Summary
लैंगरहैंस की पृथक माउस टापू का उपयोग इन विट्रो β सेल समारोह परख मधुमेह pathophysiology, और चिकित्सा विज्ञान के अध्ययन में एक महत्वपूर्ण घटक है. कई बहाव के अनुप्रयोगों उपलब्ध हो रहे हैं, इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से β सेल समारोह का निर्धारण एक आवश्यक पैरामीटर के रूप में intracellular चक्रीय adenosine monophosphate (शिविर) के माप का वर्णन करता है.
Abstract
अनियंत्रित glycemia मधुमेह की एक बानगी है और न्यूरोपैथी, अपवृक्कता, और रेटिनोपैथी तरह रुग्णता को बढ़ावा देता है. मधुमेह, प्रतिरक्षा की मध्यस्थता टाइप 1 और मोटापे से जुड़े टाइप 2 दोनों, मधुमेह pathophysiology और चिकित्सकीय तंत्र delineating के उद्देश्य से पढ़ाई की बढ़ती व्यापकता के साथ महत्वपूर्ण महत्व के हैं. लैंगरहैंस की अग्नाशय islets की β-कोशिकाओं उचित बुलंद रक्त ग्लूकोज सांद्रता के जवाब में इंसुलिन स्रावित के लिए जिम्मेदार हैं. ग्लूकोज और अन्य पोषक तत्वों, β-कोशिकाओं को भी विशिष्ट हार्मोन द्वारा प्रेरित कर रहे हैं इसके अलावा, intracellular चक्रीय adenosine monophosphate का उत्पादन बढ़ाने कि β सेल रिसेप्टर्स पर एक भोजन और अधिनियम के जवाब में पेट से स्रावित होते हैं जो incretins, (करार दिया शिविर). कमी हुई β सेल समारोह, जन, और Incretin जवाबदेही टाइप 2 मधुमेह के pathophysiology के लिए योगदान करने के लिए अच्छी तरह से समझ रहे हैं, और भी तेजी वाई लिंक किया जा रहे हैंवें टाइप 1 मधुमेह. वर्तमान माउस आइलेट अलगाव और शिविर दृढ़ संकल्प प्रोटोकॉल रोग प्रगति और उपचारात्मक उपायों, intracellular शिविर उत्पादन के मॉडुलन के माध्यम से कार्य रिसेप्टर्स कि Incretin रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता या संबंधित हैं कि विशेष रूप से उन लोगों को बढ़ावा देने के तंत्र को चित्रित करने में मदद करने के लिए एक उपकरण हो सकता है. केवल शिविर माप वर्णित जाएँगे, वर्णित आइलेट अलगाव प्रोटोकॉल भी ग्लूकोज इंसुलिन स्राव, [3 एच] thymidine निगमन, प्रोटीन बहुतायत, और mRNA अभिव्यक्ति प्रेरित सहित कई अन्य बहाव के अनुप्रयोगों के लिए अनुमति देता है एक स्वच्छ तैयारी बनाता है.
Introduction
euglycemia की सख्त रखरखाव अनियंत्रित टाइप 1 और 2 मधुमेह 1 की विकृति के सभी पहचान कर रहे हैं जो इस तरह के न्यूरोपैथी, अपवृक्कता, और रेटिनोपैथी, के रूप में रुग्णता को रोकने के लिए जरूरी है. टाइप 1 और 2 मधुमेह दोनों में कम β सेल समारोह और बड़े पैमाने पर रक्त ग्लूकोज सांद्रता 2 उपद्रव. इंसुलिन के उत्पादन β-कोशिकाओं, बिगड़ा β सेल इंसुलिन स्राव और प्रकार में परिधीय इंसुलिन संकेतन 2 मधुमेह का एक विनाशकारी हानि से प्रतिरक्षा की मध्यस्थता टाइप 1 मधुमेह के परिणाम एक साथ hyperglycemia, dyslipidemia, और अंत में जो परिणाम में वृद्धि हुई यकृत ग्लूकोज उत्पादन को बढ़ावा देने, जबकि व्यक्तिगत β-3 कोशिकाओं से β सेल जन और इंसुलिन स्राव क्षमता की हानि. दोनों टाइप 1 और 2 मधुमेह की प्रगति में अंतर्निहित β सेल तंत्र को समझना उम्मीद है कि इन रोगों की रोकथाम और इलाज के लिए उपन्यास उपचार को जन्म देगा.
इन विट्रो ती मेंऐसे आईएनएस -1 और MIN6 रूप ssue संस्कृति मॉडल, β सेल लाइनों अमर विशिष्ट β सेल कार्यों को समझने के लिए उपयोगी उपकरण हो सकता है. हालांकि, आइलेट के भीतर विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत के लिए खुद को β सेल समारोह को विनियमित करते हैं. उदाहरण के लिए, ग्लूकागन की पैराक्राइन प्रभाव (α-कोशिकाओं से जारी) और इंसुलिन स्राव में वृद्धि और कम करने में सोमेटोस्टैटिन (δ कोशिकाओं से जारी), क्रमशः, अंत: स्रावी प्रतिक्रिया 4 में सेल सेल निकटता के महत्व को दर्शाता है. इसके अलावा, β-कोशिकाओं के बीच अंतराल जंक्शनों इंसुलिन 5 की रिहाई की शक्ति प्रदान. प्रगति बेहतर ग्लूकोज में अलग islets की शारीरिक प्रतिक्रिया दोहराया कि insulinoma लाइनों पैदा करने में किया गया है, हालांकि इसके अलावा, (उदाहरण के लिए, आईएनएस-1-व्युत्पन्न 832/13 और 832/3 सेल लाइनों), उनके ग्लूकोज जवाबदेही अभी भी सामान्य चूहे से अलग है 6,7 आइलेट्स. इसके अलावा, इन प्रतिरूप insulinoma सेल लाइनों की प्रतिक्रियाग्लूकागन की तरह पेप्टाइड 1 (जीएलपी -1) एगोनिस्ट के लिए एक दूसरे से नाटकीय रूप से भिन्न है, साथ ही सामान्य टापू 6 से कर सकते हैं. इसलिए, अमर सेल लाइनों एजेंट शिविर उत्पादन पर प्रभाव है कि परख करने की क्रिया के लिए सर्वश्रेष्ठ अभिनेत्री का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं.
Insulinoma व्युत्पन्न सेल लाइनों के विपरीत, पूरे पशु मॉडल में केवल β सेल समारोह का अध्ययन जटिलताओं का अपना सेट प्रदान करता है. अंत: स्रावी ऊतक के साथ काम करने में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक जारी हार्मोन की सटीक एकाग्रता को मापने है. विशेष रूप से, जिगर इंसुलिन metabolizing एक प्रमुख भूमिका निभाता है, और अग्न्याशय रक्त प्रवाह जिगर को सीधे जाता है. इस प्रकार, एक प्लाज्मा इंसुलिन माप सही अग्न्याशय में ही या इंसुलिन स्राव 8 की दर पर विभिन्न उपचार के प्रभाव से स्रावित जा रहा इंसुलिन की मात्रा को चित्रित नहीं हो सकता है. इसके अलावा, ग्लूकागन के गुर्दे चयापचय आइलेट α कोशिकाओं 9 से ग्लूकागन उत्पादन की विश्वसनीयता सीमित कर सकता है. इसलिए, इन विट्रो प्रयोग के लिए प्राथमिक माउस टापू अलग आइलेट विवो में किए गए माप के पूरक के लिए विशिष्ट उत्तेजनाओं का जवाब है कि कैसे एक और अधिक सटीक समझ प्रदान करता है.
माउस islets के अलगाव के लिए मौजूद प्रोटोकॉल (सफलता को बढ़ाने के लिए मदद मिल सकती है कि मामूली संशोधनों के साथ) समूहों की एक संख्या 10,11 द्वारा प्रयोग किया जाता एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल है. इसके अलावा, इस शिविर उत्पादन के निर्धारण β कोशिकाओं की Incretin जवाबदेही का एक सीधा पढ़ने के लिए बाहर के लिए अनुमति देता है. शिविर माप, प्रोटीन सामग्री और इंसुलिन स्राव के साथ संयोजन के रूप में भी β सेल समारोह में एक दोष शिविर 10 को समीपस्थ या बाहर का निहित है कि यह निर्धारित करने में मदद ही शिविर नमूना प्रस्तुत करने से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. इस प्रोटोकॉल में अंतिम शिविर सामग्री और इंसुलिन स्राव आवेदन दूसरे के बीच, दवा और आहार घटकों के प्रभाव को समझने के लिए एक बहुत शक्तिशाली उपकरण किया जा सकता हैएस, शिविर और इंसुलिन स्राव पर. अकेले ग्लूकोज से उत्तेजना के अलावा, अन्य यौगिकों शिविर और इंसुलिन स्राव 10,11 में बदलाव को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इंसुलिन हम अलग टापू, ऐसे ग्लूकागन और सोमेटोस्टैटिन के रूप में अन्य हार्मोन,, साथ ही साइटोकिन्स, eicosanoids, और चक्रीय adenosine monophosphate से परख प्राथमिक हार्मोन है, हालांकि अंत में, यह भी एक क्षणिक उत्तेजना परख द्वारा या की मात्रा का ठहराव के द्वारा या तो, मापा जा सकता है संस्कृति के माध्यम से 12 में अपने स्तर. अंत में, कई अन्य बहाव के अनुप्रयोगों जैसे आइलेट प्रत्यारोपण, पीसीआर या माइक्रोएरे विश्लेषण करती है मात्रात्मक वास्तविक समय के लिए शाही सेना अलगाव, प्रोटीन के रूप में, अपनाई जा सकता है, ताकि बाहर इस पांडुलिपि के दायरे से वर्णित collagenase अलगाव विधि के साथ आइलेट अलगाव आइलेट संरक्षण के लिए अनुमति देता है, हालांकि पश्चिमी सोख्ता, आइलेट embedding और Immunofluorescent इमेजिंग, और आइलेट सेल repli के एक उपाय के रूप में [3H] thymidine शामिल करने के लिए अलगावपिछले जौव लेख 13-16 में वर्णित किया गया है, जिनमें से कुछ केशन,. कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल में वर्णित आइलेट अलगाव प्रक्रिया के बाद चिकित्सा के विकास और β सेल समारोह को बढ़ाने के उद्देश्य से दवाओं की खोज को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण और उपयोगी जानकारी के साथ एक शोधकर्ता प्रदान कर सकता है.
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों सभी प्रासंगिक दिशा निर्देशों, नियमों और नियामक एजेंसियों के साथ अनुपालन में मार डाला गया. प्रदर्शन किया जा रहा प्रोटोकॉल मैडिसन विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के मार्गदर्शन और अनुमोदन के तहत किया गया था.
समाधान के 1. तैयारी
- इस प्रोटोकॉल में इच्छामृत्यु की विधि (चर्चा देखने के विकल्प की एक समीक्षा के लिए) Avertin संज्ञाहरण के तहत Exsanguination है. Avertin बनाने के लिये 20-30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और गर्मी में 2 मिथाइल-2-butanol के 1.25 मिलीलीटर के लिए 2-2-2 tribromoethanol की 0.625 ग्राम (1.25% या 44.2 मिमी) जोड़ें. पूरी तरह से 2-2-2 tribromoethanol भंग करने के लिए एक बार में 10-15 मिनट के लिए उच्च पर समाधान भंवर. एक बार पूरी तरह भंग, शांकव 50 मिलीलीटर लपेट, एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 0.45 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर, दोहरा आसुत एच 2 ओ के 48.75 मिलीलीटर का हल जोड़अप करने के लिए एक महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एल्यूमीनियम पन्नी और दुकान में अल ट्यूब. चूहों में इंजेक्शन लगाने से पहले आर टी के लिए ट्यूब लाओ.
- हैंक्स 'संतुलित नमक समाधान (HBSS) बनाने दोहरा आसुत एच 2 ओ में एक 10x शेयर (Gibco, जीवन टेक्नोलॉजीज, Carlsbad, CA) से 1 एल 1x HBSS श्रृंगार, 0.35 ग्राम (4.2 मिमी) नाचो 3, और दुकान जोड़ने के लिए अप करने के लिए 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर. प्रत्येक माउस के लिए, इस समाधान (प्लस त्रुटि pipetting के लिए अतिरिक्त 5-10 मिलीग्राम) के 105 मिलीलीटर आइलेट अलगाव के लिए आवश्यक हो जाएगा.
- आइलेट्स hypoxic क्षति के लिए बहुत जल्दी हो जाता है; इसलिए, HBSS रक्त में ओ 2 की सांद्रता नकल करने के लिए 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ bubbled है. विशेष गैस घोला जा सकता है खरीदा जा सकता है और उत्साह से भरा हुआ स्टेशन लचीला टयूबिंग से जुड़ी एक पाश्चर विंदुक के साथ स्थापित की. 15 मिनट के लिए 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ HBSS के लिए आवश्यक राशि बुदबुदाती के बाद, मात्रा द्वारा 0.02% रिया ग्रेड बीएसए (गोजातीय सीरम albumin) जोड़ सकते हैं और अनुसंधान के लिए बर्फ पर रखआइलेट अलगाव की emainder.
- Ficoll तैयारी के लिए, एक 400 मिलीलीटर बीकर में Ficoll के 32.5 ग्राम वजन HBSS के 80 मिलीलीटर जोड़ने, और 30 मिनट के लिए 500-700 rpm पर हलचल. एक बार भंग, सिलेंडर स्नातक की उपाधि प्राप्त एक 250 मिलीलीटर में Ficoll समाधान डालना और एक 25% Ficoll समाधान बनाने के लिए स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर पर 130 एमएल निशान को HBSS जोड़ें. Parafilm ® एम (Pechiney प्लास्टिक पैकेजिंग कंपनी, शिकागो, आईएल) के दो भागों के साथ स्नातक की उपाधि प्राप्त सिलेंडर के ऊपर कवर और सख्ती से कई बार हिला.
- 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के लिए, क्रमशः, 23%, 20.5%, और 11% Ficoll समाधान के लिए, 24.6 27.6 जोड़ने, और 25% Ficoll के 13.2 मिलीलीटर. फिर, HBSS के साथ 30 मिलीलीटर की कुल करने के लिए प्रत्येक समाधान लाने और मिश्रण को अच्छी तरह हिला. सभी चार Ficoll समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए अच्छा कर रहे हैं किया जाना चाहिए.
- सक्रिय टापू अलग करने के लिए उपयुक्त है कि collagenase समाधान क्लोस्ट्रीडियम से अलग collagenase से तैयार किया जाता है histolyticउम (सामग्री तालिका). प्रत्येक स्थल एंजाइम दक्षता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए. आमतौर पर, collagenase HBSS के मिलीलीटर प्रति 0.3-0.5 मिलीग्राम पर प्रयोग किया जाता है. कि सीमा (आमतौर पर 3 अलग सांद्रता) में एंजाइम सांद्रता का उपयोग, उम्र से मिलान चूहों या काम कर रहे एंजाइम एकाग्रता स्थापित करने के लिए littermates से अलग islets की गुणवत्ता और मात्रा का निर्धारण.
- सही एकाग्रता निर्धारित किया जाता है एक बार, प्रत्येक माउस पूरे अलगाव प्रोटोकॉल के लिए HBSS में collagenase की 35 मिलीलीटर की आवश्यकता है. भंग करने के लिए HBSS में collagenase भंवर. तुरंत सर्जरी से पहले, collagenase समाधान के साथ एक 5 मिलीलीटर सिरिंज पूर्व लोड पर प्रवेशनी जगह है और हवाई बुलबुले को दूर, और जब तक जरूरत बर्फ पर छोड़ दें.
- ओ / एन ऊष्मायन के लिए आइलेट संस्कृति मीडिया एक पूरक 1640 RPMI मीडिया है. शेयर समाधान के लिए, दोहरा आसुत एच 2 ओ के 1 एल में एक RPMI 1640 पैकेट (Gibco, न्यूयॉर्क) को भंग करने और 1.19 ग्राम HEPES (5 मिमी) और 2 जी नाचो 3 (24 मिमी) जोड़ें. 7.4 पीएच को समायोजित करें,अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ फ़िल्टर, और दुकान.
- पूरक मीडिया के लिए, शेयर 1640 RPMI मीडिया के लिए, क्रमशः, 10% FBS और 100 IU/100 माइक्रोग्राम / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ें. एक अलग ग्लूकोज एकाग्रता वांछित है, ग्लूकोज मुक्त RPMI 1640 मीडिया का इस्तेमाल किया जा सकता है और ग्लूकोज की एक विशिष्ट एकाग्रता जोड़ा जा सकता है.
- NaCl (118.41 मिमी), KCl (4.69 मिमी), 4 MgSO (1.18 मिमी), के.एच. 2 पीओ 4 (1.18 मिमी: एक शेयर क्रेब्स घंटी बिकारबोनिट बफर (क्रेब्स) के लिए निम्न सांद्रता में आसुत जल दोगुना करने के लिए निम्नलिखित सामग्री जोड़ ), नाचो 3 (25 मिमी), HEPES (5 मिमी), और 7.4 पीएच पर 2 CaCl (2.52 मिमी). 2 CaCl पिछले जोड़ा जाना चाहिए और इस समाधान करने के लिए 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- क्रेब्स, 0.5% रिया ग्रेड बीएसए के अलावा द्वारा पीछा 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पाश्चर विंदुक के साथ 10-15 मिनट के लिए 95% ओ 2/182 5% सीओ 2 के साथ पहले गैस का एक काम कर स्टॉक बनाने के लिएमात्रा से. अगला, ग्लूकोज में इन विट्रो परख के लिए वांछित एकाग्रता के लिए जोड़ा है.
उपकरण के 2. तैयारी
- थोड़ा 30 के सुझावों को कुंद - और 27 जी सुई तेज बिंदु बंद गोल करने के लिए एक sharpening पत्थर का उपयोग कर. सरौता की एक जोड़ी का उपयोग टिप से एक इंच का एक चौथाई के बारे में सुई में एक 45 डिग्री के मोड़ रखो. सुई का आंतरिक व्यास बंद बंद हो जाएगा, जो भी मुश्किल निचोड़ के प्रति सावधान रहें.
- लगभग 4 इंच लंबाई, प्रत्येक माउस के लिए एक में 3/0 रेशम सीवन धागे काटें.
- नीचे प्लास्टिक की चादर और टेप के साथ विदारक माइक्रोस्कोप बेस कवर.
- माउस के अनुसार कम से कम 2 के लिए शोषक बेंच कागज, आकार में लगभग 3 एक्स 5 इंच, के कई टुकड़े काटें.
3. माउस की तैयारी
- 1 मिलीलीटर Avertin के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज भरें.
- शरीर के वजन के बारे में 40 μl / ग्राम पर intraperitoneally Avertin समाधान इंजेक्षन.
- माउस नहीं एल के बादonger ध्यान से विदारक माइक्रोस्कोप काम स्टेशन को हस्तांतरण, पूंछ या हिंद पैर चुटकी का जवाब.
- लापरवाह स्थिति में माउस और अपने सिर distally का सामना करना पड़ के साथ, 70% जलीय इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे. उजागर वक्ष गुहा में फर की राशि की सीमा को 70% इथेनॉल की एक पर्याप्त राशि का उपयोग सुनिश्चित करें.
4. वक्ष गुहा खुलने
- दो पिछले पैरों के बीच माउस के फर और त्वचा चुटकी और epidermis, dermis और अंतर्निहित झिल्ली के माध्यम से एक प्रारंभिक कटौती करते हैं.
- अभी भी त्वचा और अंतर्निहित झिल्ली बन्द रखो, यह माउस किसी भी आंतरिक अंगों को काटने से बचने के ख्याल रखने के दोनों किनारों पर सामने अंग की ओर काटा.
- Ribcage पर त्वचा और झिल्ली फ्लैप मोड़ो और मुद्रास्फीति के लिए अग्न्याशय के लिए आसान पहुँच अनुमति देने के लिए असिरूप प्रक्रिया हटा दें.
- सिर proximally का सामना करना पड़ के साथ माउस को नई दिशा और काम के दाहिने हाथ की ओर सेंट की ओर आंतरिक अंगों को स्थानांतरितउतरते महाधमनी प्रकट करने के लिए समझना.
- रक्त ऊतक एकत्र किया जा रहा है, जब तक उतरते महाधमनी euthanization पूरा करने के लिए काटा जा सकता है. आम पित्त नली के लिए आसान पहुँच के लिए बेंच कागज या एक Kimwipe के साथ अतिरिक्त रक्त सोख.
5. अग्न्याशय बढ़ाना
- आम पित्त नली माउस के सिर के साथ एक सीधा लाइन रूपों एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ, छोटी आंत रखते हैं.
- एक संदंश लो और छोटी आंत समझ और गुलाबी आंत पर एक सफेद त्रिकोण बनाने, पित्त नली से छोटी आंत पर बाहर splays जो आम पित्त नली के अंत में Oddi की दबानेवाला यंत्र (कलसा के Sphincter) लगता है. Oddi की दबानेवाला यंत्र स्थित हो जाने के बाद एक # 5 Dumont संदंश लेने के लिए और संभव के रूप में छोटी आंत के करीब आम पित्त नली के नीचे टिप स्लाइड, वाहिनी बेध नहीं सावधान किया जा रहा है.
- छोटी आंत और संयोजी ऊतक के माध्यम से छेदने के बाद, उपयोगड्यूमॉन्ट की नोक सिवनी समझ और आम पित्त नली के तहत यह पुल संदंश. गाँठ रिसाव को रोकने के लिए तना हुआ है, सुनिश्चित करने के लिए संभव के रूप Oddi की दबानेवाला यंत्र के करीब आम पित्त नली बंद टाई.
- सिवनी के दोनों सिरों समझ और आम पित्त नली पर कुछ तनाव डाल करने के लिए पूंछ की ओर खींचो. एक मुक्त हाथ का उपयोग करना, बस जिगर में पिछले विभाजन ऊपर आम पित्त नली में सूक्ष्म कैंची के साथ एक छोटा सा चीरा बनाते हैं. नोट: यह इस अग्न्याशय का आंशिक मुद्रास्फीति में परिणाम सकता है के रूप में Oddi की दबानेवाला यंत्र को भी बंद कटौती और यह भी एक गरीब मुद्रास्फीति में परिणाम होगा के रूप में आम पित्त नली के माध्यम से काटने से बचने नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है.
- तना हुआ आम पित्त नली के साथ तार के दोनों सिरों को धारण करते हुए, सिरिंज सेट नीचे बर्फ बाल्टी से 5 एमएल collagenase समाधान के साथ पहले से लोड किया गया है कि सिरिंज / प्रवेशनी, हटाने, और कटौती में पा लिया 30 ग्राम सुई डालने आम पित्त नली, सावधान किया जा रहा वा के माध्यम से बेध नहींवाहिनी के करूँगा. 30 ग्राम सुई के चारों ओर एक मुहर के रूप में पित्त नली के लिए विस्तृत पर्याप्त नहीं है, तो इसे हटा दें और पा लिया 27 जी सुई के साथ बदलें.
- जगह में सुई पकड़े, सिवनी जारी है और 5 एमएल सिरिंज उठा. धीरे धीरे सिरिंज के सवार दबाना. नोट: सुई सफलतापूर्वक आम पित्त नली में डाला गया है, तो यह विस्तार होगा.
- अग्न्याशय का पहला हिस्सा कोमल लगातार दबाव के द्वारा पीछा किया, फुलाते तक धीरे धीरे और एक काँपने के गुणवाला फैशन में बंद दे सवार दबाना पर जारी अग्न्याशय अब फुलाते तक. नोट: अधिकांश pancreases रिसाव शुरू करने से पहले 3-5 मिलीलीटर पकड़. इसके अलावा, एक सफल मुद्रास्फीति बहि ऊतक का भी वितरण किया जाएगा और पेट के ऊपर अग्न्याशय का हिस्सा फुलाया किया जाएगा.
- आम पित्त नली से सुई निकालें और टीम के लिए निर्धारित किया है.
6. अग्न्याशय निकालना
- एक हाथ और एक घुमावदार कैंची में में एक संदंश ले लोअन्य. संदंश का प्रयोग, Oddi की दबानेवाला यंत्र में छोटी आंत समझ. कैंची बंद के साथ, छोटी आंत से अग्न्याशय के अलग हिस्से को टिप का उपयोग करें.
- छोटी आंत और अग्न्याशय के बीच की खाई को चौड़ा करने के अलावा कैंची बिखरा हुआ है.
- छोटी आंत और अग्न्याशय सिर्फ बनाया गया था कि अंतर के दाहिने हाथ पक्ष में एक दूसरे को देते हैं जहां कैंची का "वी" रखें. संदंश का प्रयोग धीरे अग्न्याशय दूर करने के लिए कैंची अतीत छोटी आंत खींच.
- गुलाबी संयोजी ऊतक को छोटी आंत नीचे काम कर रखना. इस बिंदु पर, यह पेट के लिए देता है, जहां के पास छोटी आंत उठाओ और दूर छोटी आंत के बाकी हिस्सों से अग्न्याशय धज्जी. नोट: यह खंडन करने के लिए शुरू हो सकता है के रूप में अग्न्याशय कटाव को नहीं ख्याल रखना.
- धीरे संदंश (फ्लैट संदंश सबसे अच्छा काम करते हैं) के साथ पेट से जुड़ी अग्न्याशय का हिस्सा हड़पने. अग्न्याशय पर धीरे खींच जबकि, वक्र का उपयोगडी कैंची अग्न्याशय और पेट के बीच कनेक्शन को दूर कटाव को.
- तिल्ली जानें और अग्न्याशय ऊपर संदंश के साथ इसे पकड़. घुमावदार कैंची ले लो और प्लीहा और अग्न्याशय के बीच कनेक्शन दूर कटौती.
- अग्न्याशय बड़ी आंत से जुड़ा हुआ है, जहां पता लगाएं. संदंश के साथ बड़ी आंत उठाओ और के माध्यम से प्रहार करने के लिए कैंची की नोक का उपयोग करें. बड़ी आंत और अग्न्याशय के बीच एक खाई उत्पन्न करने के लिए पहले के रूप में अलग कैंची बिखरा हुआ है.
- संदंश के साथ बड़ी आंत को पकड़ो: इस अग्न्याशय बड़ी आंत को इसकी सटीक कनेक्शन उजागर दूर गिरने का परिणाम देगा. शेष कनेक्शन दूर कटाव.
- अग्न्याशय और छोटी आंत से जुड़ी गुलाबी संयोजी ऊतक का पता और संभव के रूप में अग्न्याशय के करीब के रूप में कटौती. नोट: अग्न्याशय भेदी एक चिंता का विषय है, यह संयोजी ऊतक बाद के चरणों में बाहर फिल्टर किया जायेगा रूप में छोटी आंत के करीब कटौती करने की सलाह दी है.
- जीके रूप में संभव के रूप में अग्न्याशय की ज्यादा और रब धीरे इसे उठा. घुमावदार कैंची के साथ, पूरी तरह से अग्न्याशय को दूर करने के लिए अग्न्याशय और वक्ष गुहा के बीच शेष कनेक्शन दूर कटौती. नोट: सही ढंग से अगर हटा दिया अग्न्याशय अभी फुलाया किया जाना चाहिए.
- अन्य सभी pancreases फुलाया और प्रयोग के लिए हटा दिया गया है जब तक बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में collagenase समाधान की ~ 2.5 मिलीलीटर में हटा अग्न्याशय स्टोर.
7. धुलाई
- सभी अलग pancreases ले लो और एक ताजा collagenase समाधान के 25 मिलीलीटर युक्त 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों को अलग करने के लिए उन्हें स्थानांतरित
- एक प्रकार के बरतन के साथ, 220-250 rpm पर oscillating में सक्षम नहाने के पानी मिलाते हुए एक 37 डिग्री सेल्सियस में ईमानदार 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों प्लेस बंद कर दिया.
- 95% 2 हे / 5 पाश्चर विंदुक के साथ 5 मिनट के लिए% सीओ 2 के साथ प्रत्येक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब गैस.
- कसकर एक ट्यूब हालात और मिलाते हुए पानी में बग़ल में जगहपानी की सतह के नीचे स्नान. अप करने के लिए 16 मिनट मिनट 6 पर शुरू, 20 सेकंड के लिए 220-250 RPM, हर दूसरे मिनट पर हिला. (,, 10, 6, 14 12 8 शेक, और 16 मिनट)
- तुरंत एक त्वरित स्पिन के लिए कमरे के तापमान पर एक अपकेंद्रित्र ट्यूबों स्थानांतरण. 1,500 आरपीएम (400-500 ग्राम) के लिए अपकेंद्रित्र लाने और तुरंत बंद कर दें.
- एक निर्वात जाल, महाप्राण गोली परेशान बिना collagenase समाधान के बारे में 22.5 मिलीलीटर का उपयोग करना. गोली तोड़ने के लिए धीरे 10 मिलीलीटर HBSS और भंवर के साथ धोएं.
- 1,500 आरपीएम (400-500 ग्राम) तक कमरे के तापमान पर एक और त्वरित स्पिन प्रदर्शन करना.
- फिर गोली परेशान बिना समाधान के महाप्राण के बारे में 10 मिलीलीटर,.
- धीरे एक बार फिर से गोली को तोड़ने के लिए एक और 10 बर्फ के ठंडे HBSS के मिलीग्राम और भंवर के साथ धोएं. समाधान के त्वरित स्पिन और महाप्राण 10 मिलीलीटर दोहराएं.
- धीरे HBSS के समाधान के शेष 2.5 मिलीलीटर में गोली भंवर. के माध्यम से समाधान डालोएक 1000 माइक्रोन एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जाल. इस collagenase से पचा नहीं बड़े ऊतक मलबे को हटा देगा.
- बर्फ के ठंडे HBSS के 2.5 मिलीलीटर के साथ पुराने 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब कुल्ला. अच्छी तरह से नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जाल के माध्यम से HBSS के 2.5 मिलीलीटर स्थानांतरित करने से पहले ट्यूब के पक्ष कुल्ला करने के लिए एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करें.
- ऊतक गोली 1,500 आरपीएम (400-500 ग्राम) में कमरे के तापमान पर एक और त्वरित स्पिन प्रदर्शन करना.
- वैक्यूम जाल की ओर ट्यूब झुकने से HBSS के सभी aspirate. नोट: यह इस टापू का नुकसान होगा के रूप में गोली परेशान नहीं करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है. गोली ढीला है या वैक्यूम जाल की ओर ले जाने के लिए शुरू होता है, तो समाधान aspirating बंद करो और ऊतकों को फिर से गोली और फिर शेष समाधान निकालना जारी है.
- एक बार HBSS के सभी हटा दिया गया है, गोली को तोड़ने के लिए 25% Ficoll समाधान और भंवर के 4.8 मिलीलीटर जोड़ें.
- ध्यान से 2 की 2.4 मिलीलीटर परत50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब की ओर करने के लिए 23% Ficoll समाधान जोड़कर 25% Ficoll समाधान के शीर्ष पर 3% Ficoll समाधान. Ficoll समाधान जोड़ने जब भी लेयरिंग सुनिश्चित करने के लिए, 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब बारी बारी से.
- 20.5% के लिए layering प्रक्रिया को दोहराएँ और फिर 11% Ficoll समाधान. नोट: 4 अलग परतों मौजूद नहीं हैं, तो 50 मिलीलीटर निशान से ऊपर HBSS जोड़ने और Ficoll ढाल अब मौजूद नहीं है 4-6 बार या जब तक ट्यूब पलटना. ऊतक पुनः गोली और कदम 7.14-7.16 पुनः प्रयास करें.
- 15 मिनट के लिए 1,820 आरपीएम (800 ग्राम) में आरटी पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब स्पिन.
- पीछे बहि ऊतक की गोली छोड़, देखभाल करने के लिए एक ताजा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में Ficoll के सभी डालो. 50 मिलीलीटर निशान से ऊपर बर्फ ठंड HBSS जोड़ें और एक साथ Ficoll और HBSS मिश्रण करने के लिए ट्यूब 4-6 बार पलटना.
- 5 मिनट के लिए 1,820 आरपीएम (800 ग्राम) में आरटी पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब स्पिन.
- ध्यान से एक निर्वात टीआरए का उपयोग HBSS / Ficoll मिश्रण का सबसे महाप्राणपी. यह ढीला है और आसानी से aspirated जा सकता है के रूप में गोली परेशान मत करो.
- एक पाश्चर पिपेट ले लो और एक डिस्पोजेबल संस्कृति ट्यूब को गोली हस्तांतरण.
8. आइलेट्स उठा
- डिस्पोजेबल संस्कृति ट्यूब को उठा मीडिया के 5 एमएल (यानी. पूरक RPMI 1640 या क्रेब्स घंटी बिकारबोनिट बफर) जोड़ें. नोट: उठा मीडिया बहाव के अनुप्रयोगों के आधार पर अलग अलग होंगे.
- टापू 5 मिनट के लिए संस्कृति ट्यूब के नीचे के लिए व्यवस्थित करते हैं. 60 मिमी polystyrene पेट्री डिश से एक पाश्चर पिपेट एक 15 मिमी के लिए प्रयोग कर उन्हें स्थानांतरण. नोट: यह इन इलाज नहीं कर रहे हैं के रूप में एक पेट्री डिश का उपयोग करने के लिए और पकवान का पालन करने से टापू रोकने जाएगा महत्वपूर्ण है.
- (; फिल्टर निष्फल 100 मिलीलीटर 1640 RPMI स्टॉक मीडिया, 10 मिलीलीटर गर्मी निष्क्रिय FBS, 1 मिलीलीटर पेन / Strep) 60 मिमी polystyrene पेट्री डिश से एक अलग 15 मिमी, 5 माउस आइलेट संस्कृति मीडिया की मिलीलीटर जोड़ें.
- Backlig साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप की सहायता के साथएचटी क्षमता, कोष्ठकी ऊतक मलबे को स्थानांतरित करने से बचने के लिए, देखभाल आइलेट संस्कृति मीडिया वाले पेट्री डिश में टापू लेने के लिए एक पी 20 पिपेट का उपयोग करें. जब बैकलिट कोष्ठकी ऊतक प्रकाश ग्रे और सुस्त दिखाई देगा, जबकि टापू, भूरा, सोना और उनके बाहरी झिल्ली चमकना सकता दिखाई देगा. आइलेट तैयारी मलबे की एक बड़ी मात्रा में होता है, तो यह ताजा मध्यम में दो बार टापू हाथ से लेने की सलाह दी जाती है. मलबे संदूषण को कम करना एक रात ऊष्मायन के बाद आइलेट clumping को सीमित कर देगा. पाचन बफर करने DNase (3000 यू / एमएल) जोड़ना भी आइलेट clumping (JWJ, व्यक्तिगत अवलोकन) सीमित करने के लिए मदद मिल सकती है. नोट: यह नीचे की ओर प्रयोगों के लिए योजना के लिए अलग टापू की संख्या गिनने के लिए महत्वपूर्ण है.
- 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस के लिए एक मशीन सेट में टापू हे / एन सेते हैं.
9. शिविर परख
- 1.7 मिलीलीटर microfuge ट्यूबों, परख में से प्रत्येक को दोहराने के लिए एक लेबल. नोट: शिविर assays कम से कम du होनी चाहिएप्रत्येक उपचार हालत के लिए plicates, लेकिन इलाज के प्रति अधिक replicates पसंद कर रहे हैं.
- पाश्चर विंदुक के साथ 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ 15 मिनट के लिए क्रेब्स घंटी बिकारबोनिट बफर बक के बाद 0.5% रिया ग्रेड बीएसए और 1.7 मिमी (preincubation समाधान) के अंतिम ग्लूकोज एकाग्रता जोड़ें. फिर, एक microfuge ट्यूब के लिए हौसले से मार डाला क्रेब्स के 1 मिलीलीटर जोड़ें. क्रेब्स के दो एमएल पूर्व ऊष्मायन और उपचार समय अंक के लिए ट्यूब प्रति आवश्यक है; हालांकि यह अतिरिक्त कम से कम 5-10 मिलीग्राम तैयार करने के लिए सिफारिश की है.
- पेट्री डिश के बीच करने के टापू भंवर, और एक पी 20 पिपेट का उपयोग, ग्लूकोज युक्त मध्यम संस्कृति धोने के लिए preincubation समाधान के 5 मिलीलीटर युक्त 60 मिमी polystyrene पेट्री डिश से एक नया 15 मिमी टापू हाथ उठाओ टापू से.
- इस्तेमाल किया शिविर परख किट जीई हेल्थकेयर शिविर सीधी BioTrak ईआईए है. इस्तेमाल किया prococol "Intracellular शिविर Meas के लिए वर्णित है कि एक संशोधन है, उपन्यास सेल अभिकर्मकों के साथ गैर एसिटिलीकरण ईआईए प्रक्रिया का उपयोग "और urement उपचार की स्थिति और तकनीकी replicates की बढ़ी संख्या की अनुमति, ट्यूब प्रति टापू की न्यूनतम संख्या के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है. 1 एमएल पूर्व ऊष्मायन बफर के साथ ट्यूब के बीच आइलेट आकार स्थिरता बनाए रखने, कदम 9.2 से प्रत्येक ट्यूब में एक पी 20 पिपेट, स्थानांतरण कम से कम 13 टापू का उपयोग करना. नोट: replicates की संख्या बढ़ाने ट्यूब प्रति टापू की संख्या से ज्यादा फायदेमंद है. समान रूप से ट्यूब प्रति टापू की संख्या को बढ़ाने के लिए पर्याप्त टापू कर रहे हैं हालांकि, अगर यह ट्यूब प्रति 25-50 टापू अप करने के लिए ऐसा करने के लिए सलाह दी जाती है.
- Microfuge ट्यूब टोपी के साथ खुला, 5% सीओ 2 पर सेट एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर करने के लिए स्थानांतरण और 45 मिनट एक आधारभूत स्तर तक सभी islets के लिए इंसुलिन स्राव को सामान्य करने के लिए सेते हैं.
- नमूने incubating रहे हैं, मार डाला क्रेब्स fr में उपचार (यानी 8 मिमी, 11.1 मिमी, 16.7 मिमी ग्लूकोज, आदि) तैयारओम 9.2 कदम. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में, किसी भी pipetting त्रुटि के लिए खाते में करने के लिए अतिरिक्त 1 मिलीलीटर के साथ. 200 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए 3 Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) जोड़ें. IBMX ब्लॉक कि यह उत्पादन किया है के रूप में शिविर सेल में जमा करने के लिए अनुमति शिविर की गिरावट, एक सामान्य फॉस्फोडाइस्टरेज़ अवरोध करनेवाला है. (नोट:.. यह एक सच्ची शिविर उत्पादन परख है मापने शिविर उत्पादन वांछनीय नहीं हो सकता है जब उदाहरण के लिए चर्चा अनुभाग देखें IBMX परख के बाहर छोड़ दिया जाता है, तो अधिक टापू में शिविर डेटा प्राप्त करने के लिए ट्यूब प्रति की आवश्यकता होगी मानक वक्र के रैखिक सीमा).
- 45 मिनट पूर्व ऊष्मायन के बाद, मशीन, टोपी और नाड़ी भंवर प्रत्येक नमूना (कम से कम 0.5 सेकंड) से microfuge ट्यूबों को हटा दें. इस संभावना के कारण ट्यूब के नीचे में केंद्रित किया जा रहा टापू को उत्पन्न किया गया है कि इंसुलिन ढाल मिश्रण करने के लिए है. छाया: यह नकारात्मक आइलेट स्थिरता (नोट पर प्रभाव पड़ सकता रूप में देखभाल, भी कठोरता भंवर नहीं लिया जाना चाहिएटापू के साथ ट्यूबों धीरे flicked या यह धीरे भंवर नाड़ी के लिए संभव नहीं है, तो उलटा हो सकता है. इन विकल्पों के प्रयोग की योजना बनाते समय विचार किया जाना चाहिए जो परख,) करने के लिए समय बढ़ जाएगा.
- टापू 10,000 आरपीएम (7,000-7500 G) तक पहुँचने और फिर तुरंत बंद कर देते हैं जब तक एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र (आरटी) और स्पिन करने के लिए प्रत्येक ट्यूब स्थानांतरण.
- आइलेट गोली पर क्रेब्स के लगभग 10-15 μl छोड़ने, प्रत्येक microfuge ट्यूब में क्रेब्स के सबसे दूर करने के लिए एक पी -1000 पिपेट का प्रयोग करें. निकटतम आइलेट गोली हिस्से को निकालने के लिए एक पी 20 पिपेट का प्रयोग करें. गोली परेशान है, वापस ट्यूब और फिर से स्पिन में क्रेब्स पिपेट.
(नोट: प्रयोगकर्ता यह बहुत मुश्किल है कि यह बिना परेशान आइलेट गोली से क्रेब्स के सभी हटाने के लिए मिलता है, तो पिछले 10-15 μl पर छोड़ दिया और बाद में प्रोटोकॉल में कुल मात्रा में के लिए जिम्मेदार हो सकता है. - ऊष्मायन के बाद नमूने फ्रीज तस्वीर करने के लिए एक अछूता कंटेनर में तरल नाइट्रोजन का एक पर्याप्त राशि प्राप्त करते हैं.
- इनक्यूबेटर से बाहर नमूने ले लो, टोपी, भंवर जल्दी (कम से कम 0.5 सेकंड) 10,000 आरपीएम (7,000-7500 जी), अप करने के लिए एक तालिका के शीर्ष अपकेंद्रित्र (आरटी) में microfuge ट्यूबों स्पिन और फिर तुरंत बंद. इंसुलिन या अन्य metabolite एक वांछित बहाव के आवेदन है, तो आगे के विश्लेषण तक -20 डिग्री सेल्सियस पर एक microfuge ट्यूब और दुकान में मध्यम के एक विभाज्य इकट्ठा करने के लिए एक पी -1000 पिपेट का उपयोग करें. उत्तेजना मीडिया एकत्र नहीं किया जा रहा है, तो इसे खारिज किया जा सकता है.
(नोट: IBMX ग्लूकोज उत्तेजित इंसुलिन स्राव (GSIS के एक मजबूत potentiator है) इसलिए, शिविर उत्तेजना मध्यम से प्राप्त GSIS परिणाम सही GSIS पर विशिष्ट उपचार का असली प्रभाव का प्रतिनिधित्व नहीं हो सकता है, इन प्रभावों सूक्ष्म होते हैं, खासकर अगर.). - आइलेट गोली परेशान बिना संभव के रूप में ज्यादा उत्तेजना मध्यम हटाने के लिए कदम 9.9 दोहराएँ. क्रेब्स के कम से कम 10-15 μl आइलेट गोली पर छोड़ दिया है एक बार स्नैप तरल नाइट्रोजन में आइलेट गोली फ्रीज. एक बार सभीनमूने तस्वीर शिविर माप तक -80 डिग्री सेल्सियस, दुकान जमे हुए किया गया है.
- शिविर दृढ़ संकल्प का दिन, 'निर्माताओं प्रोटोकॉल के अनुसार उपन्यास सेल अभिकर्मकों तैयार करते हैं. 30 सेकंड के लिए शीर्ष गति से प्रत्येक microfuge ट्यूब और भंवर को 200 मिलीलीटर lysis अभिकर्मक 1 बी जोड़ें. ट्यूबों 30 सेकंड के लिए हर 2 मिनट vortexing, 10 मिनट के लिए बर्फ पर बैठते हैं. (नोट: प्रोटोकॉल सेल सुनिश्चित करने के लिए trypan नीले रंग के साथ एक सूक्ष्म विश्लेषण से बाहर ले जाने की सिफारिश की है, लेकिन इस टापू के लिए नहीं किया जाता है).
- काम कर मानकों को तैयार है और निर्माता प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में बिल्कुल ईआईए microplate की स्थापना की. एंजाइम सब्सट्रेट 30 मिनट के लिए microplate साथ incubated किया गया है, वैकल्पिक 1.0 एम सल्फ्यूरिक एसिड कदम प्रदर्शन, और एक microplate रीडर का उपयोग कर 450 एनएम पर microplate कुओं के absorbance निर्धारित करते हैं.
- चक्रीय एएमपी परिणाम fmol / अच्छी तरह के रूप में दर्ज किया जाएगा. इस कुल मूल नमूना की मात्रा (200 μl + किसी के लिए सामान्यीकृत किया जाना चाहिएअवशिष्ट क्रेब्स) कदम 9.9 से टापू पर छोड़ दिया है. अगला, परिणाम या तो fmol शिविर / आइलेट उत्पादित, या lysate नमूने (fmol / ग्राम प्रोटीन देने) कुल सेलुलर प्रोटीन के लिए परिणाम मानक के अनुसार bicinchoninic एसिड (बीसीए) प्रोटीन परख के अधीन किया जा सकता है, दे रही टापू की कुल संख्या के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है . उत्तरार्द्ध आइलेट आकार नमूनों के बीच असंगत हैं जब सिफारिश की है, और आइलेट आकार के लिए एक किराए की हो सकती है. पियर्स बीसीए प्रोटीन परख किट इस प्रोटोकॉल में सफलता के साथ प्रयोग किया, और नमूना की केवल 25 मिलीग्राम की आवश्यकता किया गया है. बीएसए मानकों शिविर परख किट से सेल अभिकर्मक 1 बी में तैयार किया जाना चाहिए.
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Representative Results
अलगाव के दौरान एक उच्च आइलेट उपज सुनिश्चित करने के लिए प्रोटोकॉल में उल्लिखित शल्य चिकित्सा तकनीक को बारीकी से पालन किया जाना चाहिए. यहाँ प्रस्तुत तकनीक प्रत्येक प्रयोगशाला के अनुरूप हो जाएगा हालांकि, एक सफल अलगाव को बढ़ावा मिलेगा कि कुछ महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं. आम पित्त नली आसानी से सुलभ बनाने के क्रम में, यह अंगों माउस के दाहिने हिस्से (चित्रा 1) को विस्थापित किया जा सिफारिश की है. इसके अलावा, यह कम वजन सीमित विस्तार हो जाएगा के बाद से अग्न्याशय प्रतिरोध की एक छोटी राशि के साथ बढ़ के लिए अनुमति देगा. आइलेट उपज को अधिकतम करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम Oddi की दबानेवाला यंत्र (आंकड़े 2A सी) के करीब आम पित्त नली के बंधाव है. आगे दूर Oddi की दबानेवाला यंत्र से ligating प्रमुख अग्नाशय वाहिनी में प्रवेश collagenase समाधान की राशि को कम करने से एक आंशिक मुद्रास्फीति में हो सकता है. इसके अलावा, एक तना हुआ गाँठ आंत में प्रवेश करने से collagenase समाधान नहीं कर पाएगा.
<पी वर्ग = "jove_content"> आम पित्त नली में एक उचित चीरा काफी दूर तक जिगर, लेकिन अधिक से अधिक अग्नाशय मुद्रास्फीति के लिए काफी करीब (चित्रा 3) से विभाजन से स्थित होना चाहिए. बंटवारे को भी बंद कर दिया एक चीरा जिगर में collagenase समाधान के प्रवाह को जन्म दे सकती है. Collagenase समाधान जिगर में प्रवेश करती है, वह अपने काले लाल रंग खो और सफेद बारी करने के लिए शुरू हो जाएगा. यदि ऐसा होता है, सुई को हटाने और जिगर से आगे एक और केन्युलेशन कोशिश. साथ ही, आम पित्त नली चीरा केवल वाहिनी (लगभग 50%) के माध्यम से भाग रास्ता होना चाहिए. पूरी तरह वाहिनी कर्तन यह मुश्किल सुई की नोक के आसपास वाहिनी सील करने के लिए कर देगा. एक उचित चीरा आम पित्त और अग्नाशय नलिकाएं (चित्रा -4 ए) को भरने के लिए दोनों काफी दबाव के उत्पादन, सुई के आसपास वाहिनी का पूरा बंद का परिणाम देगा. यह सुई आम पित्त नली और नहीं आसपास के म्यान में प्रवेश किया है यह सुनिश्चित करने के लिए भी महत्वपूर्ण है.सुई ठीक से डाला गया है, collagenase समाधान के 5 मिलीलीटर एक marbleized ऊतक बनाने, अग्न्याशय भरना चाहिए.अग्न्याशय निकालने की प्रक्रिया को अधिक से अधिक आइलेट उपज (चित्रा 5) को बढ़ावा देने के नाजुक प्रदर्शन किया जाना चाहिए. अग्न्याशय भेदी आइलेट उपज को कम करने, collagenase समाधान की एक संकुचन और नुकसान हो सकता है. संयोजी ऊतक और अन्य अंगों के करीब अग्न्याशय काटना अपस्फीति को रोकने जाएगा. यह बाद के चरणों में हटा दिया जाएगा इसके अलावा, अग्न्याशय के साथ इस तरह के संयोजी ऊतक के रूप में कटाई अन्य ऊतक,,, एक मुद्दा नहीं है. एक ठीक से हटाया अग्न्याशय से पहले आगे collagenase पाचन को छांटना (चित्रा 6) के बाद फुलाया रहेगा.
Ficoll ढाल में अलग परतों एक स्वच्छ आइलेट तैयारी के लिए नेतृत्व और टापू (चित्रा 7) चुनने के लिए एक आसान वातावरण पैदा करेगा. ढाल से टापू की जुदाई सुनिश्चित करता हैपाचन और जाल स्क्रीन छानने के बाद बनी हुई है कि सेल मलबे और संयोजी ऊतक. इसके अलावा, इस कदम बहाव के अनुप्रयोगों के लिए स्वच्छ, स्वस्थ टापू के चयन के लिए महत्वपूर्ण है. विशेष रूप से, स्वस्थ टापू आकार में गोलाकार हो और गहरे भूरे रंग के केंद्र के लिए एक सुनहरा भूरा (8 चित्रा) होगा. नोट: मधुमेह चूहों से आइलेट्स की कमी हुई इंसुलिन सामग्री के साथ इसी रंग में ज्यादा पीला हो जाएगा, और उनके आकार, चमक, और केशिकाओं की उनकी दिखाई नेटवर्क द्वारा कोष्ठकी ऊतक से बेहतर प्रतिष्ठित किया जा सकता है. कोष्ठकी ऊतक से जुड़ा कोई टापू नहीं किया जाना चाहिए और त्याग किया जाना चाहिए. वे ठीक ढंग से काम नहीं करते हैं इसके अलावा, एक रात ऊष्मायन के बाद एक काले, परिगलित केंद्र विकसित कि बड़ा टापू खारिज किया जाना चाहिए.
शुरूआत में वर्णित है, शिविर उत्पादन β सेल समारोह का एक महत्वपूर्ण घटक है; विशेष रूप से, Incretin कार्रवाई करने के साथ संबंध है. इस में वर्णित प्रोटोकॉल के लिए एक लाभ मिले विभागाध्यक्ष एक साथ शिविर उत्पादन और ग्लूकोज उत्तेजित इंसुलिन स्राव डेटा प्राप्त कर सकते हैं. आमतौर पर, शिविर उत्पादन पर एक एजेंट का प्रभाव सीधे इंसुलिन स्राव 17 पर इसके प्रभाव के साथ संबद्ध करता है. सरल प्रयोगों के लिए, इस नियम (एक उदाहरण के लिए 9 चित्र देखें) काफी अच्छी तरह से सच है. वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम शिविर का कुल उत्पादन दे रही है, शिविर का अपचय को रोकने के लिए हमारे उपचार में IBMX (एक phosphodiesterase अवरोध करनेवाला) का उपयोग करें.
चित्रा 1. आंतरिक अंगों विस्थापित. माउस के दाहिने हिस्से को आंतरिक अंगों पोजिशनिंग एक आसान काम के माहौल बनाता है और अग्न्याशय कमरे मुद्रास्फीति के दौरान विस्तार करने की अनुमति देता है.
चित्रा 2 "के लिए: सामग्री चौड़ाई =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2.jpg "/>" src = के लिए "5in
चित्रा 2. Oddi की दबानेवाला यंत्र (एसी) बंद बांधने. यहाँ दर्शाया Oddi की दबानेवाला यंत्र में छोटी आंत को आम पित्त नली का प्रवेश द्वार है. Oddi की दबानेवाला यंत्र में आम पित्त नली बंद बांधने आंतों में प्रवेश करने से collagenase समाधान रोकता है.
चित्रा 3. आम पित्त नली चीरा. यह जिगर में collagenase समाधान के प्रवाह को रोकने के लिए जिगर में विभाजन करने के लिए थोड़ा बाहर का आम पित्त नली में कटौती करने के लिए सबसे अच्छा है.
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चित्रा 4. एक पा 30 ग्राम सुई और अग्न्याशय मुद्रास्फीति से आम पित्त नली का cannulation. ए) 30 ग्राम सुई सुई की नोक के चारों ओर एक मुहर बनाने, आम पित्त नली में डाला जाता है. इसे रोकने के लिए और सुई आम पित्त नली और आसपास म्यान नहीं में डाला गया है नोट करना महत्वपूर्ण है. एक ठीक से डाला सुई एक अपारदर्शी उपस्थिति होगा. बी) एक उचित अग्न्याशय मुद्रास्फीति के बारे में 3-5 मिलीग्राम collagenase समाधान के साथ भरने के लिए और एक मरमर उपस्थिति होगा.
अग्न्याशय का चित्रा 5. हटाने. ए) कैंची की एक घुमावदार जोड़ी के साथ किए गए प्रारंभिक चीरा Oddi की दबानेवाला यंत्र के पास होता है. प्रारंभिक रेमअंडाकार पेट अंतिम चरण छोटी आंत और peritoneal गुहा को पिछले कुछ कनेक्शन पर संयोजी ऊतक से अग्न्याशय दूर है) अग्न्याशय. बी पंचर नहीं सावधान किया जा रहा है की दिशा में शुरू होता है.
चित्रा 6. फुलाया अग्न्याशय. एक सफल अग्न्याशय हटाने collagenase समाधान के साथ perfused एक अग्न्याशय निकलेगा. गरीब छांटना एक छोटे, हवा निकाल अग्न्याशय छोड़ देंगे.
Ficoll ढाल के 7. चार परतों चित्रा. चार अलग परतों एक एडवेंचर्स का प्रतिनिधित्वशीर्ष पर 11% तक तल पर 25% से टी Ficoll घनत्व. अलग layering टापू से मलबे और बहि अप्रचार दूर करने के लिए आवश्यक है.
चित्रा 8. आइलेट चयन. स्वस्थ टापू एक दौर गोलाकार आकृति के साथ गहरे भूरे रंग के लिए एक सुनहरा भूरा है और ऊतक कोष्ठकी से जुड़े नहीं हैं करते हैं. एक रात ऊष्मायन (16-20 घंटे) के बाद एक परिगलित केंद्र प्रयोगों से बाहर रखा जाना चाहिए जो बड़े टापू में विकसित करता है.
चित्रा 9. प्रतिनिधि उच्च गुणवत्ता वाले शिविर उत्पादन परिणाम, प्रदर्शन है कि secreted Insulमें शिविर उत्तेजना मध्यम से मापा जा सकता है. ए) जंगली प्रकार या जीन पीटा चूहों से अलग टापू 11.1 मिमी ग्लूकोज और intracellular शिविर उत्पादन के साथ प्रेरित किया गया मापा और सामान्यीकृत कुल सेलुलर प्रोटीन के लिए. बी) स्रावित इंसुलिन एक मानक इंसुलिन एलिसा का उपयोग कर मापा गया था, और कुल सेलुलर को भी सामान्यीकृत था प्रोटीन. कई मामलों में, शिविर उत्पादन में परिवर्तन ग्लूकोज प्रेरित इंसुलिन स्राव में वृद्धि के साथ सीधे संबद्ध है. n = प्रत्येक समूह के लिए 3; *, पी <0.05. यह आंकड़ा Kimple एट अल 10 में प्रकाशित शोध से लिया गया था.
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Discussion
दुनिया की आबादी का 7.7% को प्रभावित करने का अनुमान मधुमेह के प्रसार के साथ, उपन्यास अनुसंधान तकनीकों की आवश्यकता दोनों को समझते हैं और मधुमेह 18 का इलाज करने के लिए आवश्यक है. वर्तमान आइलेट अलगाव में इन विट्रो प्रयोगों के लिए इस्तेमाल एक अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल है और मामूली संशोधनों 11,14,16 के साथ पहले से प्रस्तुत किया गया है. इंसुलिन स्राव ऐसे शिविर के रूप में अपस्ट्रीम घटक, पर ध्यान केंद्रित कर, अलग टापू के लिए एक आम बहाव के आवेदन है, इंसुलिन के उत्पादन और स्राव potentiating तंत्र को चित्रित करने में मदद कर सकते हैं.
इच्छामृत्यु का चुनाव प्रयोगशाला पशुओं के साथ मानवीय व्यवहार के साथ ही प्रयोगात्मक माप की अखंडता दोनों को सुनिश्चित करने के लिए सोच समझकर किया जाना चाहिए. यह पिछले अग्न्याशय के लिए समय का अधिक से अधिक राशि के लिए ऑक्सीजन युक्त रक्त के साथ आइलेट छिड़काव की अनुमति देता है के रूप में आइलेट अलगाव के लिए, संज्ञाहरण के तहत Exsanguination इच्छामृत्यु के लिए हमारे पसंदीदा तरीका हैमुद्रास्फीति. सीओ 2 साँस लेना यह मानवीय प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता है के रूप में अगर प्रक्रिया शुरू कर सकते हैं, इससे पहले कि यह कम से कम 5-6 मिनट के लिए खराब ऑक्सीजन युक्त रक्त को टापू को उजागर करता है, इच्छामृत्यु के लिए एक गरीब विकल्प है. संज्ञाहरण के बिना गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था वैज्ञानिक औचित्य के साथ एक स्वीकार्य तरीका हो सकता है, लेकिन यह मानवीय मौत और आइलेट समारोह के संरक्षण को सुनिश्चित करने के क्रम में इच्छामृत्यु की विधि और माउस विच्छेदन और अग्न्याशय मुद्रास्फीति प्रक्रिया दोनों के साथ महत्वपूर्ण अनुभव की आवश्यकता होगी. संज्ञाहरण के तहत Exsanguination चुनने में, Avertin इस प्रोटोकॉल में वरीय संवेदनाहारी है. Avertin की खास पसंद है यह अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किया एनेस्थेटिक्स पर कई फायदे के साथ एक तेजी से अभिनय और गहरी संवेदनाहारी है कि है. सबसे पहले, Avertin isoflurane 19 के रूप में करता, वाहिका संरचना को चौड़ा करना और नाइट्रिक ऑक्साइड रिहाई प्रेरित नहीं करता. अग्नाशय islets अत्यधिक vascularized कर रहे हैं, और इस तरह उनके जीव विज्ञान नकारात्मक isoflurane exposur से प्रभावित हो सकता हैई. इंजेक्शन 20 के बाद एक घंटे के लिए 167% ऊपर से रक्त शर्करा को बढ़ाने के लिए दिखाया गया है जो / xylazine, ketamine कर सकते हैं के रूप में द्वितीय, Avertin जरूरत से ज्यादा, ग्लूकोज इंजेक्शन के अभाव में रक्त शर्करा का स्तर बढ़ा नहीं है. अंत में, pentobarbital के लिए चिकित्सकीय रेंज टापू को hypoxic नुकसान की संभावना बढ़ रही है, चूहों 21 में बहुत ही संकीर्ण है.
वर्तमान प्रोटोकॉल में, Oddi की दबानेवाला यंत्र के आसपास आम पित्त नली ligate को सीवन धागे का उपयोग एक hemostat के लिए एक विकल्प के रूप में उपयोग किया जाता है. धागा विधि आम पित्त नली का अधिक से अधिक गतिशीलता के लिए अनुमति देता है और स्थिति केन्युलेशन के लिए सुई में मदद करता है. हालांकि, इस कदम के दौरान धागे का उपयोग hemostat एक मुक्त हाथ पित्त नली की स्थिति में मदद करने के लिए अनुमति देता है, जबकि दो वस्तुओं (धागा और सिरिंज) धारण की आवश्यकता है. दोनों अलगाव की तकनीक एक की समान संख्या और हमारी प्रयोगशाला और दूसरों 10,22 में पिछले काम के साथ के रूप में दिखाया व्यवहार्य टापू उपज. इसके अलावा, केन्युलेशन neeDLE आकार, स्थिति, और कोण उपयोगकर्ता की पसंद पर निर्भर करेगा. विशेष रूप से, एक 30 जी सुई इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है लेकिन अन्य आकार तनाव या आनुवंशिक पृष्ठभूमि पर आधारित आवश्यक हो सकता है. उदाहरण के लिए, BTBR चूहों एक बहुत नाज़ुक आम पित्त नली है और एक बड़े गेज सुई टिप (खल्क, व्यक्तिगत टिप्पणियों) के चारों ओर एक बड़ा मुहर प्रदान कर सकता है. इस प्रकार, यह आवश्यक हो तो बाहर स्विच करने के लिए तैयार है, सर्जरी के दौरान हाथ पर विभिन्न आकार के प्रवेशनी सुई पा लिया है करने के लिए सिफारिश की है. आम पित्त नली में सुई की स्थिति भी बहुत आइलेट उपज को प्रभावित करेगा. सुई आम पित्त नली के विभाजन के सामने रखा गया है, तो collagenase समाधान जिगर दर्ज करें और एक गरीब मुद्रास्फीति में परिणाम होगा. सुई Oddi की दबानेवाला यंत्र को भी बंद रखा गया है हालांकि, अगर एक आंशिक अग्नाशय मुद्रास्फीति अलग टापू की संख्या कम हो जाएगा. आम पित्त नली पर विभिन्न सुई के आकार और स्थानों के साथ परीक्षण अग्नाशय inflations requi होगालाल उपस्थित प्रक्रिया को अनुकूलित और आइलेट उपज को अधिकतम करने के लिए.
व्यवहार्य टापू की संख्या में वृद्धि करने के लिए इस प्रक्रिया का एक अन्य महत्वपूर्ण घटक प्रोटोकॉल निर्देशों के अनुसार सभी अभिकर्मकों को तैयार है. Oxygenation को बढ़ाने के लिए 95% 2 हे / 5% सीओ 2 के साथ बफ़र्स बक प्रोटोकॉल भर आइलेट अस्तित्व में एक कारक बन सकते हैं. पिछला काम ऑक्सीजन एकाग्रता संभावित β कोशिकाओं 23 की ऊर्जा सामग्री को कम करने, आइलेट के इंटीरियर की ओर कम हो जाती है कि यह दर्शाता है. एक काले, परिगलित केंद्र में इन विट्रो जवाबदेही में कमी के साथ correlating, सुसंस्कृत टापू में दिखाई देगा यह एक रात ऊष्मायन के बाद स्पष्ट हो सकता है. इस प्रकार, पर्याप्त ऑक्सीजन प्रदान अलगाव के दौरान और रात भर, normoxic ऊष्मायन प्रक्रिया में आइलेट संख्या और व्यवहार्यता बढ़ाने में मदद मिलेगी. इसके अलावा, collagenase समाधान की समुचित तैयारी अग्नाशय के ऊतकों की पाचन बढ़ाने और टी मुक्त कराया जाएगावह आसपास के ऊतकों से आइलेट्स. Collagenase एकाग्रता भी कम है, तो न केवल आइलेट उपज कम हो जाएगा, लेकिन बहि कोष्ठकी ऊतक नकारात्मक बहाव के अनुप्रयोगों को प्रभावित करने, टापू से जुड़ी रह सकती है. दूसरी ओर, एक collagenase एकाग्रता की बहुत अधिक टापू नष्ट कर सकता है. इसलिए, islets के विनाश के बिना collagenase पाचन दक्षता सुनिश्चित करने के लिए उचित गुणवत्ता नियंत्रण उपायों के लिए अधिक से अधिक पैदावार को बढ़ावा देंगे.
क्लोस्ट्रीडियम histolyticum से अलग collagenase इस प्रोटोकॉल में अग्नाशय के ऊतकों से टापू मुक्ति के लिए इस्तेमाल एंजाइम है. collagenase के विभिन्न बहुत सारे के बीच enzymatic गतिविधि का irreproducibility अलग islets की मात्रा और / या गुणवत्ता में बाधा करने की क्षमता है. वर्तमान प्रोटोकॉल में, collagenase एंजाइम के प्रत्येक नए बहुत वे अध्ययन कर रहे हैं विषय से पहले मात्रा और islets की कार्यक्षमता दोनों निर्धारित करने के लिए एक आंतरिक गुणवत्ता नियंत्रण चेक के माध्यम से चला जाता है. इसलिए, downstrआइलेट अलगाव के लिए एक एंजाइम का चयन करते समय विदेश मंत्री अनुप्रयोगों और बहुत भिन्नता पर विचार करने की आवश्यकता है. Liberase ® (रॉश), एक शुद्ध collagenase मिश्रण, कई मामलों में सफल रहा है कि एक और पाचक एंजाइम वैकल्पिक है; विशेष रूप से, पृथक टापू 24,25 की उच्च मात्रा प्राप्त करने में. यह इन विट्रो समारोह 26 में बाधा हो सकती है लेकिन, जैसा कि Liberase का उपयोग, कार्यात्मक टापू अलग करने के लिए लाभकारी नहीं हो सकता है.
कई सीमाओं बहाव के अनुप्रयोगों में बाधा हो सकती है कि वर्तमान आइलेट अलगाव और शिविर दृढ़ संकल्प प्रक्रियाओं में मौजूद हैं. जैसा कि पहले कहा, BTBR चूहों अग्नाशय मुद्रास्फीति और बाद आइलेट अलगाव की कठिनाई बढ़ जाती है, जो एक बहुत ही नाजुक आम पित्त नली, है. इसलिए, कई चूहों से पूलिंग आइलेट तैयारी के रूप में वर्णित शिविर परख सहित विट्रो assays, में कई दोहराने के प्रति कई टापू की आवश्यकता होती है, आवश्यकता हो सकती है. इसके अतिरिक्त, शिविर परख ब्लॉक में IBMX का उपयोगशिविर उत्पादन का एक पढ़ने के लिए बाहर दे रही है फॉस्फोडाइस्टरेज़ गतिविधि,. IBMX के अलावा शिविर उत्पादन और गिरावट की साइकिल सेलुलर संकेत के लिए महत्वपूर्ण है जिन मामलों में उचित नहीं हो सकता. हालांकि, इस प्रोटोकॉल से IBMX हटाने में काफी ईआईए में सार्थक शिविर मूल्यों को प्राप्त करने के क्रम में दोहराने के प्रति अधिक कई islets के अलावा जरूरत महसूस टापू की अंतिम शिविर सामग्री को कम करती है.
वर्तमान प्रोटोकॉल एक आइलेट जीव विज्ञान प्रयोगशाला या अंत: स्रावी अग्न्याशय में रुचि रखने वालों के लिए एक अनिवार्य उपकरण है. इस प्रोटोकॉल के लिए शिविर घटक विभिन्न उपचार के माध्यम से आइलेट हेरफेर बढ़ाने या कुंद इंसुलिन स्राव कैसे कर सकते हैं समझने के लिए सिर्फ एक ही इन विट्रो प्रयोगों में कई की है. टापू के उपयोग के अधिकांश मुख्य रूप से अनुसंधान β सेल इंसुलिन स्राव पर केंद्रित है, अन्य प्रकार की कोशिकाओं आइलेट 4 के अंतर्गत सक्रिय रिश्तों के लिए मूल्यांकन किया जा सकता. इन विट्रो और मैं में एक दूसरे के साथ संयोजन मेंएन vivo मॉडल, आइलेट प्रयोग मधुमेह और insulinomas रूप में विनाशकारी अग्नाशय संबंधी रोगों अंतर्निहित तंत्र पर प्रकाश डाला जाएगा. सबसे महत्वपूर्ण बात है, दवा एजेंटों सीधे टापू प्रभाव समझ कैसे एक में vivo मॉडल को अनुवाद में इलाज और सहायता की प्रभावकारिता में वृद्धि होगी.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल पर विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए रेनी एल Pasker और हरप्रीत लालकृष्ण बराड़ को धन्यवाद देना चाहूंगा. इसके अलावा, हम हमारे समय की अनुमति दी जो उनकी प्रयोगशाला के सदस्यों के समर्थन के साथ, मैडिसन विस्कॉन्सिन विश्वविद्यालय में ड्यूक विश्वविद्यालय और एलन डी. Attie पर क्रिस्टोफर बी Newgard की सलाह स्वीकार करते हैं और अनुकूलन करने के लिए आवश्यक समर्थन करना चाहते हैं वर्णित प्रोटोकॉल. विशेष रूप से, हम उत्पादक विचार विमर्श और सलाह के लिए Attie प्रयोगशाला में हंस Hohmeier, Danhong लू, और हेलेना Winfield Newgard प्रयोगशाला में और मैरी Rabaglia धन्यवाद. इस काम एनआईएच अनुदान DK080845 और किशोर मधुमेह 594 द्वारा समर्थित किया गया
(खल्क के लिए) रिसर्च फाउंडेशन अनुदान 17-2011-608
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets | Sigma-Aldrich | C7657 | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Hanks Balanced Salt Solution 10X | Invitrogen (Gibco) | 14065-056 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| RPMI 1640 (powder) | Invitrogen (Gibco) | 31800-022 | |
| Albumin from Bovine Serum (BSA) | Sigma-Aldrich | A7888 | |
| 3/0 Silk Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-30 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| 0.8 mm Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Curved Scissors | Fine Science Tools | 14061-10 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| 5 ml BD Luer-Lok Syringe | BD | 309646 | |
| 1 ml BD syringe | BD | 309628 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| 27 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305109 | |
| Sharpening Stone | Fine Science Tools | 29008-01 | |
| 2-2-2-tribromoethanol | Sigma-Aldrich | T48402-25G | |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 240486-100mL | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Monopotassium Phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Sodium Bicarbonate (NaCHO3) | Sigma-Aldrich | S6014 | |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | M9397 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen (Gibco) | 15140-122 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) | Fisher Scientific | SH30088.03HI | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | 5879-100MG |
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