Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

En metode for mus bukspyttkjertelens Isolering og Intracellulær cAMP Bestemmelse

Published: June 25, 2014 doi: 10.3791/50374
Automatic Translation
1, 2, 3, 2
1Department of Nutrional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medicine, Division of Endocrinology, Diabetes, and Metabolism, University of Wisconsin-Madison, 3School of Pharmacy, University of Waterloo

Summary

Analysere in vitro β-cellefunksjon ved hjelp av isolerte mus Langerhanske øyer er en viktig komponent i studiet av diabetes patofysiologi og behandlingsformer. Mens mange nedstrøms applikasjoner som er tilgjengelige, denne protokollen beskriver spesielt måling av intracellulær cyklisk adenosin monofosfat (cAMP) som en viktig parameter å bestemme β-cellefunksjon.

Abstract

Ukontrollert glykemi er et kjennetegn på diabetes mellitus og fremmer lidelser som nevropati, nefropati og retinopati. Med den økende forekomsten av diabetes, både immun-mediert type 1 og fedme bundet type 2, studier rettet mot å avsløre diabetes patofysiologi og terapeutiske mekanismer er av avgjørende betydning. De β-cellene i de pankreatiske Langerhanske øyer er ansvarlig for riktig sekresjon insulin i respons til forhøyede blodglukosekonsentrasjoner. I tillegg til glukose og andre næringsstoffer, er β-celler også stimulert av spesifikke hormoner, betegnet Inkretinene, som utskilles fra tarmen som respons på et måltid, og virker på β-cellereseptorer som øker produksjonen av intracellulær cyklisk adenosin monofosfat ( cAMP). Redusert β-cellefunksjon, masse og inkretinsystemet respons er godt forstått å bidra til patofysiologien av type 2 diabetes, og blir også i økende grad knyttet with type 1 diabetes. Den nåværende mus holme isolasjon og cAMP besluttsomhet protokollen kan være et verktøy for å hjelpe avgrense mekanismer fremme sykdomsutvikling og terapeutiske intervensjoner, spesielt de som er mediert av de inkretin reseptorer eller relaterte reseptorer som fungerer gjennom modulering av intracellulær cAMP produksjon. Mens bare cAMP-måling vil bli beskrevet, gir den beskrevne holme isolasjonsprotokoll et rent preparat som også gir mulighet for mange andre nedstrøms applikasjoner, inkludert glukosestimulert insulinsekresjon, [3H]-thymidin-inkorporering, protein overflod, og mRNA-ekspresjon.

Introduction

Den strenge vedlikehold av euglycemia er viktig å forebygge tilleggslidelser som nevropati, nefropati og retinopati, som er alle kjennetegn på patologi ukontrollert type 1 og 2 diabetes 1. Redusert β-cellefunksjon og masse i både type 1 og 2 diabetes forstyrre blodglukosekonsentrasjonen to. Mens immun-mediert type 1 diabetes resultater fra en knusende tap av insulinproduserende β-celler, nedsatt β-celle insulinsekresjon og perifer insulinsignalering i type 2 diabetes sammen fremme hyperglykemi, dyslipidemi, og økt glukoseproduksjon, noe som til slutt resulterer i både tap av β-cellemasse, og insulin sekretorisk kapasitet fra individuelle β-celler tre. Forstå de underliggende β-cellemekanismer i utviklingen av type 1 og 2 diabetes vil forhåpentligvis gi opphav til nye behandlingsformer for å forebygge og behandle disse sykdommene.

In vitro tissue kulturmodeller, slik som i Ins-1 og MIN6 udødelig β-cellelinjer, kan være nyttige verktøy for å forstå spesifikke β-cellefunksjoner. Men samspillet mellom de ulike celletyper innenfor holmen kan selv regulere β-cellefunksjon. For eksempel den parakrine påvirkning av glukagon (frigitt fra α-celler) og somatostatin (gitt ut fra δ-celler) i økende og avtagende insulinsekresjon, henholdsvis, demonstrerer viktigheten av celle celle nærhet i det endokrine respons 4.. Videre gap veikryss mellom β-celler potensere frigjøring av insulin fem. Videre, selv om fremskritt har blitt gjort i å generere insulinoma linjer som bedre replikert den fysiologiske responsen av isolerte øyer på glukose (f.eks Ins-1-avledet 832/13 og 832/3-cellelinjer), deres glukoserespons fremdeles er forskjellig fra normale rotte holmer 6,7. Videre reaksjon av disse klonale insulinoma cellelinjertil glukagon-lignende peptid-1 (GLP-1)-agonister kan variere betydelig fra hverandre, så vel som fra vanlige holmer 6. Derfor kan udødeliggjorte cellelinjer ikke representere den beste modellen for bestemmelse av stoffer som påvirker cAMP-produksjon.

I motsetning til de insulinoma-avledede cellelinjer, studere β-cellefunksjonen utelukkende i hele dyremodeller har sitt eget sett av komplikasjoner. En av de største utfordringene i arbeidet med endokrine vev er å måle den nøyaktige konsentrasjonen av hormonet frigjøres. Nærmere bestemt, spiller lever en stor rolle metaboliserende insulin, og bukspyttkjertelen blodstrømmen går direkte til leveren. Således kan en plasmainsulin målingen ikke nøyaktig fremstille de mengder insulin blir utskilles fra bukspyttkjertelen i seg selv, eller virkningen av forskjellige behandlinger på forekomsten av insulinsekresjon 8.. Videre kan renal metabolisme av glukagon begrenser påliteligheten av glukagon utgangen fra holmen α-celler 9. Derfor isolere primære muse holmer for in vitro eksperimentering gir en mer presis forståelse av hvordan holmen reagerer på bestemte stimuli for å utfylle målinger gjort i vivo.

Den nåværende protokoll for isolering av mus holmer er et veletablert protokoll som brukes av en rekke grupper (med små modifikasjoner som kan bidra til å øke suksess) 10,11. I tillegg tillater bestemmelse av cAMP-produksjon for en direkte avlesing av inkretinsystemet respons fra β-celler. I forbindelse med cAMP-måling, proteininnhold og insulinsekresjon kan også kvantifiseres fra samme cAMP prøven prep, bidrar til å bestemme om en feil i β-cellefunksjon ligger ved eller i avstand cAMP 10.. Den endelige cAMP innhold og insulinsekresjon program i denne protokollen kan være et svært kraftig verktøy for å forstå påvirkning av farmasøytiske og kosttilskudd bestanddeler, blant annets, på cAMP og insulinutskillelse. I tillegg til stimulering av glukose alene, kan andre forbindelser benyttes for å måle endringer i cAMP and insulin secretion 10,11.

Til slutt, selv om insulin er den primære hormon vi analysen fra isolerte holmer, andre hormoner, for eksempel glukagon og somatostatin, så vel som cytokiner, eikosanoider og cyklisk adenosinmonofosfat, kan også måles, enten ved en forbigående stimulering assay eller ved kvantifisering av sine nivåer i kulturmediet 12.. Til slutt, selv utenfor rammen av dette manuskriptet, holme isolasjon med den beskrevne collageisolasjonsmetoden gjør det mulig for holme bevaring slik at mange andre nedstrøms programmer kan bli forfulgt, for eksempel holme transplantasjon, RNA isolering for kvantitativ real-time PCR eller microarray-analyser, protein isolasjon for Western blotting, holme embedding og immunofluorescent bildebehandling, og [3H]-tymidininkorporering som et mål på holme celle replikation, hvorav noen er blitt beskrevet i tidligere JOVE området 13-16. Totalt, etter holmen isolasjon prosedyren som er beskrevet i protokollen kan gi en forsker med viktig og nyttig informasjon for å utvikle behandlingsformer og fremme medisiner rettet mot å forbedre β-cellefunksjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble henrettet i samsvar med alle relevante retningslinjer, forskrifter og tilsynsorganer. Protokollen blir demonstrert ble utført under veiledning og godkjenning av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Wisconsin-Madison.

En. Utarbeidelse av løsninger

  1. Metoden for aktiv dødshjelp i denne protokollen er exsanguination henhold Avertin anestesi (for en gjennomgang av alternativene, se diskusjon). For å gjøre Avertin, tilsett 0,625 g (1,25% eller 44,2 mM) 2-2-2 tribromoethanol til 1,25 ml av 2-metyl-2-butanol i et 15 ml konisk rør og oppvarmning ved 37 ° C i 20-30 min. Vortex løsning på høy i 10-15 sek om gangen for å fullt oppløse 2-2-2 tribromoethanol. Når fullstendig oppløst, legger løsningen på 48,75 ml av dobbelt destillert H 2 O, filtrere gjennom en 0,45 mikrometer filter inn i en ny 50 ml konisk tube, pakk de 50 ml koniskeal tube i aluminiumsfolie og oppbevar ved 4 ° C i opptil en måned. Ta tuben til RT før injisere mus.
  2. For å gjøre Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS), utgjør en L 1x HBSS fra en 10x lager (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, California) i dobbelt destillert H 2 O, tilsett 0,35 g (4,2 mM) Nacho tre, og butikken ved 4 ° C i opp til 1 måned. For hver mus, blir 105 ml av denne løsningen (pluss 5-10 ml ekstra for pipettering error) være nødvendig for holme isolasjon.
  3. Holmer er svært utsatt for hypoksisk skade; derfor er HBSS boblet med 95% O 2/5% CO2 for å etterligne de konsentrasjoner av O 2 i blodet. Spesielle gass blandinger kan kjøpes og en boblende stasjon satt opp med en Pasteur pipette knyttet til fleksibel slange. Etter bobling av den nødvendige mengde av HBSS med 95% O2 / 5% CO2 i 15 minutter, tilsett 0,02% RIA grad av BSA (bovint serumalbumin) i volum og holde på is i remainder av holmen isolasjon.
  4. For Ficoll preparatet, veie ut 32,5 g av Ficoll i et 400 ml begerglass, tilsett 80 ml HBSS, og omrør ved 500 til 700 rpm i 30 min. Når oppløst, hell Ficoll-løsning inn i en 250 ml gradert sylinder og tilsett HBSS til 130 ml merket på gradert sylinder for å lage en 25% Ficoll-løsning. Dekk toppen av målesylinder med to deler av Parafilm ® M (Pechiney Plastemballasje Company, Chicago, IL) og rist kraftig flere ganger.
  5. For en 23%, 20,5% og 11% Ficoll-løsning, tilsett 27,6, 24,6, og 13,2 ml av 25% Ficoll, henholdsvis til 50 ml koniske rør. Så, ta med hver løsning opp til totalt 30 ml med HBSS og rist godt for å blande. Alle fire ficoll løsninger bør lagres ved 4 ° C og er god for opp til to uker.
  6. Kollagenase-løsning som er egnet for å isolere aktive holmer fremstilles fra kollagenase isolert fra Clostridium histolyticum (Materialer tabell). Hver masse må testes for enzymeffektivitet. Vanligvis er kollagenase benyttet ved 0,3 til 0,5 mg pr ml HBSS. Utnytte enzymkonsentrasjonen i dette området (vanligvis tre ulike konsentrasjoner), bestemme kvaliteten og kvantiteten på isolerte øyer fra alder-matchet mus eller kullsøsken å sette arbeids enzym konsentrasjon.
  7. Når den riktige konsentrasjon bestemmes, krever hver mus 35 ml kollagenase i HBSS for hele isolasjonsprotokoll. Virvle collage i HBSS å oppløse. Umiddelbart før operasjonen, pre-load en 5 ml sprøyte med kollagenaseoppløsning, plassere kanylen på og fjerne luftbobler, og la på is inntil nødvendig.
  8. Holmen kultur media for O / N inkubasjon er en supplert RPMI 1640 media. For stamløsning, oppløse en RPMI 1640-pakke (Gibco, New York) i 1 l i dobbelt destillert H2O og tilsett 1,19 g HEPES (5 mM) og 2 g NACHO 3 (24 mM). Juster pH-verdien til 7,4,filter sterilisere, og oppbevar ved 4 ° C i mørket.
  9. For de supplert media, legger 10% FBS og 100 IU/100 mikrogram / ml penicillin / streptomycin, henholdsvis til de lager RPMI 1640 media. Ved en annen glukosekonsentrasjon er ønskelig, kan glukose-fri RPMI 1640 media bli brukt, og en spesifikk konsentrasjon av glukose, kan tilsettes.
  10. For en aksje Krebs Ringer Bikarbonat Buffer (Krebs), tilsett følgende ingredienser for å doble destillert vann ved følgende konsentrasjoner: NaCl (118,41 mm), KCl (4,69 mm), MgSC 4 (1,18 mm), KH 2 PO 4 (1,18 mM ), Nacho 3 (25 mM), HEPES (5 mM) og CaCl 2 (2,52 mM) ved pH 7,4. CaCl 2 bør legges siste, og denne løsningen kan oppbevares ved 4 ° C i opptil to uker.
  11. For å gjøre et arbeidslager av Krebs, første gass med 95% O 2/182 5% CO2 i 10-15 minutter med en Pasteur-pipette ved 37 ° C etterfulgt av tilsetning av 0,5% RIA grade BSAetter volum. Deretter ble glukose tilsatt til den ønskede konsentrasjon for den in vitro-analyse.

2. Utarbeidelse av verktøy

  1. Litt sløv tips av 30 - og 27-G nåler ved hjelp av en skjerping stein for å runde av skarpe punkt. Sett en 45 graders bøy i nålen ca ¼ av en tomme fra spissen ved hjelp av en tang. Være forsiktig for ikke å klemme for hardt, noe som vil stenge av den innvendige diameter av nålen.
  2. Skjær 3/0 silke sutur tråden i ca 4-tommers lengder, en for hver mus.
  3. Dekk dissekere mikroskop base med plastfolie og tape ned.
  4. Skjær flere stykker av absorberende benken papir, ca 3 x 5 inches i størrelse, i minst to per mus.

Tre. Klar Mouse

  1. Fyll en 1 ml sprøyte med 1 ml Avertin.
  2. Injisere avertin løsning intraperitonealt på ca 40 mL / gram av kroppsvekt.
  3. Etter musen ingen longer reagerer på halen eller bakfot klyper, nøye overføre den til dissekere mikroskop arbeidsstasjonen.
  4. Med musen i liggende stilling og hodet vendt distalt, spray musen med 70% vandig etanol. Pass på å bruke en tilstrekkelig mengde av 70% etanol for å begrense mengden av pels i den eksponerte brysthula.

4. Åpne Thoracic Cavity

  1. Knip på pels og hud av musen mellom de to bakbena og foreta en første kutt gjennom epidermis, dermis og underliggende membran.
  2. Mens fortsatt å klemme huden og underliggende membran, skåret mot den fremre ekstremiteten på begge sider av musen tar forsiktighet for å unngå å kutte noen indre organer.
  3. Brett huden og membran klaff over brystkasse og fjerne xiphoid prosess for å tillate enklere tilgang til bukspyttkjertelen for inflasjon.
  4. Reorientere musen med hodet vendt proximally og flytte de indre organer mot høyre side av arbeidet stasjon å avsløre synkende aorta.
  5. Med mindre blod vev er å bli samlet, kan den synkende aorta bli kuttet for å fullføre euthanization. Sug opp overflødig blod med benkepapir eller en Kimwipe for enklere tilgang til den felles gallegang.

5. Inflating bukspyttkjertelen

  1. Med en dissekere mikroskop, omplassere tynntarmen slik at den felles gallegang danner en vinkelrett linje med hodet av musen.
  2. Ta en tang og ta tak i tynntarmen og finne sphincter av Oddi (sphincter av ampulla) på slutten av den felles gallegang, som splays ut på tynntarmen fra gallegang, danner en hvit trekant på den rosa tarmen. Når sphincter av Oddi har blitt plassert, ta en # 5 Dumont tang og skyv tuppen under felles gallegang så nær tynntarmen som mulig, være forsiktig med å stikke hull i kanalen.
  3. Etter piercing gjennom tynntarmen og bindevev, brukertuppen av Dumont pinsett til å ta tak i sutur og trekk den under felles gallegang. Tie av den felles gallegang så nær sphincter av Oddi som mulig, slik at knuten er stram for å unngå lekkasje.
  4. Ta tak i begge ender av sutur og trekk mot halen å sette noen spenning på den felles gallegang. Ved hjelp av en ledig hånd, gjør et lite snitt med mikro saks i felles gallegang like ovenfor den siste bifurkasjon inn i leveren. Merk: Det er viktig å ikke kutte for nær sphincter av Oddi, da dette kan resultere i en delvis inflasjon i bukspyttkjertelen og unngå å skjære gjennom den felles gallegang som det vil også resultere i en dårlig inflasjon.
  5. Mens du holder de to endene av strengen med den felles gallegang stram, fjern sprøyten / kanyle som er forhåndslastet med 5 ml kollagenaseoppløsning fra isen bøtte, satt ned sprøyten, og sett avstumpet 30 G nål inn i skjæret felles gallegang, være forsiktig med å pierce gjennom wall i røret. Hvis 30 G kanyle er ikke bred nok for gallegang å danne en forsegling rundt, fjerne den og erstatte med avstumpet 27 G nål.
  6. Mens du holder nålen på plass, slipper sutur og plukke opp 5 ml sprøyte. Sakte trykke ned stempelet på sprøyten. Merk: Hvis nålen har blitt innsatt i den felles gallegang, vil den utvide seg.
  7. Fortsett å trykke ned stempelet langsomt og lar seg på en pulserende måte inntil den første del av bukspyttkjertelen blåses opp, etterfulgt av mild konstant trykk inntil bukspyttkjertelen ikke lenger blåses opp. Merk: De fleste pancreases holde 3-5 ml før du begynner å lekke. Dessuten vil en vellykket inflasjon har jevn fordeling av eksokrint vev og den del av bukspyttkjertelen på toppen av magesekken vil bli oppblåst.
  8. Fjern kanylen fra den felles gallegang og satt ut til siden.

6. Pancreas fjerning

  1. Ta en tang i den ene hånden og en buet saks iden andre. Ved hjelp av pinsett, ta tak i tynntarmen ved sphincter av Oddi. Med saksen lukket, og bruk spissen til egen del av bukspyttkjertelen fra tynntarmen.
  2. Spre saksen fra hverandre for å øke avstanden mellom tynntarmen og bukspyttkjertelen.
  3. Plasser "V" av saksen, hvor tynntarmen og bukspyttkjertelen festes til hverandre på den høyre side av mellomrommet som nettopp er laget. Ved hjelp av pinsett dra forsiktig i tynntarmen forbi saks for å fjerne bukspyttkjertelen.
  4. Fortsett å arbeide nede i tynntarmen til rosa bindevev. På dette punktet, plukke opp i tynntarmen i nærheten av der den festes til magen og snip bukspyttkjertelen bort fra resten av tynntarmen. Merk: Pass på å ikke klipp bukspyttkjertelen som det kan begynne å deflatere.
  5. Forsiktig ta tak i en del av bukspyttkjertelen festet til magen med tang (flat tang fungerer best). Mens du drar opp forsiktig på bukspyttkjertelen, bruke kurvend saks å klipp bort på sammenhengen mellom bukspyttkjertelen og magen.
  6. Finn milten og hold det med pinsett over bukspyttkjertelen. Ta de buede saks og klippe bort sammenhenger mellom milten og bukspyttkjertelen.
  7. Finn hvor bukspyttkjertelen er festet til tykktarmen. Plukk opp tykktarmen med pinsett og bruke tuppen av saksen til å rote gjennom. Spre saksen fra hverandre som før for å generere et gap mellom den tykktarmen og bukspyttkjertelen.
  8. Hold opp tykktarmen med tang: dette vil resultere i bukspyttkjertelen faller bort, utsette sine presise forbindelser til tykktarmen. Klipp bort de resterende tilkoblinger.
  9. Finn den rosa bindevev festet til pankreas og tynntarm og kuttet så nær bukspyttkjertelen som mulig. Merk: Hvis piercing bukspyttkjertelen er en bekymring, er det anbefalt å kutte nærmere tynntarmen som bindevevet vil bli filtrert ut i senere trinn.
  10. Grab så mye av bukspyttkjertelen som mulig, og løft den forsiktig. Med buet saks, klippe bort de resterende forbindelser mellom bukspyttkjertelen og brysthula å fullstendig fjerne bukspyttkjertelen. Merk: Bukspyttkjertelen bør fortsatt være oppblåst hvis fjernes riktig.
  11. Oppbevar fjernet bukspyttkjertelen i ~ 2,5 ml kollagenase-løsning i et 50 ml konisk rør på is inntil alle andre pancreases er blitt blåst opp og fjernet for forsøket.

7. Vaske

  1. Ta alle isolerte pancreases og flytte dem til å skille 50 ml koniske rør som hver inneholder 25 ml frisk kollagenaseoppløsning
  2. Plasser 50 ml koniske rør oppreist i en 37 ° C ristevannbadet i stand til oscillerende ved 220-250 rpm, med shaker slått av.
  3. Gass hver 50 ml konisk rør med 95% O2 / 5% CO2 i 5 min med en Pasteur pipette.
  4. Oppsummering hvert rør godt og legg sidelengs i risting vannbad under overflaten av vannet. Rist ved 220 til 250 rpm i 20 sekunder, hvert annet minutt, opp til 16 min som starter ved minst seks. (Rist ved 6, 8, 10, 12, 14 og 16 min)
  5. Umiddelbart overføre rørene til en sentrifuge ved romtemperatur i en kort sentrifugering. Ta med sentrifugen opp til 1500 rpm (400-500 g), og skrur seg av umiddelbart.
  6. Ved hjelp av en vakuum-felle, aspirat omtrent 22,5 ml av collagenase-løsning uten å forstyrre pelleten. Vask med 10 ml HBSS, og vortex forsiktig for å bryte opp pelleten.
  7. Utfør en annen rask spinn ved romtemperatur opp til 1500 rpm (400-500 g).
  8. Sug omtrent 10 ml av oppløsningen, igjen uten å forstyrre pelleten.
  9. Vask med en annen 10 ml iskald HBSS og vortex forsiktig for igjen å bryte opp pelleten. Gjenta rask spinn og aspirer 10 ml av løsningen.
  10. Forsiktig vortex pellet i de resterende 2,5 ml HBSS-løsning. Hell løsning gjennomen 1000 mikrometer mesh i en ny 50 ml konisk tube. Dette vil få den store vev rusk ikke fordøyes av kollagenase.
  11. Skyll den gamle 50 ml konisk rør med 2,5 ml iskald HBSS. Bruk en Pasteur-pipette for å skylle sidene av røret grundig før overføring av 2,5 ml HBSS gjennom maskene i de nye 50 ml konisk rør.
  12. Utfør en annen rask sentrifugering ved romtemperatur ved 1500 rpm (400-500 g) for å pelletere vev.
  13. Aspirer alt av HBSS ved å skråstille røret mot oppsamlings. Merk: Det er svært viktig å ikke forstyrre pelleten da dette vil resultere i tap av holmer. Dersom pelleten er løs eller begynner å bevege seg mot oppsamlings, stopp aspirering av oppløsningen og re-pellet i vevet, og deretter fortsette å suge den gjenværende oppløsning.
  14. Når alle de HBSS er fjernet, tilsett 4,8 ml 25% Ficoll-løsning og vortex for å bryte opp pelleten.
  15. Nøye lag 2,4 ml 23% Ficoll løsning på toppen av 25% Ficoll-løsning ved tilsetning av 23% Ficoll-løsning til den siden av 50 ml konisk rør. For å sikre jevn lagdeling, rotere 50 ml konisk tube når du legger den Ficoll løsning.
  16. Gjenta lagdel fremgangsmåte for 20,5% og deretter 11% Ficoll-løsninger. Merk: Hvis fire forskjellige lag ikke er til stede, legger HBSS opp til 50 ml merket og Snu røret 4-6 ganger eller til Ficoll gradient ikke lenger eksisterer. Re-pellet vevet og prøv trinn 07.14 til 07.16.
  17. Spinn 50 ml konisk rør ved RT ved 1820 rpm (800 g) i 15 min.
  18. Hell alt av Ficoll inn en frisk 50 ml konisk tube, ta vare å forlate pellet av eksokrint vev bak. Legg iskald HBSS opp til 50 ml merket og Snu røret 4-6 ganger for å blande Ficoll og HBSS sammen.
  19. Spinn 50 ml konisk rør ved RT ved 1820 rpm (800 g) i 5 min.
  20. Aspirer nøye meste av HBSS / Ficoll blanding ved hjelp av et vakuum trap. Ikke forstyrre pelleten som den er løs og kan suges lett.
  21. Ta en Pasteur pipette og overføre pellet til et engangs kulturrøret.

8. Plukke holmer

  1. Tilsett 5 ml av plukk medier (dvs.. Supplert RPMI 1640 eller Krebs Ringer bikarbonatbuffer) til disponibel kultur tube. Merk: De plukk media vil variere avhengig av nedstrøms applikasjoner.
  2. La holmene utfeller til bunnen av kulturen røret i 5 min. Overfør dem ved hjelp av en Pasteur pipette til en 15 mm med 60 mm Isopor petriskål. Merk: Det er viktig å bruke en petriskål som disse ikke behandles og vil hindre holmer fester seg til parabolen.
  3. I en separat 15 mm med 60 mm polystyren petriskål, tilsett 5 ml av mus holme kultur media (100 ml RPMI 1640 Stock Media, 10 ml varmeinaktivert FBS, 1 ml Pen / Strep; filter sterilisert).
  4. Med hjelp av en dissekere mikroskop med baklysetht evne, bruke en P-20 pipette å plukke holmene i petriskål inneholder holme kultur media, ta vare å unngå å overføre acinar vev rusk. Når bakgrunnsbelyst, vil holmer vises brun-gull og deres ytre membran kan glinser, mens acinar vev vises lys grå og kjedelig. Hvis holmen preparatet inneholder en stor mengde avfall, er det tilrådelig å håndplukke holmer to ganger i frisk medium. Redusere rusk forurensning vil begrense holme klumper etter en overnatting inkubasjon. Legge DNAse (3000 U / ml) til fordøyelsen buffer kan også bidra til å begrense holme klumper (JWJ, personlig observasjon). Merk: Det er viktig å telle antall holmer isolert for å planlegge for nedstrøms eksperimenter.
  5. Inkuber holmer O / N i en inkubator innstilt på 37 ° C med 5% CO2.

9. CAMP Assay

  1. Etiketten 1,7 ml mikrofuge-rør, ett for hver replikat av analysen. Merk: cAMP analyser bør ha minst duplicates for hver behandling tilstand, men flere gjentak per behandling er å foretrekke.
  2. Etter gassing i Krebs Ringer bikarbonat-buffer i 15 minutter med 95% O2 / 5% CO2 med Pasteur-pipette, tilsett 0,5% RIA grade BSA og en endelig glukosekonsentrasjon på 1,7 mM (preinkubering løsning). Deretter, tilsett 1 ml av den ferske gasset Krebs til hver mikro-sentrifugerør. To ml av Krebs kreves per rør for de pre-inkubering og behandling tidspunkter; men det anbefales å forberede minst 5-10 ml ekstra.
  3. Roter holmene til midten av petriskålen, og ved hjelp av en P-20 pipette, hånd-plukke holmene til en ny 15 mm med 60 mm polystyren petriskål inneholdende 5 ml av preinkubering løsning for å vaske den glukose-inneholdende kulturmedium fra holmer.
  4. CAMP-analysen kit brukt er GE Healthcare cAMP Direct BioTrak EIA. Den prococol anvendes er en modifikasjon av den som er beskrevet for "Intracellulære cAMP measurement hjelp av ikke acetylering EIA prosedyre med romanen lysis reagenser ", og er optimalisert for bruk med minimum antall holmer per rør, slik at økt antall behandlingsforhold og tekniske replikater. Ved hjelp av en P-20 pipette, overføre minst 13 holmer i hvert rør fra trinn 9.2, opprettholde holme størrelse konsistens mellom rør, med en ml pre-inkubasjon buffer. Merk: Øke antall gjentak er mer gunstig enn antall holmer per tube. Men, hvis det er nok holmer å øke antall holmer per rør jevnt, er det lurt å gjøre det, opp til 25-50 holmer per tube.
  5. Med mikro-sentrifugerør caps åpen, overføres til en 37 ° C inkubator innstilt på 5% CO2, og inkuber i 45 min for å normalisere insulin sekresjon av alle holmer til et referansenivå.
  6. Mens prøvene ruger, forberede behandlinger (dvs. 8 mm, 11,1 mm, 16,7 mM glukose, etc.) i den gasset Krebs frOM trinn 9.2. i 15 ml koniske rør, med en ml ekstra for å ta høyde for eventuelle pipetteringsfeil. Tilsett 3-isobutyl-1-metylxantin (IBMX) til en sluttkonsentrasjon på 200 uM. IBMX er en generell fosfodiesterase-inhibitor som blokkerer nedbrytning av cAMP, slik at cAMP å akkumulere i cellen som det er produsert. (Merk:.. Dette er en sann cAMP produksjon assay Se diskusjonen seksjon for forekomster ved måling av cAMP-produksjonen ikke kan være ønskelig hvis IBMX er utelatt fra analysen, vil flere holmer være nødvendig per rør for å oppnå cAMP data i lineære området av standardkurven).
  7. Etter 45 min pre-inkubering, fjernes mikrofugerør fra inkubatoren, hetten og puls-vortex hver prøve (mindre enn 0,5 sek.) Dette er for å blande opp insulin gradient som sannsynlig er blitt generert på grunn av holmene blir konsentrert i bunnen av røret. Hensyn må tas ikke til vortex for strengt, da dette kan ha negativ innvirkning på holmen stabilitet (Merk: Avkortetrør med holmer Kan forsiktig knipset eller omvendt hvis det ikke er mulig å pulsere-vortex forsiktig. Disse alternativene vil legge til tid i analysen, noe som bør vurderes ved planlegging av forsøket).
  8. Overfør hvert rør til en bordsentrifuge (RT) og spin til holmene nå 10000 rpm (7,000-7500 g) og deretter slå seg av umiddelbart.
  9. Bruk en P-1000 pipette for å fjerne det meste av Krebs i hvert mikro-sentrifugerør, og etterlater omtrent 10 til 15 pl av Krebs på holmen pellet. Bruk en P-20 pipette for å fjerne den delen nærmest holmen pellet. Dersom pelleten blir forstyrret, pipettere Krebs tilbake inn i røret, og re-sentrifugering.
    (Merk: Hvis eksperimentator finner det for vanskelig å fjerne alt av Krebs fra holmen pellet uten å forstyrre det, kan den siste 10-15 mL stå på og redegjort for i det totale volumet senere i protokollen.
  10. Skaff en tilstrekkelig mengde av flytende nitrogen i en isolert beholder til å knipse fryse prøvene etter inkubasjon.
  11. Ta prøvene ut av inkubatoren, cap, vortex hurtig (mindre enn 0,5 s) spinne mikrofugerør i en bordsentrifuge (RT) opp til 10 000 rpm (7,000-7500 g) og slår av umiddelbart. Dersom insulin eller en annen metabolitt er en ønsket nedstrøms applikasjon, å bruke en P-1000 pipette for å samle inn en prøve av mediet i et mikro-sentrifugerør og oppbevar ved -20 ° C inntil videre analyse. Ved stimulering materialet ikke er blitt samlet inn, kan det kastes.
    (Merk: IBMX er en sterk Forsterker som glukose stimulert insulinsekresjon (GSIS) Derfor kan GSIS resultatene fra cAMP stimulering medium ikke nøyaktig representerer den sanne effekten av spesifikke behandlinger på GSIS, spesielt hvis disse effektene er subtile.).
  12. Gjenta trinn 9.9 for å fjerne så mye stimulering medium som mulig uten å forstyrre holmen pellet. Snap fryse holmen pellet i flytende nitrogen når det er mindre enn 10-15 mL av Krebs igjen på holmen pellet. Når allPrøvene er snap frosset, lagre ved -80 ° C til cAMP måling.
  13. På dagen for cAMP besluttsomhet, forberede de nye lysis reagenser i henhold til produsentens protokoll. Tilsett 200 ml lysis reagens 1B til hvert mikro og vortex i full fart for 30 sek. La rørene sitter på is i 10 min, virvling hvert 2 min 30 sek. (Merk: Protokollen anbefaler å gjennomføre en mikroskopisk analyse med trypanblått å sikre cellelyse, men dette er ikke utført for holmer).
  14. Forbered arbeidsstandarder og sette opp EIA mikro akkurat som beskrevet i produsentens protokoll. Etter enzymsubstratet er blitt inkubert med mikroplater i 30 min, utfører den valg 1,0 M svovelsyre trinn, og bestemme absorbansen mikroplate brønnene ved 450 nm ved hjelp av en mikroplateleser.
  15. Syklisk AMP resultater vil bli registrert som fmol / brønn. Dette bør være normalisert til det totale volumet av den opprinnelige prøve (200 pl + enhverrest Krebs igjen på holmene fra trinn 9.9). Deretter Resultatene kan enten være normalisert til det totale antall øyer, noe som gir fmol cAMP produsert / holme eller lysat prøver kan bli utsatt for bicinchoninic syre (BCA) protein assay for å normalisere resultatene i totalt celleprotein (som gir fmol / mg protein) . Sistnevnte anbefales når holmen størrelser er inkonsekvent mellom prøvene, og kan være et surrogat for holme størrelse. Den Pierce BCA proteinanalysesettet har blitt brukt med suksess i denne protokollen, og krever bare 25 ml av prøven. BSA standarder bør være forberedt på lysis reagens 1B fra cAMP analysen kit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å sikre en høy holme avkastning under isolasjon, bør kirurgiske teknikker beskrevet i protokollen følges nøye. Selv om teknikkene som presenteres her vil være skreddersydd for hvert laboratorium, er det noen viktige skritt som vil føre til en vellykket isolasjon. For å gjøre den felles gallegang lett tilgjengelig, er det anbefalt at organene forskyves til høyre side av mus (figur 1). Videre vil dette tillate bukspyttkjertelen til å blåses opp med en mindre mengde av motstanden siden det vil være mindre vekt å begrense ekspansjon. Et annet kritisk punkt for å maksimere holme avkastning er ligering av den felles gallegang nær sphincter av Oddi (Tall 2A-C). Ligering av ytterligere fra Sphincter av Oddi kan resultere i en delvis inflasjon ved å redusere mengden av kollagenase-løsning kommer inn i hovedbukspyttkjertelkanalen. Dessuten vil en stramme knuten hindre kollagenase-løsning kommer inn i tarmen.

<p class = "jove_content"> En skikkelig snitt i felles gallegang bør være plassert langt nok unna bifurcation fra leveren, men nær nok for maksimal bukspyttkjertelen inflasjon (figur 3). Et snitt gjøres for nær til forgreningen kan føre til at strømningen av kollagen-løsningen inn i leveren. Når kollagenase-løsning kommer inn i lever, vil det miste sin mørke-rød farge og begynner å slå hvitaktig. Hvis dette skjer, trekk ut nålen og prøve en annen cannulation videre fra leveren. I tillegg bør den felles gallegang innsnitt bare være delvis ut gjennom kanalen (ca. 50%). Fullstendig skjærbehandling av kanalen vil gjøre det vanskelig å forsegle kanalen rundt nålespissen. En riktig innsnitt vil resultere i fullstendig stengning av kanalen rundt nålen, og produserer nok trykk til å fylle både den felles galle-og bukspyttkjertelen kanaler (figur 4A). Det er også viktig å sikre at nålen har inngått felles gallegang og ikke rundt skjede.Når nålen er riktig satt inn, bør 5 ml av kollagenaseoppløsning fylle bukspyttkjertelen, noe som skaper en marbleized vev.

Bukspyttkjertelen fjerningsprosessen skal utføres delikat å fremme maksimal holme utbytte (figur 5). Gjennomhulling av bukspyttkjertelen, kan resultere i en deflasjon og tap av kollagenase-løsning, noe som reduserer utbyttet holme. Skjære bukspyttkjertelen nær bindevev og andre organer vil hindre deflasjon. Dessuten er innhøsting av andre vev, så som bindevevet, samt bukspyttkjertelen ikke er et problem, som det vil bli fjernet i etterfølgende trinn. En skikkelig fjernet pancreas forblir oppblåst etter eksisjon før videre kollagenase fordøyelse (figur 6).

Forskjellige lag i Ficoll gradient vil føre til en ren holme forberedelse og skape en enklere miljø for å plukke holmer (figur 7). Gradienten sikrer separasjon av øyer fracelleavfall og bindevev som gjenstår etter fordøyelse og mesh sikt filtrering. Videre er dette trinnet avgjørende for å velge rene, sunne holmer for nedstrøms applikasjoner. Nærmere bestemt vil friske holmer være sfærisk i form og har en gylden brun til mørk brun senter (figur 8). Merk: Islets fra diabetiske mus vil være mye blekere i fargen, i samsvar med en redusert insulininnhold, og kan være bedre skilles fra acinar vev ved sin form, glans, og deres synlige nettverk av kapillærer. Eventuelle holmer knyttet til acinar vev bør ikke brukes og skal kastes. Videre bør større holmer som utvikler en mørk, nekrotisk sentrum etter en overnatting inkubasjon kastes som de ikke fungere skikkelig.

Som beskrevet i innledningen, er cAMP produksjon av en viktig komponent av β-cellefunksjon; Spesielt, med hensyn til inkretinsystemet handling. En fordel til protokollen som er beskrevet i dette oppfylt hod er at man samtidig kan få cAMP produksjon og glukosestimulert insulinsekresjon data. Vanligvis, virkningen av en agent på cAMP produksjon korrelerer direkte med dens innvirkning på insulin secretion 17. For enkle eksperimenter, har denne regelen gjelder ganske godt (se figur 9 for et eksempel). I den foreliggende protokoll, bruker vi IBMX (en fosfodiesterasehemmer) i våre behandlinger for å hindre nedbrytningen av cAMP, noe som gir den totale produksjonen av cAMP.

Figur 1
Figur 1. Fortrenge indre organer. Posisjonering de indre organer mot høyre side av musen skaper en enklere arbeidsmiljøet og tillater bukspyttkjertelen rom for å ekspandere under oppblåsning.

Figur 2 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig2.jpg "/>
Figur 2. Knytte av sphincter av Oddi (AC). Avbildet her er inngangen til den felles gallegang til tynntarmen ved sphincter av Oddi. Binde av den felles gallegang på sphincter av Oddi hindrer kollagenaseoppløsning kommer inn i tarmen.

Figur 3
Fig. 3. Felles gallegang innsnitt. Det er best å foreta et kutt i den felles gallegang svakt distal til forgreningen inn i leveren for å hindre strøm av collagenase-løsning inn i leveren.

0374/50374fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50374/50374fig4.jpg "/>
Figur 4. Cannulation av den felles gallegang av en avstumpet 30 G nål og bukspyttkjertel inflasjon. A) 30 G nål settes inn i den felles gallegang, noe som skaper en tetning rundt nålespissen. Det er viktig å kontrollere og å merke seg at nålen er satt inn i den felles gallegang og ikke den omliggende kappen. En ordentlig satt nål vil ha en ugjennomsiktig utseende. B) En skikkelig bukspyttkjertelen inflasjon vil fylle med ca 3-5 ml av collagenase løsning og har en marmorert utseende.

Figur 5
Figur 5. Fjerningen av bukspyttkjertelen. A) Et første snitt gjort med en buet saks oppstår nær Sphincter av Oddi. Den innledende removal begynner i retning av magen være forsiktig for ikke å punktere bukspyttkjertelen. B) Det siste trinnet er å fjerne bukspyttkjertelen fra bindevevet på tynntarmen, og de ​​siste forbindelser til bukhulen.

Figur 6
Figur 6. De oppblåste bukspyttkjertelen. Vellykket pancreas fjerning vil gi en bukspyttkjertel perfundert med collagenase-løsning. Dårlig eksisjon vil forlate en mindre, deflatert bukspyttkjertelen.

Figur 7
Figur 7. Fire lag av Ficoll-gradient. De fire distinkte lag representerer en different Ficoll densitet fra 25% ved bunnen til 11% på toppen. Den distinkte lagdeling er viktig å fjerne rusk og eksokrin stillstand fra holmer.

Figur 8
Figur 8. Holme utvalg. Sunn holmer tendens til å ha en gylden brun til mørk brun farge med en rund sfærisk form og er ikke koblet til acinøs vev. Etter en overnatting inkubasjon (16-20 timer) en nekrotisk sentrum utvikler seg i større holmer, som skal ekskluderes fra eksperimenter.

Figur 9
Figur 9. Representative høykvalitets cAMP produksjonsresultater, som viser at utskilt insulin kan måles fra den cAMP stimuleringsmediet. A) Isolerte holmer fra villtype-eller gen-knockout mus ble stimulert med 11,1 mM glukose og intracellulære cAMP-produksjonen ble målt og normalisert til den totale cellulære protein. B) Utskilt insulin ble målt ved anvendelse av en standard ELISA-insulin, og også normalisert til total cellulær protein. I mange tilfeller relaterer endringen i cAMP produksjon direkte med forstørrelse i glukosestimulert insulinsekresjon. n = 3 for hver gruppe; *, P <0,05. Dette tallet ble tilpasset fra forskning publisert i Kimple et al 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med utbredelsen av diabetes anslått til å påvirke 7,7% av verdens befolkning, er kravet om nye forskningsteknikker viktig å både forstå og behandle diabetes 18. Den nåværende holme isolasjon er et veletablert protokollen som brukes for in vitro eksperimentering og har blitt presentert tidligere med litt modifikasjoner 11,14,16. Selv insulinsekresjon er en vanlig nedstrøms søknad om isolerte øyer, med fokus på oppstrøms bestanddeler, for eksempel cAMP, kan bidra til å avgrense mekanismer poten insulin produksjon og sekresjon.

Valget av eutanasi må gjøres møysommelig å sikre både human behandling av forsøksdyr samt integriteten av eksperimentelle målinger. For holme isolasjon, er exsanguination under narkose vår foretrukne metoden for aktiv dødshjelp som det lar holme perfusjon med oksygenrikt blod for maksimal mengde tid før bukspyttkjerteleninflasjon. CO 2 inhalasjon er et dårlig valg for aktiv dødshjelp, som om det er utført i henhold til humane protokoller, eksponerer det holmer til dårlig oksygenrikt blod i minst 5-6 min før prosedyren kan begynne. Cervical dislokasjon uten bedøvelse kan være en akseptabel metode med vitenskapelig begrunnelse, men dette ville kreve betydelig erfaring med både fremgangsmåten ifølge eutanasi, og muse disseksjon og bukspyttkjertel inflasjon fremgangsmåte for å sikre en human dØd og bevaring av holme funksjon. I valg exsanguination under narkose, er Avertin den foretrukne bedøvelse i denne protokollen. Det spesielle valg av Avertin, er at det er en hurtigvirkende og dyp bedøvelse med mange fordeler i forhold til andre vanlig brukte bedøvelse. Først gjør Avertin ikke strekke blodkar og indusere nitrogenoksid utgivelse, som gjør isofluran 19. Bukspyttkjertelen holmer er svært vascularized, og dermed deres biologi kan bli negativt påvirket av isofluran exposure. For det andre betyr Avertin ikke overdrevent øke blodglukosenivåer i fravær av glukose-injeksjon, som kan ketamin / xylazin, noe som har vist seg å øke blodglukose ved 167% opp til en time etter injeksjon 20. Til slutt, er det terapeutiske området for pentobarbital meget smale i mus 21, noe som øker sjansen for hypoksisk skade på holmer.

I den foreliggende protokoll, er bruken av sutur tråden for å ligere den felles gallegang nær Sphincter av Oddi benyttes som et alternativ til en hemostat. Tråden metoden gir større manøvrerbarhet av felles gallegang og bidrar til å posisjonere nålen for cannulation. Men bruken av tråden under dette trinnet krever holde to objekter (tråd og sprøyte) mens pinsetten gir frie hender til å plassere gallegang. Begge isolasjonsteknikker gi et tilsvarende antall og levedyktige holmer som vist med tidligere arbeid i vår lab og andre 10,22. Videre cannulation needle størrelse, posisjon og vinkel vil avhenge av brukerens preferanser. Nærmere bestemt er en 30 G nål som brukes i denne protokollen, men andre størrelser kan være nødvendig på grunnlag av belastningen eller genetisk bakgrunn. For eksempel, BTBR mus har en veldig sprøtt felles gallegang og en større dimensjon kan gi en større tetning rundt nålespissen (MEK, personlige observasjoner). Dermed er det anbefalt å ha avstumpet kanyle nåler av forskjellige størrelser på hånden under operasjonen, klar til å slå ut hvis det er nødvendig. Plasseringen av nålen i den felles gallegang vil også i stor grad påvirke holmen yield. Hvis nålen er plassert i front av bifurkasjonen av den felles gallegang, vil kollagenase løsning går inn i leveren og resultere i en dårlig inflasjon. Men hvis nålen er plassert for nær sphincter av Oddi, vil en delvis bukspyttkjertelen inflasjon oppstår, redusere antall isolerte småøyer. Trial bukspyttkjertelen inflations med ulike pinnestørrelser og steder på felles gallegang vil være krav som stillesrød å tilpasse dagens prosedyre og maksimere holme yield.

En annen viktig komponent i denne fremgangsmåten for å øke antallet av levedyktige øyer er å fremstille alle reagenser i henhold til protokoller instruksjoner. Gassing bufferne med 95% O2 / 5% CO2 for å øke oksygenering kan kontakte en faktor i holme overlevelse gjennom protokollen. Tidligere arbeid viser at oksygenkonsentrasjonen avtar mot det indre av holmen, potensielt redusere energiinnholdet i β-celler 23. Dette kan være tydelig etter en overnatting inkubasjon som en mørk, nekrotiske senteret vil vises i dyrkede holmer, samkjøre med en nedgang i in vitro respons. Således vil levere nok oksygen bidra til å øke holme antall og levedyktighet i løpet av isolasjon og inn i det over natten, normoksiske inkubering prosessen. I tillegg vil korrekt fremstilling av collagenase-løsning forbedre fordøyelsen av pankreatisk vev og frigjøre than holmer fra omkringliggende vev. Hvis collage konsentrasjonen er for lav, ikke bare vil holmen avkastning være lav, men eksokrin acinar vev kan forbli festet til holmer, negativt påvirker nedstrømsapplikasjoner. På den annen side kan for høy for en kollagenase konsentrasjonen ødelegge holmene. Derfor vil skikkelig kvalitetskontroll tiltak for å sikre collagenase fordøyelsen effektivitet uten ødeleggelse av holmer fremme større utbytter.

Kollagenase isolert fra Clostridium histolyticum er enzymet brukes for å frigjøre holmer fra bukspyttkjertelen vev i denne protokollen. Den ureproduserbarhet av enzymatisk aktivitet mellom forskjellige partier av kollagenase har potensial til å hindre mengden og / eller kvaliteten av isolerte øyer. I den foreliggende protokoll, hvert nytt parti med collagenase enzymet går gjennom en intern kvalitetskontroll sjekk for å fastslå både kvantitet og funksjonalitet av holmer før de er utsatt for å studere. Derfor downstrEAM programmer og mye variasjon må vurderes når du velger et enzym for holme isolasjon. Liberase ® (Roche), en renset kollagenaseaktivitet blanding, er et annet fordøyelsesenzym alternativ som har vært vellykket i mange tilfeller; i særdeleshet, i å skaffe høyere mengder av isolerte holmer 24,25. Imidlertid kan bruk av Liberase ikke være gunstig for å isolere funksjonelle holmer, da det kan hindre in vitro-funksjon 26.

Mange begrensninger eksisterer i dagens holme isolasjon og cAMP bestemmelse prosedyrer som kan hindre nedstrøms applikasjoner. Som nevnt tidligere, BTBR mus har en svært skjør felles gallegang, noe som øker vanskelighetsgraden av bukspyttkjertelen inflasjon og påfølgende holme isolasjon. Derfor kan pooling holmen forberedelser fra flere mus være nødvendig, så mange in vitro analyser, blant annet beskrevet cAMP-analysen, krever mange holmer per replikere. I tillegg bruker IBMX i cAMP-analysen blokks fosfodiesteraseaktiviteten, noe som gir en lese-out av cAMP produksjon. Tilsetting av IBMX kan ikke være tilrådelig i tilfeller der sykling av cAMP produksjon og nedbrytning er viktig for cellulære signaler. Imidlertid fjerner IBMX fra denne protokollen vesentlig senker den endelige cAMP-innhold av holmene, som kan kreve tilsetning av mange flere øyer pr replikere for å oppnå meningsfulle cAMP-verdier i EIA.

Denne protokoll er et viktig verktøy for en holme biologi laboratorium eller de som er interessert i det endokrine bukspyttkjertelen. CAMP komponent til denne protokollen er bare ett av mange i vitro-forsøk å forstå hvordan holme manipulasjon gjennom ulike behandlinger kan forsterke eller sløv insulinsekresjon. Selv om det meste av forskningen utnytte holmer primært fokuserer på β-celle insulinsekresjon, kan andre celletyper bli vurdert for sine dynamiske relasjoner innenfor holmen fire. I kombinasjon med andre in vitro-og in vivo modeller, vil holme eksperimentering belyse mekanismene bak ødeleggende bukspyttkjertelen relaterte sykdommer som diabetes og insulinomer. Viktigst, vil forstå hvordan farmasøytiske midler direkte påvirke holmer øke effekten av behandlingen og bistand i oversettelse til en in vivo-modell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke Renee L. Pasker og Harpreet K. Brar for sakkyndig teknisk bistand på protokollen beskrevet i dette arbeidet. Videre ønsker vi å erkjenne veiledning av Christopher B. Newgard ved Duke University og Alan D. Attie ved University of Wisconsin-Madison, sammen med støtte fra sine laboratorie medlemmer, som tillot oss tid og støtte som er nødvendig for å optimalisere beskrevet protokoller. Spesielt vil vi takke Hans Hohmeier, Danhong Lu, og Helena Winfield i Newgard Laboratory og Mary Rabaglia i Attie Laboratory for produktive diskusjoner og råd. Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend DK080845 og Juvenile Diabetes 594
Research Foundation stipend 17-2011-608 (til MEK)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase from Clostridium histolyticum suitable for isolating active islets Sigma-Aldrich C7657
Ficoll 400 Sigma-Aldrich F9378
Hanks Balanced Salt Solution 10X Invitrogen (Gibco) 14065-056
HEPES Sigma-Aldrich H3375
RPMI 1640 (powder) Invitrogen (Gibco) 31800-022
Albumin from Bovine Serum (BSA) Sigma-Aldrich A7888
3/0 Silk Suture Thread Fine Science Tools 18020-30
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10
0.8 mm Forceps   Fine Science Tools 11050-10
Curved Scissors Fine Science Tools 14061-10
Vannas-Tübingen Spring Scissors - Straight/Sharp/8.5 cm/5 mm Cutting Edge Fine Science Tools 15003-08
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14002-14
5 ml BD Luer-Lok Syringe BD 309646
1 ml BD syringe BD 309628
30 G BD Needle 1/2" Length BD 305106
27 G BD Needle 1/2" Length BD 305109
Sharpening Stone Fine Science Tools 29008-01
2-2-2-tribromoethanol Sigma-Aldrich T48402-25G
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 240486-100mL
Sodium Chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S9888
Potassium Chloride Sigma-Aldrich P3911
Monopotassium Phosphate (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662
Sodium Bicarbonate (NaCHO3) Sigma-Aldrich S6014
CaCl2·2H2O Sigma-Aldrich C3881
MgSO4·7H2O Sigma-Aldrich M9397
Penicillin-Streptomycin Invitrogen (Gibco) 15140-122
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (H.I. FBS) Fisher Scientific SH30088.03HI
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich 5879-100MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cryer, P. E. Hypoglycaemia: the limiting factor in the glycaemic management of Type I and Type II diabetes. Diabetologia. 45, 937-948 (2002).
  2. Alberti, K. G., Zimmet, P. Z. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 15, 539-553 (1998).
  3. Muoio, D. M., Newgard, C. B. Mechanisms of disease: molecular and metabolic mechanisms of insulin resistance and beta-cell failure in type 2 diabetes. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 193-205 (2008).
  4. Kelly, C., McClenaghan, N. H., Flatt, P. R. Role of islet structure and cellular interactions in the control of insulin secretion. Islets. 3, 41-47 (2011).
  5. Meda, P., Halban, P., Perrelet, A., Renold, A. E., Orci, L. Gap junction development is correlated with insulin content in the pancreatic B cell. Science. 209, 1026-1028 (1980).
  6. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49, 424-430 (2000).
  7. Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228, 121-128 (2004).
  8. Field, J. B. Extraction of insulin by liver. Annu Rev Med. 24, 309-314 (1973).
  9. Emmanouel, D. S., et al. Glucagon metabolism in the rat. J Clin Invest. 62, 6-13 (1978).
  10. Kimple, M. E., et al. Deletion of GalphaZ protein protects against diet-induced glucose intolerance via expansion of beta-cell mass. J Biol Chem. 287, 20344-20355 (2012).
  11. Rabaglia, M. E., et al. Alpha-Ketoisocaproate-induced hypersecretion of insulin by islets from diabetes-susceptible mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 218-224 (2005).
  12. Collins, S. C., Salehi, A., Eliasson, L., Olofsson, C. S., Rorsman, P. Long-term exposure of mouse pancreatic islets to oleate or palmitate results in reduced glucose induced somatostatin and oversecretion of glucagon. Diabetologia. 51, 1689-1693 (2008).
  13. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing Replication and Beta Cell Function in Adenovirally-transduced Isolated Rodent Islets. J Vis Exp. , (2012).
  14. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. , (2007).
  15. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice. J Vis Exp. , (2007).
  16. Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. , (2011).
  17. Kimple, M. E., et al. A role for G(z) in pancreatic islet beta-cell biology. J Biol Chem. 280, 31708-31713 (2005).
  18. Shaw, J. E., Sicree, R. A., Zimmet, P. Z. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  19. Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. Br J Anaesth. 79, 84-87 (1997).
  20. Brown, E. T., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Vis Neurosci. 22, 615-618 (2005).
  21. Vaupel, D. B., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 230, 20-27 (1984).
  22. Davis, D. B., et al. FoxM1 is up-regulated by obesity and stimulates beta-cell proliferation. Mol Endocrinol. 24, 1822-1834 (2010).
  23. Dionne, K. E., Colton, C. K., Yarmush, M. L. Effect of hypoxia on insulin secretion by isolated rat and canine islets of Langerhans. Diabetes. 42, 12-21 (1993).
  24. Linetsky, E., et al. Improved human islet isolation using a new enzyme blend, liberase. Diabetes. 46, 1120-1123 (1997).
  25. Vaithilingam, V., Sundaram, G., Tuch, B. E. Islet cell transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 13, 633-638 (2008).
  26. Brandhorst, H., et al. Large-scale comparison of Liberase HI and collagenase NB1 utilized for human islet isolation. Cell Transplant. 19, 3-8 (2010).

Tags

Fysiologi holme isolasjon insulinsekresjon β-celle diabetes cAMP produksjon mus
En metode for mus bukspyttkjertelens Isolering og Intracellulær cAMP Bestemmelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Neuman, J. C., Truchan, N. A.,… More

Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination. J. Vis. Exp. (88), e50374, doi:10.3791/50374 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter