المنتجات التي المواد الأولية البلاستيكية هي إما غير معروفة أو غير متوفرة. ومع ذلك نهجنا لا يوفر طريقة الكمي لمقارنة معدلات تدهور BDM.

Introduction

وقد اعتبر تدهور تاريخيا سمة غير مرغوب فيه من البوليمرات البلاستيكية، بسبب انهيار تقصير فترة حياة المنتج والمتانة. في الآونة الأخيرة، جعلت الوعي بالمشاكل البيئية التي عرضتها النفايات البلاستيكية في البيئة الطبيعية 1،2،3 البلاستيك القابلة للتحلل بديلا جذابا لمواد البلاستيكية التقليدية. تدهور (كما هو موضح التغييرات الهيكلية، والتجزؤ، وانخفاض في الوزن الجزيئي، والنزاهة، وقوة 4،5) تحدث عبر سلسلة من الأحداث، بما في ذلك العمليات غير الحيوية (الضغط الحراري، صور للأكسدة، والتحلل والتآكل والضغط الميكانيكي)، والتحلل البيولوجي 6. بينما العمليات غير الحيوية يمكن تغيير حجم جزء وخصائص البلاستيك، يطلب من الكائنات الحية الدقيقة للتمعدن في نهاية المطاف إلى الماء وثاني أكسيد الكربون (في الظروف الهوائية) و / أو الميثان (تحت الظروف اللاهوائية).

A مكانة كبيرة لل البلاستيك القابلة للتحلل موجود في الزراعة، حيث تستخدم الجراثيم من البلاستيك لمنع نمو الأعشاب الضارة، والإبقاء على رطوبة التربة وزيادة درجات حرارة التربة 7،8. وتغطي مئات الآلاف من الأفدنة في الولايات المتحدة وحدها مع الجراثيم البلاستيك 9، بما في ذلك الجراثيم تتكون من البلاستيك القابلة للتحلل. بعد موسم نمو المحاصيل، وخيارات للتخلص من الجراثيم القابلة للتحلل (BDMs) تشمل التخلص منها في موقع لطمر النفايات، الحرق لاستعادة الطاقة 10، والتدهور عن طريق التسميد، أو تدهور في التربة بعد الحراثة 11. من هذه، أقل مصير كثيفة العمالة والحرث BDMs في التربة، ولكن دون تدهور كفاءة وتمعدن خلال أشهر غير المحاصيل (عموما في فصل الشتاء)، يمكن أن تبقى شظايا البلاستيك وتتداخل مع معدات الزراعية خلال فصل الربيع الحرث والزرع، و لا تزال قائمة في البيئة حيث أنها تؤثر بشكل كبير على الحياة البرية، والحياة النباتية، ومجهريات البقعة 1،2،3،10.

SS = "jove_content"> على الرغم من أن العديد من المنتجات البلاستيكية، بما في ذلك الأفلام المهاد الزراعية، تحمل تسمية "تحلل" أو "سماد"، في الممارسة العملية، قد تدهور وتمعدن تكون فعالة جدا و / أو ناقصة جدا بالنسبة التحلل في التربة لتكون بديلا عمليا للتخلص من هذه المنتجات. على سبيل المثال، حققت بولي اثيلين أوكسو القابلة للتحلل فقط 12.4٪ تمعدن بعد سنة واحدة من التجوية وثلاثة أشهر لاحقة في 58 ° C قعت السماد، وأقل من نصف هذا المبلغ من تمعدن عندما كانت درجة الحرارة 25 ° C السماد 12. في فصل الشتاء، ودرجات حرارة التربة في معظم المواقع تكون أقل من أي من هذه الحرارة، ويفترض أن يؤدي إلى أقل من ذلك النشاط الميكروبي وبالتالي، أقل تمعدن. بالإضافة إلى إبطاء معدلات التدهور، وقد أدى سوء استخدام مصطلح "قابلة للتحلل" إلى عدم الثقة في هذه المنتجات من قبل المستهلكين 13،14، بما في ذلك تلك الموجودة في الصناعة الزراعية. التحلل البيولوجي هو التحويلمن البوليمرات لثاني أكسيد الكربون (و / أو الميثان) والماء 14 بواسطة طبيعيا الكائنات الحية الدقيقة 4. ولذلك، يجب أن تقاس تحلل كيميائيا، وجمعية المادية من الكائنات الحية الدقيقة مع ركيزة لا يعني التحلل الميكروبي تلك المواد.

كجزء من جهد يرمي إلى دراسة الاستعمال المستدام للBDMs في الزراعة، ركزت هذه الدراسة على اكتشاف الكائنات الدقيقة الأصلي إلى التربة الزراعية التي تستعمر وتتحلل BDMs المتاحة تجاريا. وقد نشرت طرق الاختبار القياسية لقياس كيميائيا انهيار البلاستيك القابلة للتحلل عن طريق غير الحيوية والبيولوجية 15،16،17. ومع ذلك، وهذه الأساليب لا تعالج تدهور البلاستيك حسب الأنواع الميكروبية الفردية، أو توفير وسائل لعزلتهم. منهجية يشبه هنا بصورة أوثق الطرق القياسية المصممة لتقييم البلاستيك لمقاومة انهيار الميكروبية بعد بتلقيح العينات مع الجراثيم الفطرية18،19.

عندما تعرف تركيبات من مواد بلاستيكية ومصدر المادة الخام متوفرا، البلاستيك مسحوق يمكن تعليقها في وسائل الاعلام القائمة على أجار وتدهور يحددها التصور مناطق المقاصة 13. وقد استخدمت هذه الطريقة سابقا لتحديد الكائنات الدقيقة التي تحط من البوليمرات مثل البولي يوريثان 20، بولي (بوتيلين سوسينات-CO-أديبات) 21، وبولي (حمض اللبنيك) 22. ينطوي على طريقة مماثلة تعليق البلاستيك مسحوق نقي في وسط سائل حيث البلاستيك هو مصدر وحيد للكربون 20،23. في حين أن هذه الأساليب لديها ميزة نظام محدد، فإنها تحاكي سيئة تدهور الوضع الطبيعي من BDMs في. أولا، يتم توزيع مساحة السطح بشكل مختلف لأن BDMs لا تفرق في الجسيمات الصغيرة في جميع أنحاء مصفوفة التربة، ولكن بدلا من ذلك، بيعها واستخدامها كأداة الأفلام. الثانية، والتركيب الكيميائي لBDMs يختلف عن البوليمرات نقية. BDMs تحتوي عموما المضافة مثلالحشو، والمواد البلاستيكية، وتلوينات، وهذه الإضافات قد تؤثر على نمو الميكروبات، وبالتالي، فإن معدل تمعدن. لهذا السبب، ولأن تكوين بعض الأفلام التجارية في هذه الدراسة كانت الملكية، فيلم من البلاستيك في شكله حقل جاهزة استخدمت لعزل الفطريات والبكتيريا. للبساطة، يتم وصف الأساليب أدناه فقط للفطريات، مع تعديلات لاحظت عند الاقتضاء عن العزلة البكتيرية.

في دراسة أجريت مؤخرا 24، واستخدمت ثلاث BDMs المتاحة تجاريا وفيلم واحد التجريبية في المواقع الزراعية في ثلاث مناطق مختلفة من الولايات المتحدة لموسم زراعي واحد، وضعت في وقت لاحق في شبكة (250 ميكرون) أكياس ودفنها لفصل الشتاء واحد في التربة في نفس المواقع. 250 فتحات شبكة ميكرون تسمح خيوط فطرية لاختراق مع استبعاد الجذور ومعظم الحيوانات التربة، وتقليل زحف التربة 25،26. مواد النايلون منع تدهور التربة في كيس. بعد الحفر، وتم انتشال العزلات ungal من قطعة BDM وتقييمها للنمو على الحد الأدنى من المتوسط ​​بدون مصدر الكربون عدا آغار و 5 سم × 5 سم مربع سطح تطهيرها من جديد، فيلم BDM غير المستخدمة التي كان قبل تطهيرها. لا يمكن تعقيمها معظم المواد البلاستيكية المستخدمة عن الأفلام دون فقدان النزاهة، كان يستخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية لذلك لقتل أي خلايا الجرثومية الموجودة على البلاستيك. ISO 846 19 توصي سطح disinfesting في الايثانول 70٪ والتجفيف لاحقة، ولكن في حالة استخدام هذه الطريقة، يجب على المرء أن ضمان عدم وجود عنصر أو المضافة من الفيلم يتأثر سلبا من الإيثانول. منذ BDMs يتم تصنيع يفترض على تحمل أشعة الشمس، الأشعة فوق البنفسجية تم اختياره كوسيلة من وسائل التطهير.

وقد تم اختيار العزلات التي نمت على BDM قطعة أفضل من التركيز على الحد الأدنى من المتوسط ​​وحده لمزيد من الدراسة. يستخدم أجار، السكاريد التي تنتجها الطحالب البحرية، لترسيخ وسائل الإعلام الميكروبية لأنها لم تستخدم عادة من قبل أيضي زراعيا وليس طبياالكائنات الدقيقة قادرة، ولكن تم عزلها أجار تحليل الماء الأنزيمات من البكتيريا البحرية 27 و أجار تحليل الماء البكتيريا أيضا تم عزلها من التربة 28. البوليمرات BDM وأجار كلاهما يتوقع أن تكون ركائز نادرة للإنزيمات تفرزها فطريات التربة، والتي لم تتطور في البيئات التي تحتوي على هذه البوليمرات كمصادر المغذيات المحتملة، ولكن كلا ركائز موجودة في لوحة الأحيائي الموصوفة هنا (الخطوة 7). الفطريات التي تستخدم BDMs ولكن ليس أجار كمصدر الكربون يمكن أن تكون متباينة من الفطريات التي تستخدم أجار فقط، وذلك بمقارنة نمو على أجار طدت المتوسطة التي تحتوي على ط) مصدر الكربون إضافة أي باستثناء أجار (مراقبة سلبية)، والثاني) BDM أفلام (تجريبية) والثالث) الجلوكوز (مراقبة إيجابية). ومن المتوقع نمو جميع العزلات على الحد الأدنى من المتوسط ​​بالإضافة إلى الجلوكوز؛ الفطريات لا الناتجة عن الجلوكوز التي تحتوي على لوحات قد لا تكون قادرة على النمو على الحد الأدنى من المتوسط ​​خاصة استخدمت في التجربة. Potentiشركة بي دي إم degraders يجب أن ينمو على أجار طدت الحد الأدنى من المتوسط ​​+ فيلم BDM أفضل مما كانت تنمو على أجار طدت الحد الأدنى من المتوسط ​​وحدها. الفطريات التي تنمو على لوحات متوسطة الحد الأدنى هي أجار degraders أو oligotrophs، ومن المتوقع أيضا أن ينمو على أجار المرتبطة الأفلام BDM في لوحات الأحيائي، ولكن ليس على الأفلام أنفسهم (ما لم تكن مصادفة أيضا تتحلل البوليمرات BDM).

للقضاء على إمكانية رؤية نمو الجراثيم بسبب استخدام أجار وليس من BDMs، تابعنا الفحص الأولي من أجل الاستعمار BDM على لوحات أجار مع الأحيائي في تعريف المتوسطة مرق (الخطوة 9). قطعة BDM يمثل مصدر الكربون الوحيد المعروف في أنابيب الاختبار الأحيائي.

بعد الفحص الأولي، وعلى إحياء مخزونات الجلسرين من العزلات، شكلت بعض فطر شحيحة ولكن مرئية في المتوسط ​​تعريف السائل التي لا تحتوي على مصدر الكربون المعروفة. واقترحت هذه النتائج أن بعض العزلات المكتسبة كانت oligotrophs - الكائنات الحية التي تنمو عن طريق الكسح كميات صغيرة جدا من الكربون، والنيتروجين، والمواد المغذية الأخرى الذائبة سواء في البيئة المائية أو القائمة كما المتطايرة في الهواء 29،30،31. تحديد الأنواع عن طريق تحليل الحمض النووي 18S الريباسي يؤيد هذا الرأي، حيث أن العديد من العزلات يقابل أجناس الفطرية ذكرت سابقا أن تظهر قلة التغذية 32. Oligotrophs، والتي هي عادة الفطور الرمامة، تتطلب مجموعة واسعة من القدرات الأيضية لاستخدام الركيزة في طائفة من البيئات 30. وبالتالي، فإنه ليس من المستغرب أن نفس الفطريات المعزولة من نحن BDMs (ويفترض تتطلب قدرات غير عادية الأنزيمية) أظهرت قدرات قليل التغذية، وكانت قادرة على النمو على ملوثات نزرة مثل زيوت الجلد من بصمات الأصابع والغبار والمواد المتطايرة أو التتبع في الهواء. ونظرا لعزلة oligotrophs، خلصنا إلى أن النمو على سطح BDM وحدها لا يمكن أن تستخدم للاستدلال BDM انهيار. وصف أساليب تعكس هذه الوثيقة جهودنا لالشوريreen المستعمرين BDM الأم من التربة الزراعية لانهيار النية الحسنة BDM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتطلب هذا الإجراء على الأقل عدة أشهر للحضانة من الأفلام BDM في التربة، وعدة أشهر أخرى لاختبارات بيولوجية متتابعة على حد سواء على لوحات أجار وخالية من أجار، مرق محددة الصفات كيميائيا لتقييم الاستعمار وتدهورها. وترد وسائل الفردية في الترتيب الذي سوف يتم تنفيذها.

1. حضانة أفلام BDM في التربة

دمج الأفلام BDM في التربة تحت ظروف تحاكي تلك التي بموجبها سوف يكون من المتوقع أن تتحلل. الحصول على 400 غرام (أي ما يعادل وزن جاف) من التربة المقيمين وشطيرة 10 سم × 10 سم BDM مع التربة داخل 13 × 13 سم شبكة من النايلون (250 ميكرون) كيس. وثيق مع خيط النايلون. مرات الحضانة هي وفقا لتقدير المجرب. رصد و / أو تعديل المعلمات ذات الصلة إلى النشاط الميكروبي (مثل التربة درجة الحرارة، والمواد الغذائية والرطوبة) على فترات منتظمة طوال فترة الحضانة حسب الاقتضاء.

2. إعداد وسائل الإعلاموالكواشف

لتجنب إدخال مصادر المغذيات عن غير قصد في وسائل الإعلام وأنابيب والثقافة، واستخدام المواد الكيميائية المتفاعلة الصف، وأنابيب ثقافة المشتراة حديثا، النوع الأول عالى النقاء (مثل NanoPure) المياه، والأواني الزجاجية صارم يتم غسلها للوسائل الإعلام الاختلاط. تجنب انتقال التلوث من الكواشف - فمن الأفضل لاستخدام مجموعة مخصصة من الكواشف والزجاجية لهذا الغرض. لاحظ أنه من الممكن أن الفطريات قد تكون معزولة الذين تحول دون عنصر في الكواشف المذكورة أدناه النمو. في حالة حدوث ذلك، قد تكون هناك حاجة بعض التحسين.

  1. قبل اتخاذ وسائل الإعلام، وغسل جميع الأواني الزجاجية اللازمة مع المنظفات المختبر ومن ثم حمض غسل (على سبيل المثال نقع بين عشية وضحاها في 10٪ HCL). شطف لا يقل عن اثني عشر مرات في الماء المقطر، ومرتين في الماء عالى النقاء. تغطية جميع الأواني الزجاجية مع رقائق الألومنيوم نظيفة لاستبعاد الغبار. ارتداء قفازات وتجنب لمس داخل وحواف السفن لاستبعاد زيوت الجلد من بصمات الأصابع. لتجنب أي الصابون ريسيمستحقات والخدوش في الزجاج والتي تسهل الاستعمار والفطريات الثقافة في شراؤها حديثا (غير مستخدمة)، تشطف وتعقيمها زجاج أنابيب ثقافة وقبعات.
  2. البطاطا الدكستروز أجار يستخدم (PDA) لعزل الأولي من الفطريات من التربة، وإنشاء مستعمرات معزولة واحد وجيل من اللقاح للتخزين على المدى الطويل. إعداد وسائل الإعلام وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وبعد التعقيم (عندما تبرد إلى 50 درجة مئوية)، إضافة الكلورامفينيكول (من 10 ملغ / مل محلول المخزون في ETOH) إلى التركيز النهائي من 30 ميكروغرام / مل، لاستبعاد البكتيريا. ويشار إلى هذه الوسيلة الآن باسم PDA داا 30.
  3. ويستخدم الحد الأدنى من المتوسط ​​الفطرية (FMM) كقاعدة صلبة لBDMs تلقيح مع degraders البلاستيك الفطرية المحتملة. وبصرف النظر عن أجار (عندما تستخدم ليصلب متوسطة)، فمن خالية من الكربون. إلى ما يقرب من 800 مل من منزوع الأيونات H 2 O، إضافة 6.0 ز نانو 3، 0.52 ز بوكل، 0.52 G MgSO 4 · 7H2 O، 1.52 غ KH 2 PO 4، و 1 العناصر النزرة محلول المخزون مل Hutner لل(2.2 غرام ZnSO 4 · 7H 2 O، 1.1 G H 3 BO 3، 0.5 غرام MnCl 2 · 4H 2 O، 0.5 غرام FESO 4 · 7H 2 O، 0.16 G كوكلي 2 · 5H 2 O، 0.16 غ كبريتات النحاس 4 · 5H 2 O، 0.11 G (NH 4) 6Mo 7 O 24 · 4H 2 O، و 5.0 ز نا 4 EDTA في 100 مل المقطر H 2 O 33 ، 34. ​​ضبط درجة الحموضة إلى 6.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم، ويصل حجم إلى 1 L. بالنسبة للالأحيائي السائل، فلتر تعقيم FMM لتجنب ترسيب الأملاح. إذا كان المطلوب متوسطة الصلبة، إضافة 16 غرام آغار والأوتوكلاف. عندما أجار شبه الصلبة هي مطلوب، والحد من آغار إلى 8 ز / L. عندما يبرد إلى 50 ° C، إضافة الكلورامفينيكول إلى تركيز النهائي من 30 ميكروغرام / مل. ويشار إلى هذا المتوسط ​​الآن وكما FMM داا 30. كعنصر تحكم لضمان أن العزلات الفطرية تنمو في هذه الوسيلة، وينبغي أن يكون FMM أماهدي أعلاه، ولكنها تحتوي على 10 غرام من السكر لكل لتر. وهذا ما يسمى الجلوكوز الحد الأدنى من المتوسط ​​35 (GMM).
  4. الفوسفات مخزنة المالحة 36 (PBS) ويستخدم لتعليق جزيئات التربة والخلايا الميكروبية في التخفيف المتسلسل الأولي من BDMs المعرضة للتربة. لجعل برنامج تلفزيوني، إضافة 8 غرام كلوريد الصوديوم، 0.2 غرام بوكل، 1.44 ز نا 2 هبو 4، و 0.24 غرام KH 2 PO 4-800 مل من الماء المقطر. تذوب الأملاح وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع حمض الهيدروكلوريك. جلب إجمالي حجم إلى 1 L مع الماء عالى النقاء. ملء أنابيب ثقافة نظيفة مع 9.5 مل و 4.5 مل PBS في أنبوب. الأوتوكلاف.
  5. ويستخدم 30٪ (V / V) الجلسرين إلى تعليق الخلايا البكتيرية والخميرة cryopreserved، جراثيم، وأفطورة الفطرية أثناء التخزين في -80 درجة مئوية. جعل هذا الحل في الماء عالى النقاء. الأوتوكلاف.
  6. 0.01٪ (V / V) يستخدم تريتون X-100 على تعليق الجراثيم الفطرية، والمنظفات يعمل كعامل ترطيب غير سامة للجراثيم مسعور. حل 100 ميكرولتر تريتون X-100 في 1 لتر من الماء عالى النقاء. الأوتوكلاف.
  7. يستخدم 0.1 م العازلة الفوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.2) كمذيب لغلوتارالدهيد خلال SEM التثبيت. خلط 68.4 مل من 1 M نا 2 هبو 4 و 31.6 مل من 1 M ناه 2 ص 4 وجلب الحجم الإجمالي إلى 1 L مع الماء عالى النقاء 36.

3. إعداد المواد الأحيائي: إزالة التلوث السطحي من BDM أفلام

  1. لأن بقايا الملوثات مثل الورق والشريط على أواني القطع هي مصادر الكربون المحتملة، استخدم مقص حديثا شراؤها أو شفرات الحلاقة الطازجة، وسطح غير العضوية لقطع. ارتداء القفازات لتجنب التلوث من الأفلام BDM مع زيوت الجلد. خفض الأفلام BDM إلى مربعات صغيرة (4.25 X 4.25 سم). هذه الساحة حجم يلائم مستوى 100 × 15 ملم بيتري لوحة.
  2. استخدام مصباح الأشعة فوق البنفسجية مبيد للجراثيم (الانبعاثات الطول الموجي = 253.7 نانومتر) لتطهير الأفلام BDM. كثيرا ما وجدت مثل هذه مصباح في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية القياسية. ضمان أنه عندماضوء الأشعة فوق البنفسجية يعمل، وليس هناك تدفق الهواء الخارجي إلى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية التي قد تلوث الأفلام BDM.
  3. الأسطح الرطبة داخل غطاء محرك السيارة مع 70٪ ETOH وتسمح لك بتشغيل منفاخ لمدة 15 دقيقة لطرد الهواء. ثم، إغلاق وشاح وتطهير السطح غطاء محرك السيارة مع الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 ساعة.
  4. وضع الأفلام BDM في غطاء محرك السيارة تطهير، في الصفوف. تسمح للضوء الأشعة فوق البنفسجية للتألق على الأفلام لمدة 2 ساعة.
  5. استخدام نظيفة، ملقط معقم لقلب الأفلام BDM. تبدأ في الصف الأمامي والعمل على الصف الخلفي لتقليل الوقت الذي اليدين والذراعين هي مباشرة فوق السطوح BDM حديثا تطهير. عندما التقليب BDMs، وضع الجانب حديثا تطهيرها الهبوطي على منطقة نظيفة تتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية ولكن ليس سابقا على اتصال مع الجانب غير تطهيرها من الفيلم.
  6. بعد 2 ساعة من العلاج بالأشعة فوق البنفسجية على كل جانب، وإزالة الأفلام BDM من مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية مع ملقط معقم، والعمل مرة أخرى من الأمام إلى الخلف لتجنب وضع اليدين والذراعين فوق بالفعل decontamiالأفلام nated. وضع الأفلام BDM في العقيمة، والحاويات، الجافة المغطاة مثل الأكواب احباط المغطاة. تخزين في RT في الظلام.

4. الإعداد الأحيائي لوحة

تنفيذ كافة الخطوات في غطاء نقل معقمة باستخدام تقنية العقيم.

  1. وضع قطعة BDM UV-تطهيرها على سطح لوحات أجار. المنصوص عليها زاوية واحدة أولا، واسمحوا بلطف ما تبقى من لفة مربع في اتصال مع أجار. تجنب التجاعيد. وبعض الأفلام تشكيل التجاعيد وأثناء التخزين، وهذا أمر لا مفر منه. قد تتطلب الأغشية الرقيقة وخاصة استخدام ملقط اثنين من أجل وضع قطعة مسطحة.
  2. مكان حبات من نصف صلبة FMM داا 30 أجار فوق فيلم من البلاستيك لتوفير المياه والمغذيات مصدر للاستعمار الأولي من البلاستيك مسعور. حبات ليست ضرورية للأفلام نفاذية المياه. إعادة إذابة أجار في الميكروويف، واستخدام micropipettor لنقل أربعة 10 قطرات ميكرولتر من أجار المنصهر على المهاد (واحد في كل كورنير). لا تلمس غيض من ماصة مباشرة إلى المهاد لأنه قد ثقب. لا يتجاوز 10 ميكرولتر من كل قطرة ماء، وذلك لأن الوزن الزائد على نشارة يمكن سحب البلاستيك قبالة سطح أجار عندما مقلوب لوحات.
  3. السماح لوحات الجلوس الجانب الأيمن حتى مع الأغطية على ليلة وضحاها لترسيخ تماما، ومن ثم تخزين الأكمام مختومة من جانب أجار وصلت إلى 4 درجات مئوية في الظلام. عندما تصبح مستعدة لأداء الاختبار الأحيائي (الخطوة 7)، استخدم ط) لوحة واحدة من FMM داا 30 (المراقبة السلبية)، والثاني) واحدة تحتوي على أربعة لوحة الأحيائي 10 قطرات ميكرولتر من شبه الصلبة FMM داا 30 على فيلم من البلاستيك، والثالث) لوحة واحدة من GMM (مراقبة إيجابية). في هذه الطريقة، أربعة مكررات من كل عزل ويمكن اختبار لكل لوحة من المتوسط.

5. الإعداد الأحيائي السائل

  1. اتبع الإرشادات لقطع BDM في الخطوة 3.1. قبل تقطيع الأفلام البلاستيكية للالأحيائي السائل، واختيار الحجم الذي يناسب في أنبوب الثقافة.سوف تملك المساحات اللازمة لتحقيق كتلة موحدة بين عدة أنواع من البلاستيك تعتمد على سمك الفيلم. وجدنا أن قطعة ما يعادل 0.0175 ز تناسب بشكل جيد في 15 × 150 ملم أنابيب الثقافة.
  2. سطح تطهير الأفلام مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية كما هو موضح في الخطوة 3 أعلاه.
  3. لكل تكرار لعزل الميكروبات، وإعداد ثلاثة أنابيب للتلقيح: ط) 5 مل FMM تحتوي على جزء BDM من حجم محدد سلفا (التجريبية)، والثاني) 5 FMM مل مع عدم وجود مصدر الكربون (المراقبة السلبية)، والثالث) 5 مل GMM (مراقبة إيجابية). بالإضافة إلى ذلك، يعد تكرار أنابيب من FMM تحتوي كل BDM لفحصها، ولكن لا تطعيم لهم. وهذه الأنابيب مراقبة تكشف أي نمو الميكروبات الناتجة عن التلوث.

6. عزل الفطريات

حضانة التربة وإزالة عينة التالية، يتم عزل الفطريات من التربة التي تتمسك الأفلام BDM. إذا رغبت في ذلك، يمكن للبكتيريا simultaneouخبيث تكون معزولة مع نفس طريقة استخدام وسائل الإعلام المناسبة لعزل بكتريا التربة، مثل 1/10X تمييع زيتية الصويا أجار الخميرة تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد لردع نمو الفطريات 37. عندما يكون مطلوبا المتوسطة المعرفة من أجل العزلة البكتيرية في الخطوتين 5 و 7، M9 38 (زائد سيكلوهيكسيميد) هو خيار جيد.

  1. قبل لتجهيز العينات، وإعداد برنامج تلفزيوني وPDA داا 30. تسمح PDA 30 لوحات داا لتجف (unbagged) في درجة حرارة الغرفة لحوالي 24 ساعة للقضاء على التكثيف على الأغطية وسطح أجار. قبل التسمية PDA داا 30 لوحات.
  2. حفر أكياس شبكية تحتوي على قطع BDM من مواقع الدفن المختارة في الخطوة 1. السفينة وتخزينها في 4 درجة مئوية لا تزيد عن 48 ساعة بعد استخراج من التربة.
  3. باستخدام ملعقة العقيمة وملقط، وإزالة بلطف التربة حتى يتعرض البلاستيك ولكن لا تنظف قبالة التربة التي يتشبث BDM سطح الفيلم. خفض فيلم BDM إلى 1 سميتم استرداد 2 قطعة حتى 0.5 غرام من المواد لكل من أربعة مجموع مكررات. نقل 0.5 غرام BDM فيلم والتربة المرفقة إلى 25 مل تحتوي على أنابيب ثقافة 9.5 مل من برنامج تلفزيوني. إذا المهاد هو المتدهورة تماما أو يتم معالجة عنصر تحكم التربة فقط، إضافة 0.5 غرام من التربة إلى برنامج تلفزيوني، وإذا كان ممكنا، واختيار القطع التي لا تزال تغير لونها من نشارة المتبقية.
  4. دوامة الأنابيب الثقافة التي تحتوي على 9.5 مل PBS و 0.5 غرام المهاد لمدة 30 ثانية على سرعة عالية، يصوتن في بالحمام المائي sonicating لمدة 10 دقيقة، ودوامة مرة أخرى لمدة 30 ثانية. يقصد التحريض لتحطيم الأغشية الحيوية، وإزالة الخلايا جسديا أو جزءا لا يتجزأ من التمسك قطعة المهاد، وإنشاء نظام التعليق متجانسة.
  5. الاستعداد لتمييع متسلسل الحل PBS / التربة للحصول على وحدات تشكيل مستعمرة فرد من التصفيح. لكل عينة، ومكان في غطاء تدفق الصفحي واحد أنبوب ثقافة مليئة 4.5 مل العقيمة PBS. لكل عينة، وملء ثلاثة آبار من لوحة 96 جيدا في آبار عميقة مليئة 450 ميكرولتر PBS.
  6. البلاستيك / التربة التعليق الأصلي (0.5 غرام نشارة زائد 9.5 مل من برنامج تلفزيوني الحل) يمثل 5.0 × 10 -2 التخفيف من المواد الجرثومية والتمسك البلاستيك. إضافة 0.5 مل من تعليق من هذا الأنبوب الأصلي إلى 4.5 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة في أنبوب الثقافة للحصول على تخفيف × 10 -3 5.0. دوامة لمدة 30 ثانية على سرعة عالية. إضافة 50 ميكرولتر إلى 450 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في لوحة 96 جيدا. كرر لجميع العينات / مكررات. استخدام pipettor الأقنية لتمييع عينات بشكل جماعي. خلط كل تخفيف الجديدة من قبل pipetting صعودا وهبوطا عشر مرات. تغيير نصائح بين التخفيفات. جعل التخفيفات يصل إلى 5.0 × 10 -6.
  7. (اختياري) العزلات البكتيرية كانت أكثر وفرة من العزلات الفطرية في عينات الموصوفة هنا، وبالتالي إذا في وقت واحد عزل البكتيريا، ثم إجراء التخفيفات المتسلسلة يصل إلى 5 × 10 -8 في الخطوة 6.6 أعلاه.
  8. موزعة بالتساوي 100 ميكرولتر من كل من 5.0 × 10 -3 من خلال 5.0 × 10 -6التخفيفات عبر السطح من أجار PDA داا 30 لوحات مع لهب تعقيمها قضبان الزجاج عازمة. لوحات مخزن تستقيم لمدة 30 دقيقة للسماح السائل نقع في، ثم ختم لوحات مع parafilm لتجنب الهروب من جراثيم من العزلات مجهولة الهوية. احتضان لوحات مقلوب عند 20 درجة مئوية في الظلام لمدة 5 أيام للسماح لكلا الفطريات سريعة وبطيئة النمو لتشكيل المستعمرات.

7. الاختيار المبدئي للفطريات البلاستيك المهينة

هام: يجب فتح جميع الثقافات من هذه النقطة إلى الأمام فقط في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (وليس تدفق الصفحي هود) لتجنب تلوث البيئة مع جراثيم من مجهولي الهوية. بعض الفطريات والبكتيريا في التربة هي مسببات الأمراض البشرية المحتملة.

  1. فحص لوحات تخفيف تحتوي على مستعمرات معزولة بشكل جيد. اختر مستعمرة التي لم يتم لمس مستعمرة أخرى.
  2. باستخدام مسواك العقيمة واحد، المس بلطف مستعمرة ومن ثم لمس آغار من FMM (صنع في الخطوة 2.3 الخطوة 4)، وخرائط Google للجوال (صنع في الخطوة 2.3) لوحات، في هذا النظام. لتطعيم الخرز أغار على قمة الأفلام البلاستيكية، وفرك بلطف مسواك على السطح من نقطة أجار ثم مرر عبر فيلم من البلاستيك. تكرار التلقيح من نفس المصدر حتى مستعمرة هناك أربعة الشرائط تكرار في كل لوحة.
  3. كرر الخطوات من خلال 7.1 7.2 حتى عدة نسخ متماثلة من كل نوع مستعمرة بصريا فريدة من نوعها ويتم اختيار عينة من كل BDM.
  4. لوحات الختم مع parafilm، عكس، واحتضان عند 20 درجة مئوية في الظلام لمدة 5 أيام.
  5. تحديد العزلات التي تنمو على BDMs أفضل مما كانت تنمو على FMM. إذا كان النمو ليست واضحة، عرض عينة تحت مجهر تشريح للتحقق من الاستعمار أو عدم وجودها (الشكل 1). الحفاظ على الغطاء على، وإذا كان لديه غطاء التكثيف، مع استبدال غطاء جديد ولكن القيام بذلك في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية.
  6. مرة واحدة ويتم اختيار degraders BDM المحتملة، كما استخدمterile مسواك لتتخلص من اللقاح من الفطريات استعمار البلاستيك نفسها، ومسحة لعزل واحد مستعمرة تشكيل وحدات على PDA 30 لوحات شيلي.
  7. لوحات الختم مع parafilm واحتضان PDA داا 30 لوحات تلقيح مع العزلات البلاستيك المهينة عند 20 درجة مئوية لمدة 5 أيام في الظلام.
  8. والآن بعد أن المستعمرات المعزولة واحدة يتم تنقيته، وضمان أنها قادرة حقا لاستعمار الأفلام البلاستيكية التي يجري اختبارها. جمع اللقاح (الأبواغ، خلايا الخميرة، أو خيوط) من وحدة مستعمرة تشكيل واحد مع المسواك العقيمة. كرر الخطوات من 7.2 خلال 7.5. بعد 5 أيام من الحضانة عند 20 درجة مئوية، وفحص لوحات الأحيائي لنمو الفطريات. إذا كان عزل ينمو على فيلم BDM أفضل من أنها تنمو على FMM في كل من الأول (7.5) والثاني (7.8) المحاكمات، ثم تخزين عزل كما هو موضح أدناه في الخطوة 8.

8. التخزين على المدى الطويل Degraders بلاستيك وعموما، سوف يتم اختبار العزلات البلاستيك المهينة في الأحيائي لوحة (7.5)، وإعادة تنقيته إلى وحدات مستعمرة تشكيل المعزولة واحد (7.6)، واختبارها في لوحة الأحيائي مرة أخرى (7.8)، وأخيرا، واختبارها في الأحيائي السائل ( 9،1-9،5). أثناء الاختبار، ينبغي نقل العزلات إلى وسائل الإعلام الجديدة كل شهر وألواح الأسهم العاملة تخزينها في 4 درجة مئوية في أقرب وقت نمو كاف مرئيا. أيضا يجب أن يتم تخزين العزلات كما أسهم الجلسرين في -80 ° C، و / أو الأبواغ المجففة على الأقراص تصفية العقيمة في 4 درجات مئوية. يتم وصف كل طرق تخزين أدناه.

  1. لكل عزل التي نمت على فيلم BDM أفضل من نما على FMM في كل من الأول (7.5) والثاني (7.8) لوحة اختبارات بيولوجية، وإعداد اثنين PDA 30 لوحات شيلي مع اثنين أو ثلاثة أقراص تعقيم رقة الترشيح، وحوالي 1 سم في القطر ، على السطح. تطعيم هذه اللوحات اثنين مننفس مستعمرة واحدة في اختيار الخطوة 7.8 أعلاه. جعل الحديقة عن طريق نشر اللقاح بشكل موحد على أجار لتحقيق أقصى قدر من النمو. ختم لوحات مع parafilm واحتضان عند 20 درجة مئوية لمدة 5 أيام. ويمكن البدء في هذه الخطوة بالتزامن مع الخطوة 7.8 من الكفاءة.
  2. يجب تغطية القرص مرشح على سطح أجار مع أفطورة / جراثيم. إزالة الأقراص مرشح من سطح آغار مع ملقط معقم، ومكان في أنبوب إيبندورف العقيمة. الهواء الجاف الأقراص مرشح بين عشية وضحاها داخل إيبندورف أنابيب (مع قبالة كاب) في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية أو غيره الجافة، بيئة معقمة مع حركة الهواء الحد الأدنى لتجنب التلوث المتبادل. ثم ختم مع parafilm، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
  3. استخدام مسحة القطن المعقم أو مسواك لحصاد الجراثيم وفطر من لوحات الحديقة. تعليق جراثيم وخيوط في الجلسرين 30٪ في cryovials، فلاش تجميد في النيتروجين السائل، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

9. التعاون صرامةnfirmation من استخدام البلاستيك عبر الأحيائي السائل

  1. تولد الجراثيم الطازجة و / أو الخلايا التي لتطعيم الثقافات السائل: تطعيم PDA 30 لوحات شيلي مع جراثيم من المحتمل العزلات المهينة البلاستيك. ختم لوحات مع parafilm، واحتضان عند 20 درجة مئوية حتى الجراثيم الفطرية مرئية.
  2. في خزانة السلامة الأحيائية، جراثيم الحصاد عن طريق غسل لوحة مع 0.01٪ تريتون X-100 (5 مل لكل 15 × 100 ملم بيتري لوحة يعمل بشكل جيد)، وتنقية الجراثيم (أو خلايا الخميرة) من على سطح الأرض مع العقيمة قضيب عازمة الزجاج . نضح بوغ (أو خلايا) التعليق ونقل في وعاء معقم.
  3. عد الجراثيم أو الخلايا مع عدادة الكريات وتحديد حجم مناسب لإضافة إلى 5 مل من مرق FMM لما مجموعه 1 × 10 6 جراثيم / أنبوب. يجب أن يكون حجم أقل من 10 ميكرولتر. التخفيف من تعليق بوغ المركزة في 0.01٪ تريتون قد يكون من الضروري X-100.
  4. في غطاء نقل معقمة، تطعيم أنابيب ثقافة أعدت في 6 جراثيم (أو خلايا الخميرة). ختم قبعات مع parafilm لتجنب أي محاولة للهرب من جراثيم، لا سيما بالنسبة العزلات مجهولة الهوية. احتضان في الظلام في 20 ° C ومراقبة عينات أسبوعية للنمو.
  5. نمو فطر من الفطريات على الأفلام البلاستيكية قد تكون مرئية خلال الأسبوع الأول بعد التلقيح، وخاصة على حواف الأفلام البلاستيكية. للخميرة العوالق (كما يتضح من غائم وسائل الإعلام)، والنمو يمكن رصدها من قبل قراءات الكثافة البصرية في 600 نانومتر. لأن الفطريات من المرجح أن نعلق مباشرة إلى فيلم من البلاستيك، والنمو قد يتم تقييمها من قبل العين، ويمكن التأكد من المجهر الضوئي و / أو المجهر الإلكتروني (SEM).
  6. في الضوابط FMM فقط، والبحث عن البقع البيضاء ضئيلة التي هي صغيرة جدا لتسجيل التغيير في الكثافة البصرية باستخدام أساليب الطيفي. يمكن أن يستنشق هذه البقع مع ماصة باستور، ولاحظ استخدام التدخل التفاضلية (DIC) المجهري. البقع غالبا ما تكون preci هويتهpitate، ولكن في بعض الحالات قد تكون كتل من قيحة الأصلي الذي قد نبتت ولكن لم نمت بشكل كبير.
  7. استخدام الملاحظات البصرية والمجهرية للمقارنة بين الاستعمار من العينات التجريبية والضوابط، وتعيين الدرجات لنمو على كل عينة من الفيلم BDM. لأن العديد من BDMs مظلمة في اللون وتسمح الحد الأدنى من المراقبة عن طريق الفحص المجهري إلا عند الحواف، ويحظر سماكة الفيلم المراقبة تحت عدسة النفط الغمر، ووزارة شؤون المرأة مفيد لتقدير ط) وجود نمو الجراثيم، على سبيل المثال عن طريق نظام التصويت وصفها في الجدول 1، والثاني) على مدى تدهور BDM.

10. SEM تحضير العينة

  1. استخدام نظيفة، مقص العقيمة لقطع قطعة صغيرة من BDM من عينات تكرار. إصلاح BDMs بغمر في 2.5٪ غلوتارالدهيد في 0.1 م العازلة الفوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.2) لمدة 24-48 ساعة.
  2. في حين التثبيت يحدث، يذوى نقية 100٪ من الإيثانول بإضافة 5-10٪ VOلوم 3 Å المنخل الجزيئي (تفعيلها في فرن تجفيف في 175-260 درجة مئوية وتبريده في مجفف)، والسماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها لضمان مجموع الجفاف.
  3. BDMs تزج في 0.1 م العازلة الفوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.2) لمدة أربعة يغسل من 15 دقيقة لكل منهما.
  4. BDMs يغمر في الماء عالى النقاء لمدة ثلاث غسلات من 5 دقائق لكل منهما.
  5. يذوى العينات BDM في سلسلة الإيثانول، تخبط لمدة 20 دقيقة في كل تركيز: 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، 95٪، و 100٪. شطف BDMs مرتين أكثر في الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 20 دقيقة لكل شطف.
  6. العينات تخضع لتجفيف نقطة حرجة وتفل الطلاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في دراسة أجريت مؤخرا 24، أربعة مكررات كل من ثلاثة BDMs المتاحة تجاريا المسمى "تحلل"، بالإضافة إلى الفيلم التجريبي والتحكم البلاستيك التقليدية، وضعت على التربة كما المهاد لإنتاج الطماطم في ربيع عام 2010 في ماونت فيرنون، WA، نوكسفيل، TN، ووبوك، تكساس. في خريف عام 2010، وقطعت الساحات فيلم BDM من نجا من نشارة في أربع قطع كل تكرار، وتمت إزالة التربة الأصلية من مباشرة تحت منطقة حيث تم رفعه العينة المهاد. كل نجا وتقع مربع BDM في التربة داخل كيس نايلون شبكة كما هو موضح في الخطوة 1. أدرج أيضا عنصر تحكم التربة فقط. دفنت أكياس تحت 7.5 سم من التربة في نفس المؤامرات والصفوف مغطاة سابقا من قبل المهاد، وتركت في مكانها حتى ربيع 2011 الحراثة، وبعد سبعة أشهر. ثم تم رفع أكياس من المؤامرات مع مجرفة، توضع في أكياس البلاستيك ختم، وشحنها إلى المختبر على كمادات الثلج للتسليم في اليوم التالي.

<فئة P = "jove_content"> نحن هنا تقرير نتائج ممثل من دراستنا. تم عزل الفطريات التربة الأم من كل BDM في جميع المواقع الثلاثة، ليصبح المجموع 54 العزلات. وصفنا العزلات من اثنين من المنتجات التجارية المستخدمة في موقع واحد (ماونت فيرنون). كان واحدا من المنتجات من البلاستيك القابلة للتحلل دعا BioAgri. تتم تسمية هذا الفيلم الأسود بأنه "النشوية" (BioAgri، بالم هاربور، FL) ومصنوعة من البلاستيك الحيوي ماطر-بي من قبل Novamont (تيرني، إيطاليا). ماطر-بي هو مزيج من "نشا الذرة، والبوليمرات القابلة للتحلل التي تم الحصول عليها سواء من المواد الخام المتجددة والمواد الخام الأحفوري" ( http://www.novamont.com/default.asp؟id=505 ). كان منتج آخر وليس من البلاستيك ولكن بدلا من البني "مثل ورقة المواد المصنوعة من ألياف السليلوز خصيصا الهندسة" (WeedGuard زائد، والشمس المشرقة ورقة المشارك، أورورا، CO)، ( http://www.weedguardplus.com/faqs.php ). هذا برووكان لاصق شمل أصلا كما كان متوقعا عنصر تحكم وتدهور مكوناته السليلوزية.

باستخدام لوحة الأحيائي الموصوفة هنا، تم انتشال ثلاث عزلات BDM-المهينة المحتملة من WeedGuard زائد وثلاثة من BioAgri. وتعرض هذه العزلات إلى الأحيائي السائل (خطوات 9،1-9،7 أعلاه) في ثلاث نسخ. على الرغم من أن بعض نمو الفطريات كانت مرئية على طول حواف BDMs بعد أسبوع واحد في الأحيائي السائل، وحضنت العينات لقبل النهائي الحصاد والمراقبة 68 يوما. باستخدام SEM، وقد لوحظت خيوط فطرية في جميع العينات فيما عدا XX YY و، حيث لاحظنا الخلايا على شكل قضيب (الجدول 2). لأن XX YY وتنمو في شكل الخميرة على PDA داا 30، وكان من المتوقع هذه الملاحظة.

لWeedGuard العزلات بالاضافة الى ذلك، لم يلاحظ أي نمو في عناصر التحكم FMM فقط. وقد لوحظ تدهور معظم BDM في العينات التي استعمرتها عزل SS. في كنترول uninoculatedLS لWeedGuard زائد المهاد (الشكل 2A)، وعناصر tracheary المتبقية من الألياف المشتقة من النباتات قابلة للكشف فقط كما طفيف بثرة وسم ينظر في الصفوف على بعض الألياف. على الرغم من وحظت خيوط فطرية في جميع العينات ثلاثة تلقيح، كانت عناصر tracheary مرئية بوضوح فقط في العينات SS (الشكل 2B)، مما يوحي بأن هضم المواد السليلوزية كشف العناصر tracheary lignified تحت. وقد تم تحديد عزل SS مبدئيا باستخدام الحمض النووي 18S الريباسي باعتبارها sordariomycete داخل Sordariales النظام.

لعزلات BioAgri، لوحظ عدم وجود نمو كبير في الضوابط FMM فقط. وقد لوحظت بقع بيضاء واحدة واضحة على يحوم أنابيب ثقافة العزلات VV وZZ باستخدام المجهر DIC. لعزل VV، كان شبيك كتلة بوغ (لا يظهر)، ويفترض المتبقية من التلقيح الأولي. لعزل ZZ، تألفت كتلة من شبكة فضفاضة من خيوط حوالي 0.2 مم، مما يدل على أن اللقاح بوغ الأصلي قد نبتت، ولكن لم نمت بعد كتلة المصورة في الشكل 3A.

في ضوابط uninoculated لنشارة BioAgri (الشكل 3B)، لوحظ نسيج وعرة. هوية أبيض الميزات غير معروف، لكنها غائبة في فيلم مستعمرة من قبل عزل VV (الشكل 3C). ولت كل من جزيئات بيضاء والمطبات في فيلم مستعمرة من قبل عزل ZZ (الشكل 3D). وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت العينة الأخير وقوع موحدة من التشققات على سطح BDM. وقد تم تحديد العزلات VV وZZ مبدئيا باستخدام الحمض النووي 18S الريباسي كما البنسليوم ليرة سورية. (VV) وsordariomycete داخل المستلحمات النظام (ZZ)، على التوالي.

علامة مظهر من نمو الميكروبات
0 أي نمو واضح بالعين أوبواسطة المجهر
1 الجراثيم النابتة ولكن أي نمو لاحقة واضح
2 نمو تغطي ≤ 25٪ من سطح اختبار أو المتوسطة
3 نمو تغطي ≤ 50٪ من سطح اختبار أو المتوسطة
4 نمو تغطي ≤ 75٪ من سطح اختبار أو المتوسطة
5 نمو تغطي> 75٪ من سطح اختبار أو المتوسطة

الجدول 1. نظام التسجيل لنمو الجراثيم التصويت على عينات اختبار من الأفلام البلاستيكية.

> فطر وسلاسل بوغ لوحظ عند حافة
عزل BDM

السيطرة FMM فقط (النتيجة)

FMM تحتوي على 0.0175 ز BDM (التقييم و / أو التعاونmments)
تقييم البصرية المجهر الضوئي SEM
SS WG 0 خيوط وألياف BDM تمييزه خيوط وألياف BDM تمييزه 2؛ خيوط فطرية مرئية
TT WG 0 خيوط وألياف BDM تمييزه خيوط وألياف BDM تمييزه 2؛ خيوط فطرية مرئية
XX WG 0 مرق غائم قليل من الخلايا التي لوحظت في مرق 2؛ خلايا على شكل قضيب على سطح
VV BA 1 غرامة فطر مرئية عند حافة 4؛ خيوط غزير وconidiophores
YY BA 0 مرق غائم قليل من الخلايا التي لوحظت في مرق 2؛ خلايا على شكل قضيب على سطح
ZZ BA 1 نمو أفطوري الفاخرة على كامل السطح خيوط مرئية عند حافة 5؛ خيوط غزير

الجدول 2. ملاحظات وتقييمات لنمو العزلات الفطرية التي تم الحصول عليها من نجا الأفلام BDM دفن في مؤامرات حقل من خريف 2010 حتى ربيع 2011 (7 أشهر) في ماونت فيرنون، تلقيح في وقت لاحق على مواد BDM unweathered والمحتضنة لمدة 68 أيام عند 20 درجة مئوية في الظلام . WG = WeedGuard زائد؛ BA = BioAgri. انظر الجدول رقم 1 لمخطط تصنيف النمو.

fig1.jpg "/>
الشكل 1. استعمار BioAgri المهاد في الأحيائي لوحة موضح في الخطوة 7، كما ينظر تحت المجهر تشريح في التكبير 20X.

الشكل 2
الشكل 2. ظهور WeedGuard زائد نشارة بعد 68 أيام في FMM لكن ليس تلقيح (A)، أو تلقيح مع عزل ZZ، حدد مبدئيا كما Chaetomium ليرة سورية. (B). ملاحظة العناصر tracheary (الأسهم) التي هي بالكاد يمكن تمييزها في A، ولكن ينظر اليه بشكل واضح في (ب). وكان أي نمو واضحة في السيطرة FMM فقط للChaetomium عزل. وقد تم طلاء العينات مع الاتحاد الافريقي / المشتريات باستخدام النصاب القانوني SC7640 بصق المغطي، وتصويرها في جهد التعجيل من 15 كيلو فولت على Tescan VEGA 5136 MM SEM.

"jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما"> الشكل (3)
الشكل (3). المظهر من نشارة BioAgri بعد 68 يوما في الأحيائي السائل. ولوحظ وجود أجمة واحدة من الجراثيم النابتة في السيطرة FMM فقط للZZ عزل، حدد مبدئيا باعتبارها Sordariomycete (A). BioAgri نشارة المحتضنة في FMM uninoculated (B)، BioAgri نشارة تلقيح مع عزل VV، حدد مبدئيا كما البنسليوم ليرة سورية. (C)، وBioAgri نشارة حضنت مع عزل ZZ (D). وقد تم طلاء العينات مع الاتحاد الافريقي / المشتريات باستخدام النصاب القانوني SC7640 بصق المغطي، وتصويرها في جهد التعجيل من 15 كيلو فولت على Tescan VEGA 5136 MM SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصف الإجراء يمثل هنا تقنية تمرير أول لعزل degraders BDM المحتملة من التربة، وكان يستخدم بنجاح لعزل الفطريات من BDMs مدفونة في التربة لمدة سبعة أشهر. نمت الفطريات عندما reinoculated على المواد BDM جديدة من نفس النوع، مشيرا إلى أن الفطريات المعزولة كانت في الواقع المستعمرين، وأن هذه الأفلام لم تكن المثبطة لنمو الفطريات. عزل الفطريات من البلاستيك المهينة والبكتيريا المحتمل أن تؤدي إلى استعمالها، بشكل فردي أو في مجموعات، لإدخال تعديلات على التربة أو السماد حيث يحتاج البلاستيك لتكون المتدهورة.

في بيئة التربة الأصلية الخاصة بهم، والأنواع الميكروبية لا وجود لها في عزلة. degraders البلاستيك والكائنات الحية حتى قليل التغذية المتزايد على BDMs، ولكن باستخدام الكربون ومصادر الطاقة الأخرى، يمكن أن تكون الأنواع الرئيسية في استعمار هذه المصادر المغذيات المتمردة. في محاولة لتقييم تدهور BDM في المختبر ولكن تحاكي أفضل microbi التربة الحقيقيآل المجتمع، فإن المنهجية الموصوفة هنا يمكن تغييرها لاختبار الخلائط، بدلا من عزلات نقية، من قائح الفطرية والبكتيرية.

من المذكرة، يعزل TT، XX، VV، وحققت YY تدهور الحد الأدنى من BDMs، إلا أن كل مرئية الاستعمار BDM في كل لوحة وسائل اختبارات بيولوجية. وبالتالي، لم الاستعمار مرئية لا يعني بالضرورة تدهور BDM البوليمر. يعزل TT، XX، VV، ومن المرجح أن تمثل oligotrophs YY أن المواد الغذائية التي تم الحصول عليها من البيئة وكذلك من BDM 29،30،31.

أدلة قاطعة على أن الفطريات تستخدم BDM خاصة كمصدر الكربون يتطلب قياس التدهور عبر الطرق الكيميائية. تطور ثاني أكسيد الكربون أثناء الحضانة من البلاستيك مع microogranisms يشير إلى التنفس، ويمكن استخدامها كإجراء غير مباشر من البوليمر انهيار 15،16،39. وتستخدم أساليب مختلفة للحصول على معلومات حول حجم وهيكل من البوليمرات، بما فيuding عالية الأداء اللوني السائل، وحجم الاستبعاد اللوني، الفرق الكالوري المسح الضوئي، والتحليل الوزني الحراري، التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي، حيود الأشعة السينية، وتحويل فورييه الطيفي بالأشعة تحت الحمراء. ودراسات لتقييم CO 2 تطور وانهيار البوليمر تمثل تقدما منطقيا من إجراءات الفحص الموصوفة هنا. ومع ذلك، يمكن أن الطرق الكيميائية لقياس الأحجام البوليمر لا يفرق تدهور الأنزيمية من التحلل بواسطة الأحماض العضوية يفرز أثناء النمو عن طريق الفطريات والبكتيريا. والآثار المترتبة على آلية الأنزيمية في انهيار البلاستيك تتطلب عزل انزيم النقي (ق) قادرة على البوليمرات المهينة في المختبر.

يجب أن تكون الإجراءات المذكورة هنا تنطبق على نطاق واسع لأية البلاستيك التي تستخدم في التشكل الفيلم، مثل مواد التعبئة والتغليف الغذائي أو أكياس القمامة. هذه الإجراءات لها العديد من المزايا. أولا، الأفلام البلاستيكية المستخدمة في bioassay هي في شكل تجاري، وأنها متاحة للشراء في السوق وتدهور في نهاية المطاف في البيئة. والتحذير هو أن المواد البلاستيكية المستخدمة، مثل BDMs حصادها بعد موسم النمو عام 2010 في هذه الدراسة، قد يكون أكثر نجا من الأفلام البلاستيكية الجديدة المستخدمة في اختبارات بيولوجية في المختبر. هجوم الجراثيم قبل والأشعة فوق البنفسجية والرياح وتآكل التربة بواسطة الجسيمات، التحلل الكيميائي عن طريق مكونات التربة غير العضوية، والحيوانات التربة كلها عوامل تساهم في الأكسدة وتفتيت البوليمرات، وتغيير كفاءة العمل الأنزيمي على BDM الأفلام 11. A الميزة الثانية هي أن هذه الطريقة يمكن استخدامها أم لا المكونات الفردية من المنتجات البلاستيكية الملكية معروفة و / أو متاحة في شكل نقي للاختبار. ومع ذلك، وجود قيود على استخدام البلاستيك مع الهيئات المكونة من مدينة أو غير معروف هو أن تدهور مرئية لا يمكن تعيين بالتأكيد لمكونة واحدة. على سبيل المثال، يمكن للتدهور في الشكل 3D تمثل النشا بreakdown دون تدهور البوليمرات أكثر المتمردة في "النشوية" فيلم BioAgri. في دراسة سابقة بشأن تدهور في التربة من الأفلام البلاستيكية المعدل النشا، ومعدلات تطور غاز ثاني أكسيد الكربون تعكس كميات من النشا وصبغ إضافة إلى الأفلام، في حين أيد تغيير الأوزان الجزيئية البوليمر فرضية أن المواد المضافة، وليس البوليمرات، ويجري استخدامها من قبل الكائنات الحية الدقيقة 39. وأخيرا، ويركز هذا الإجراء على تدهور في المختبر، وبالتالي توفير نظام أكثر تحديدا من تلك الموجودة حاليا في استخدام معيار 15،16. ومن المتوقع أن عينات المهينة في المتوسط ​​محددة الصفات كيميائيا سوف يثبت أسهل للتقييم عبر الطرق الكيميائية من عينات المهينة في التربة أو السماد. هذه التقييمات هي التركيز الحالي لهذا العمل.

وكان هذا الإجراء الناجح لعزل الفطريات BDM-المهينة والبكتيريا من أربعة أنواع من الأفلام BDM في ثلاثة مواقع داخل الولايات المتحدة (TN، WA، وTX)، مع مختلف نحنالاخر، وأنواع التربة، والميكروبية الهياكل المجتمعية. هذا الإجراء يأخذ وجهة نظر اختزالية، مع التركيز على العزلات الفردية مع القدرة على النمو عليها، وانهيار BDMs. ومع ذلك، فإن النتائج تؤكد على أهمية تحليل المجتمع الميكروبي لوصف أدوار منفصلة ومرتبطة من المستعمرين قليل التغذية، النية الحسنة depolymerizers BDM، وغيرهم من أفراد المجتمع، ومن المتوقع أن تكون مهمة في الهدف النهائي المتمثل في تدهور كاملة من الأفلام البلاستيكية وكلها إلى الكتلة الحيوية، وثاني أكسيد الكربون و / أو الميثان، والماء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

واعترف الدكتور ستيفن عضو مجلس محلي، والدكتور ديفيد ورقة، وايرين ماكري بامتنان للمساعدة في الفحص المجهري. وقد تم تمويل هذا البحث من خلال منحة من مبادرة بحوث المحاصيل الاختصاص NIFA، جائزة وزارة الزراعة الأميركية SCRI-SREP منحة رقم 2009-02484. قدمت برينا Kinash، كيفن كينلوتش، ميغان ليونارد جوزيف ماكولوم، ماريا McSharry ونيكول Sallee المساعدة التقنية ممتازة ومناقشات مدروس.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Potato Dextrose Agar Becton Dickinson 8X05491
Agar Fisher BP 1423-2
Chloramphenicol Acros Organics 200-287-4
Glutaraldehyde Electon Microscopy Sciences 16216-10 Toxic
Molecular sieve Fisher M-8892
Ethanol Pharmco-Aaper E200
Contrex Decon Labs, Inc. 5204
Parafilm M Pechiney Plastic Packaging S37440
Mineral salts for buffers and media Fisher Various Various vendors sell these reagents

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregory, M. R. Environmental implications of plastic debris in marine settings - entanglement, ingestion, smothering, hangers-on, hitch-hiking and alien invasions. Philosophical Transactions of the Royal Society. 364, 2013-2025 (2009).
  2. Teuten, E. L., Saquing, J. M., et al. Transport and release of chemicals from plastics to the environment and to wildlife. Philosophical Transactions of the Royal Society. 364, 2027-2045 (2009).
  3. Thompson, R. C., Moore, C. J., vom Saal, F. S., Swan, S. H. Plastics the environment and human health: current consensus and future trends. Philosophical Transactions of the Royal Society. 364, 2153-2166 (2009).
  4. ASTM D 883. Standard terminology relating to plastics. , American Society for Testing and Materials International. West Conshohocken, PA. (1991).
  5. SO 472. Plastics - vocabulary, amendment 3. General terms and terms relating to degradable plastics. , International Organization for Standardization. Geneva, Switzerland. (1993).
  6. Krzan, A., Hemjinda, S., Miertus, S., Corti, A., Chiellini, E. Standardization and certification in the area of environmentally degradable plastics. Polymer Degradation and Stability. 91, 2819-2833 (2006).
  7. Shogren, R. L. Biodegradable mulches from renewable resources. Journal of Sustainable Agriculture. 16, 33-47 (2000).
  8. Takakura, T., Fang, W. Climate under cover. , Kluwer Academic Publishers. 1-10 (2001).
  9. Miles, C., Hayes, D., Brodhagen, M., Lee, J., Wszelaki, A., Moore-Kucera, J., Wallace, R., Marsh, T., Inglis, D. Plastic mulches, biodegradable alternatives, China and US. Transforming Landscapes, Transforming Lives: The Business of Sustainable Water Buffer Management. van Steenbergen, F., Tuinhof, A., Knoop, L. , 3R Water Secretariat. Wageningen, The Netherlands. (2011).
  10. Song, J. H., Murphy, R. J., Narayan, R., Davies, G. B. H. Biodegradable and compostable alternatives to conventional plastics. Transactions of the Royal Society B. 364, 2127-2139 (2009).
  11. Hayes, D. G., Dharmalingam, S., Wadsworth, L. C., Leonas, K. K., Miles, C., Inglis, D. A. Biodegradable agricultural mulches derived from biopolymers. Degradable polymers and materials, principles and practice. ACS Symposium Series. Khemani, K. C., Scholz, C. 1114, 2nd Ed, American Chemical Society Press. Washington, D.C. 201-223 (2012).
  12. Ojeda, T. F. M., Dalmolin, E., Forte, M. M. C., Jacques, R. J. S., Bento, F. M., Camargo, F. A. O. Abiotic and biotic degradation of oxo-biodegradable polyethylenes. Polymer Degradation and Stability 94. , 965-970 (2009).
  13. van der Zee, M. Analytical methods for monitoring biodegradation processes of environmentally degradable polymers. Handbook of Biodegradable Polymers. Lendlein, A., Sisson, A. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany. 263-281 (2011).
  14. Narayan, R. Misleading claims and misuse of standards continues to proliferate in the nascent bioplastics industry space. BioPlastics. 01/10, (2010).
  15. ASTM D 5338-98. Standard test method for determining aerobic biodegradation of plastic materials under controlled composting conditions. Annual Book of ASTM Standards. , American Society for Testing and Materials International. West Conshohocken, PA. 504-509 (1998).
  16. ASTM D 5988-03. Standard test method for determining aerobic biodegradation in soil of plastic materials or residual plastic materials after composting. Annual Book of ASTM Standards. , American Society for Testing and Materials International. West Conshohocken, PA. 354-358 (2003).
  17. ASTM D 6954-04. Standard guide for exposing and testing plastics that degrade in the environment by a combination of oxidation and biodegradation. Annual Book of ASTM Standards. , American Society for Testing and Materials International. West Conshohocken, PA. 748-753 (2004).
  18. ASTM G21-96. Standard practice for determining resistance of synthetic polymeric materials to fungi. Annual Book of ASTM Standards. , American Society for Testing and Materials International. West Conshohocken, PA. 433-437 (2002).
  19. ISO 846. Plastics - evaluation of the action of microorganisms. , International Organization for Standardization. Geneva, Switzerland. 1-22 (1997).
  20. Russell, J. R., Huang, J., et al. Biodegradation of polyester polyurethane by endophytic fungi. Applied and Environmental Microbiology. 77, 6076-6084 (2011).
  21. Maeda, H., Yamagata, Y., Abe, K., Hasegawa, F., Machida, M., Ishioka, R., Gomi, K., Nakajima, T. Purification and characterization of a biodegradable plastic-degrading enzyme from Aspergillus oryzae. Applied Microbiology and Biotechnology. 67, 778-788 (2005).
  22. Tokiwa, Y., Calabia, B. P. Biodegradability and biodegradation of poly(lactide. Applied Microbiology and Biotechnology. 72, 244-251 (2006).
  23. Karjomaa, S., Suortti, T., Lempiäinen, R., Selin, J. -F., Itävaara, M. Microbial degradation of poly-(L-lactic acid) oligomers. Polymer Degradation and Stability. 59, 333-336 (1998).
  24. Miles, C., Wallace, R., et al. Deterioration of potentially biodegradable alternatives to black plastic mulch in three tomato production regions. HortScience. 47 (9), 1270-1277 (2012).
  25. Hedh, J., Wallander, H., Erland, S. Ectomycorrhizal mycelial species composition in apatite amended and non-amended mesh bags buried in a phosphorus-poor spruce forest. Mycological Research. 112, 681-688 (2008).
  26. Wallander, H., Hagerberg, D. Do ectomycorrhizal fungi have a significant role inweathering of minerals in forest soil?. 4th International Symbiosis Congress, Halifax, Canada, , (2003).
  27. Hehemann, J. -H., Correc, G., et al. Biochemical and structural characterization of the complex agarolytic enzyme system from the marine bacterium Zobellia galactanivorans. Journal of Biological Chemistry. 287, 30571-30584 (2012).
  28. Stanier, R. Y. Studies on marine agar-digesting bacteria. Journal of Bacteriology. 42 (4), 527-559 (1941).
  29. Hirsch, P. Microbial life at extremely low nutrient levels. Advances in Space Research. 6, 287-298 (1986).
  30. Wainwright, M., Adam, T., Barakah, F. A review of the role of oligotrophic micro-organisms in biodeterioration. International Biodeterioration and Biodegradation. 31, 1-13 (1993).
  31. Wainwright, M., Barakah, R., Al-Turk, I., Ali, T. A. Oligotrophic micro-organisms in industry, medicine, and the environment. Science Progress. 75, 313-322 (1991).
  32. Parkinson, S. M., Wainwright, M., Killham, K. Observations on oligotrophic growth of fungi on silica gel. Mycological Research. 93 (4), 529-534 (1989).
  33. Hill, T., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Newsletter. 48, 20-21 (2001).
  34. Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. Some approaches to the study of the role of metals in the metabolism of microorganisms. Proceedings of the American Philosophical Society. 94, 152-170 (1950).
  35. Affeldt, K. J., Brodhagen, M., Keller, N. P. Aspergillus oxylipin signaling and quorum sensing pathways depend on G protein-coupled receptors. Toxins. 4, 695-6171 (2012).
  36. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratories Press. Cold Spring Harbor, New York, NY. (2001).
  37. Marzluf, G. A. Physiology, metabolism, and molecular aspects of filamentous fungi. Methods for General and Molecular Microbiology. Reddy, C. A., Beveridge, T. J., Breznak, J. A., Marzluf, G. A., Schmidt, T. M., Snyder, L. R. , ASM Press. Washington, D.C. 952-964 (2007).
  38. Peters, J. E. Gene transfer in Gram-negative bacteria. Methods for General and Molecular Microbiology. Reddy, C. A., Beveridge, T. J., Breznak, J. A., Marzluf, G. A., Schmidt, T. M., Snyder, L. R. , ASM Press. Washington, D.C. 735-755 (2007).
  39. Yabannavar, A. V., Bartha, R. Methods for assessment of biodegradability of plastic films in soil. Applied and Environmental Microbiology. 60 (10), 3608-3614 (1994).

Tags

علم الأحياء الدقيقة، العدد 75، بيولوجيا النبات، العلوم البيئية، العلوم الزراعية، علوم التربة، علم الأحياء الجزيئي، علم الأحياء الخلوي، علم الفطريات، الفطريات والبكتيريا والمكروبات البلاستيكية القابلة للتحلل، ونشارة القابلة للتحلل، سماد البلاستيك، نشارة سماد، وتدهور البلاستيك، التسميد، وانهيار، التربة، والعزلة، والثقافة
عزل الكائنات الدقيقة في التربة الأصلية مع المحتملة لتحطيم القابلة للتحلل أفلام الجرثومة البلاستيكية المستخدمة في الزراعة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bailes, G., Lind, M., Ely, A.,… More

Bailes, G., Lind, M., Ely, A., Powell, M., Moore-Kucera, J., Miles, C., Inglis, D., Brodhagen, M. Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture. J. Vis. Exp. (75), e50373, doi:10.3791/50373 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter