Summary
Nous avons utilisé des échantillons de la rétine rétinectomie pour une analyse transcriptomique de décollement de la rétine. Nous avons développé une procédure qui permet la conservation d'ARN entre les blocs opératoires et les laboratoires. Nous avons standardisé un protocole pour purifier l'ARN par ultracentrifugation de chlorure de césium pour s'assurer que les ARN purifiés sont adaptés à l'analyse des microréseaux.
Abstract
Décollement de la rétine (RD) décrit une séparation de la rétine neurosensorielle de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR). L'EPR est essentiel pour la fonction normale des neurones sensibles à la lumière, les photorécepteurs. Détachement de la rétine de l'EPR crée un espace physique qui est rempli de fluide extracellulaire. RD initie événements indésirables cellulaires et moléculaires qui affectent à la fois la rétine neurosensorielle et l'EPR depuis l'échange physiologique des ions et des métabolites est gravement perturbé. La conséquence de vision est liée à la durée du détachement depuis un réapposition rapide des deux tissus entraîne la restauration de la vision 1. Le traitement de la RD est exclusivement chirurgical. L'élimination du corps vitré (vitrectomie) est suivie de l'enlèvement partie non essentielle de la rétine autour de la zone individuelle de favoriser un décollement de rétine. Les spécimens rétiniennes enlevées sont res nullius (rien) et, normalement, par conséquent rejetées.Pour récupérer l'ARN à partir de ces prélèvements chirurgicaux, nous avons développé la procédure Journal qui permet la conservation d'ARN pendant le transfert du bloc opératoire au laboratoire. Nous avons également un protocole standardisé pour purifier l'ARN par ultracentrifugation de chlorure de césium pour s'assurer que les ARN purifiés sont adaptés à l'analyse de l'expression génique globale. La qualité de l'ARN a été validé à la fois par RT-PCR et l'analyse des microréseaux. L'analyse des données montre une implication simultanée de l'inflammation et la dégénérescence des photorécepteurs au cours de RD.
Introduction
L'objectif thérapeutique principal de décollement de la rétine (RD) est de trouver un moyen de limiter les dommages aux cellules des photorécepteurs et inflammation de la rétine résultant de la séparation des photorécepteurs à partir des cellules épithéliales pigmentées de la rétine. Au cours de RD, les cellules RPE sont activés, migrer, dédifférencier et prolifèrent à la surface de la rétine décollée, exerçant des forces contractiles conduisant à des complications. Analyse transcriptomique de la RD est un moyen d'identifier les gènes cibles avec une expression modifiée suite RD et donc futures molécules thérapeutiques qui pourraient améliorer le résultat visuel final association avec la chirurgie. Il est bien connu d'acide ribonucléique (ARN) n'est pas stable comme l'acide désoxyribonucléique (ADN), ce dernier étant largement utilisé pour des études génétiques, sa stabilité avait permis le séquençage du génome de Neandertal à partir d'échantillons paléontologiques de plus de 30.000 ans 2. Transcription de l'ADN des gènes du génome en ARN messager est l'processus important dans l'expression du gène, et l'ARNm est labile en vue de constituer un signal. ARN sont très rapidement dégradés par les enzymes RNAse qui se terminent le signal. Lorsque les tissus sont isolés d'un organisme, les ARN sont très souvent dégradés avant l'expression est étudiée dans un laboratoire de recherche. ARN dégradé n'est pas adapté pour l'expression du gène de l'analyse. Parce que le personnel du laboratoire ne peut pas participer à la chirurgie, nous avons développé une procédure qui est simple et ne requiert que le chirurgien de récupérer les tissus dans une solution RNAse approprié. Les ARN des tissus est stable et peuvent être analysées sans aucun signe de dégradation après 72 heures à la température ambiante dans cette solution. Les ARN à partir d'échantillons sont purifiés par une méthode standardisée comportant une ultracentrifugation sur gradient de chlorure de césium, après avoir été transféré au laboratoire 3. Ensuite, la qualité des ARN est évaluée par électrophorèse sur gel d'agarose et par RT-PCR. Le protocole de purification d'ARN a leavantage de séparer les molécules en fonction de leur densité qui est différente de l'ADN et de l'ARN et qui donne à l'ARN n'est pas contaminé par une molécule d'ADN qui vont générer des signaux d'artefact dans des études d'expression génique. En outre, les ARN de transfert (ARNt), qui sont quantitativement ARN les plus abondants dans une cellule, sont séparés selon la même propriété physique de l'ARN ribosomal (ARNr) et les ARN messagers (ARNm), ces deux derniers étant l' produit final du procédé de purification. La suppression de l'ARNt de la préparation est utile car la plupart des protocoles d'analyse microarray impliqué l'utilisation de transcriptases inverses et ARN polymérases qui sont inhibées par l'ARNt 4-6. L'ARN purifié à partir de prélèvements chirurgicaux sont étiquetés en utilisant le protocole standard et hybridées à une biopuce et les résultats sont analysés par deux méthodes complémentaires, la méthode du taux de fausses découvertes, et en utilisant une nouvelle méthode basée sur l'information mutuelle et visualisation enzed sur le serveur Web Retinobase 7,8.
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Protocol
1. Journal: Procédure pour récupérer les échantillons du bloc opératoire
Dans le laboratoire
- Obtenez un contrat d'importation de la compagnie de livraison express.
- Remplissez 10 (ou 25) des formulaires d'expédition avec l'adresse postale du laboratoire indiquant la personne de contact dans le laboratoire (numéro de téléphone et adresse e-mail).
- Préparation 10 (ou 25) des formes d'échantillons numérotés de 1 à 10 (ou 25). Ces formulaires comprennent des espaces dédiés à informer sur a) l'identification anonyme du patient, b) la date de la chirurgie et c) des observations complémentaires le chirurgien aimeraient ajouter. Préparez-10 (ou 25) enveloppes matelassées (150 x 210 mm).
- Préparé en utilisant RNAse réactifs 25 (ou 65) ml de chlorure de guanidine 6 M dans de diéthyle (DEPC) traitée H 2 O (GHCl).
- Remplissez 10 ou 25 numéros 5 tubes à fond rond en polyéthylène stériles ml à 2,4 ml de solution GHCl.
- Utilisé du gaz argon pour remplir la partie supérieure de ces tubes, de presse tightly sur le bouchon pour éviter l'oxydation de la solution GHCl sur plusieurs années de stockage dans l'armoire chirurgicale.
- Présentez tous les tubes de 5 ml dans un tube de 50 ml stérile en polypropylène à fond conique avec bouchon à vis. Utilisez un morceau de mouchoir en papier propre pour maintenir le tube de 5 ml dans le tube de 50 ml, fermer le tube.
- Placer les tubes de 50 ml sur un support en polystyrène et la crémaillère dans une boîte en carton avec des enveloppes matelassées, les bordereaux de livraison, les formes d'échantillons.
- Collez les instructions (voir: 1.12 à 1.19) à l'intérieur du couvercle de la boîte en carton pour faciliter leur lecture.
- Envoyez le carton par mail à la personne de contact à l'hôpital.
À l'hôpital
- Apportez la boîte en carton de l'armoire chirurgicale au bloc opératoire. Remarque Attention: si la procédure implique un patient à risque immunitaire, le carton ne doit pas être porté à la salle d'opération.
- Pendant la chirurgie, placez le spécim rétiniennefr en numérotée 5 ml en polypropylène stérile rempli de solution GHCl. Fermez hermétiquement le tube.
- Retour brièvement le tube.
- Placer le tube sur le tube de bascule de sang pendant 10 min.
- Remplissez le formulaire échantillon numéroté accompagne.
- Signaler le numéro d'identification sur le tube de ml correspondant numéroté 50.
- Introduire le tube de 5 ml avec la pièce opératoire dans le tube 50 ml, remplacer les tissus de papier et visser le tube.
- Introduire le tube et l'exemple de formulaire rempli en elle dans une des enveloppes matelassées accompagnement. Fermez-le.
- Appelez la société de livraison express pour les ramasser.
2. ARN Purification
Dans le laboratoire
- Homogénéiser le spécimen dans sa polypropylène tube de 5 ml avec une solution GHCl avec un homogénéisateur pendant 1 minute tout en déplaçant le tube de haut en bas.
- Ajouter 270 ul de 2 M d'acétate de potassium pH 5,0. Agiter vigoureusement pendant 10 min en plaçant le tube sur un agitateur dans sonposition horizontale (420 min -1).
- Centrifuger 10 min à 5000 tpm (6500 x g) à 20 ° C.
- Aspirer doucement la fraction soluble sans perturber le culot.
- Transférer dans un tube stérile de 14 ml.
- Ajouter 5,3 ml de Tris 100 mM pH 8,0, N-Lauroylsarcosine 1%.
- Ajouter 3,2 g de chlorure de césium (CsCl) et mélanger le tube au vortex.
- Ajouter 1,8 ml d'acide CsCl / éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans un tube de centrifugation ml stérile 11 de polyallomère.
- Avec une pipette Pasteur 10 ml stérile, transférer la solution d'ARN sur 1,8 ml de CsCl / EDTA en glissant doucement sur le bord du tube pour ne pas perturber le coussin de densité.
- Placer les tubes (un second tube contenant les tampons sans rétine si nécessaire) dans le rotor.
- Centrifugeuse 24 h à 32.000 tours par minute (225,000 xg) à 20 ° C.
- Retirez la partie supérieure de la solution avec une pipette Pasteur stérile, et jetez-le.
- Retirer progressivement tout en vérifiant l'moment où l'ADN (visqueuse) est aspiré avec une seconde pipette Pasteur stérile, et jetez-le.
- Retirer la solution restante en prenant soin de ne pas libérer le culot d'ARN avec un troisième pipette Pasteur stérile.
- L'article de la base du tube avec un scalpel flamme stérilisé, puis mettre la partie restante du tube à l'envers sur une gaze stérile.
- Inverser le tube et rincer délicatement avec 160 pi de GHCl.
- Laisser sécher le culot pendant 10 min.
- Reprendre le culot dans 150 ul d'(10 mM Tris pH 7,5 à 1 mM EDTA - 0,1% SDS).
- Transférer la solution dans un ml microtube stérile 2, puis récolter le culot résiduel avec 30 pl d'(10 mM Tris pH 7,5 à 1 mM EDTA - 0,1% SDS).
- Ajouter 150 pi de (10 mM Tris pH 7,5 à 1 mM EDTA).
- Ajouter 30 ul de 3 M d'acétate de sodium pH 5,0, vortex le tube.
- Ajouter 900 ul d'éthanol à 100% (-20 ° C), le tube vortex.
- Placez le tube 30 min dans la glace fondante.
- Centrifuge le tube 30 min à 15000 rpm à 4 ° C.
- Aspirer délicatement la fraction soluble, et jetez-le.
- Ajouter 500 ul d'éthanol à 70% (RT), vortex le tube.
- Centrifuger le tube 20 min à 15000 rpm (18,000 xg) à 4 ° C.
- Répétez l'étape de rinçage (70% d'éthanol).
- Centrifuger brièvement et éliminer le reste d'éthanol avec une pipette P200.
- Laissez-le sécher à l'air granulés pendant 10 min.
- Reprendre le culot dans 50 ul traitée par DEPC H 2 O.
- Mélanger vigoureusement au vortex.
- Incuber 15 minutes à 45 ° C dans un bain d'eau.
3. Analyse des ARN par électrophorèse sur gel
- Verser un gel d'agarose à l'intérieur d'une hotte chimique.
- Dans un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml, ajouter 2 ul d'ARN à analyser et 6,4 pi de tampon de préparation de l'échantillon.
- Dans un second tube de 1,5 ml, ajouter 3 pi de normes d'ARN et 9,6 pi de tampon de préparation de l'échantillon.
- Chauffer les tubes 15 min à 65 ° C, Les mettre sur la glace.
- Ajouter 1 ul de bromure d'éthidium (EB) d'un tampon de charge sans colorant dans le tube d'échantillon d'ARN et 1 ul de tampon de charge EB avec le colorant dans le tube normes ARN.
- Exécuter le gel sous 80 - 100 V dans une hotte chimique en fonctionnement tampon, jusqu'à ce que l'un des colorants (bleu de bromophénol) atteint les 2/3 de la partie inférieure du gel.
- Rincer le gel deux fois 15 min avec 250 ml de traitée au DEPC 2x SSC.
- Prendre une image numérisée sous illumination UV.
- On calcule le rapport entre la bande supérieure (ARNr 23S) et la bande inférieure (ARNr 16S).
4. La purification finale de l'ARN
- Réglez le volume de l'échantillon d'ARN à 100 pi avec traitée par DEPC H 2 O (si nécessaire).
- Ajouter 100 ul d'acide phénol (1 ml de phénol saturé en traitée par DEPC H 2 O + 130 ul de 50 mM d'acétate de sodium, pH 5,2), vortex vigoureusement.
- Centrifuger le 10 min à 13000 rpm (15.000 xg) à température ambiante.
- Recover soigneusement et transférer la phase aqueuse (phase supérieure) dans un roman, un tube à centrifuger stérile de 1,5 ml.
- Ajouter 10 ul de 3 M d'acétate de sodium, pH 5,2 et 250 pi d'éthanol à 100% (-20 ° C).
- Incuber le tube 30 min dans la fonte des glaces.
- Centrifuger le tube 30 min à 14000 rpm (18,000 xg) à 4 ° C.
- Aspirer soigneusement la fraction soluble, et jetez-le.
- Ajouter 500 ul d'éthanol à 70% (à température ambiante), et le tube vortex.
- Centrifuger le tube 20 min à 14000 rpm (18,000 xg) à 4 ° C.
- Répétez l'étape de rinçage (70% d'éthanol).
- Centrifuger brièvement et éliminer le reste d'éthanol avec une pipette P200.
- Laissez sécher à l'air le culot pendant 10 min.
- Reprendre le culot dans 50 ul d'traitée par DEPC H 2 O.
- Incuber le tube puis 15 min à 45 ° C.
- Mesurer l'absorbance (Abs) à 260 nm et 280 nm sur 2 pi de l'échantillon d'ARN. Calculé le Abs260/Abs280 de ratio. <li> Magasin l'échantillon d'ARN à -80 ° C (stable depuis plusieurs années).
5. Les solutions et les procédures de nettoyage
- Acétate de potassium 2 M, pH 5.0: Dissoudre 19,6 g d'acétate de potassium dans 70 ml de DEPC traitées H 2 O. Nettoyez la sonde de pH-mètre en le trempant dans de 1M NaOH pendant 15 min, suivi de 5 rinçages avec traitée par DEPC H 2 O. Ajuster le pH à 5,0 avec de l'acide acétique puis régler le volume à 100 ml avec DEPC traitées H 2 O.
- Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, N-Lauroylsarcosine 1%: Dissoudre 2 g de N-Lauroylsarcosine (sous une hotte) dans 40 ml de Tris-base 0,5 M pH 8,0. Réglez le volume à 200 ml avec DEPC traitées H 2 O.) CsCl / EDTA: 96 g de CsCl dans 50 ml 10 mM EDTA pH 7,5 préparé avec DEPC traitées H 2 O. Autoclave et ajuster le volume à 100 ml avec traitée par DEPC H 2 O. Vérifiez pH <7,5.
- Gel d'agarose 1%: Mettre 1 g d'agarose dans 62 ml traitée au DEPC H 2 O. Faire bouillir dans un four à micro-ondes. Ajouter 18 ml de 12,3 Mformaldéhyde, 20 ml de MOPS 5x. Verser l'intérieur d'une hotte chimique.
- Préparation d'échantillons Tampon: Pour être improvisé préparé. Mélanger dans une hotte 8 ul chimique de MOPS 5x, 16 pl de 12,3 M formaldéhyde et 40 pi de formamide.
- Chargement tampon EB (sans colorant): Pour être improvisé préparé. Ajouter 4 pi 10 mg / ml de bromure d'éthidium dans 20 ul de 80% de glycérol préparé avec traitée par DEPC H 2 O.
- Chargement tampon EB (avec colorant): Pour être improvisé préparé. Ajouter 2 ul 10 mg / ml de bromure d'éthidium dans 10 ul de 80% de glycérol contenant 0,25% de xylène cyanol, 0,25% bleu de bromophénol avec DEPC traitées H 2 O.
- Courir tampon: à 60 ml MOPS 5x, ajouter 54 ml de 12,3 M formaldéhyde et 186 ml d'traitée par DEPC H 2 O.
- DEPC traitées H 2 O: eau distillée incuber avec 0,1% v / v diéthylpyrocarbonate pendant 2 heures à 37 ° C avec agitation. Stériliser à l'autoclave.
- Nettoyage de l'homogénéisation: Ajouter 25 ml de solution de nettoyage (RBS) à 1 L d'DEPCtraitée H 2 O, et plonger l'axe 1 min en remuant. Incuber 2 heures à 60 ° C. Rincez abondamment à l'traitée par DEPC H 2 O Wrap l'instrument en aluminium et mis dans la boîte de l'instrument. Enveloppez la boîte. Stériliser à l'autoclave.
- Nettoyage de l'appareil d'électrophorèse: Laver l'appareil, le plateau et le peigne 15 puits. Incuber 15 minutes à 3% de peroxyde d'hydrogène. Rincer une fois avec de l'éthanol à 100%. Air sec.
- Nettoyage des plats en verre: Nettoyer la vaisselle en verre RBS 2% de toute la nuit, puis rincer avec de l'eau distillée avant la stérilisation à 200 ° C.
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Representative Results
La procédure Journal (Figure 1) nous permet de récupérer des échantillons de rétine du bloc opératoire à l'ARN purifié, et d'analyser le transcriptome de décollement de la rétine. Résultats de décollement de la rétine dans la régulation positive de la MCP1 chimiotactique des monocytes gène CCL2, et dans la diminution de l'expression de la tige photorécepteur transduction gène GNAT1, le cône ondes courtes opsin OPN1SW, et le homéogène CRX (Figure 2). L'induction de CCL2 est issu de l'inflammation 9, tandis que la réduction concomitante de GNAT1, OPN1SW et CRX est le résultat de la dégénérescence des photorécepteurs, les deux cônes et des bâtonnets. La perte de cônes peut résulter de la perte d'expression de NXNL1, qui code pour un facteur Rod dérivé Cone viabilité 7,10, ou son RdCVF2 paralogue, qui est codée par le gène NXNL2. Étonnamment, le messager ex NXNL2istes dans deux versions différentes. Version 1 (NM_001161625.1) est une séquence codante issue de l'analyse phylogénique, mais n'a pas déjà été signalé à être exprimés 11, tandis que la version 2 (NM_145283.2), pour lequel plusieurs EST a été identifié est un ARNm anormal qui exclut la seconde exon du gène et contient un second exon alternatif, contenant une séquence Alu répétitif, situé à plus de 40 kb dans le sens 3 '(figure 3a). En utilisant l'ARN purifiés à partir de la rétine humaine, nous pouvons maintenant rapporté que les deux versions de l'ARNm NXNL2 sont exprimés (Figure 3b).
Figure 1. Image de la boîte en carton contenant les pièces fournies par le Journal.
Figure 2. Représentation de l'expression d'un sous-ensemble de gènes en utilisant Retinobase. Pour les gènes affichées dans ces graphiques radar, CCL2, GNAT1, OPN1SW et CRX, la partie droite de la figure correspond à l'ARN à partir d'échantillons de décollement de la rétine (RD1-18), tandis que la partie gauche (NR1-18) sont des ARN contrôles appariés pour l'âge à partir préparés en utilisant des rétines post-mortem. Procédé de graphe radar est décrit au point 8.
Figure 3. Expression des deux version du gène NXNL2 dans la rétine. une représentation. schématique du gène NXNL2 sur le chromosome 9. NXNL2v1 a deux exons qui sont prévus par l'alignement multiple et l'analyse phylogénique. NXNL2v2 manque que le deuxième exon et comprend une alternative exon 2 ', situé> 40 kb en 3' direction. Til flèches indiquent la position de l'amorce utilisée. b. RT-PCR montrant l'expression des deux NXNL2v1 et NXNL2v2 dans la rétine. Les voies de droite correspondent à la réaction en l'absence de transcriptase inverse. ACTB, l'actine cytoplasmique. Amorces utilisées: NXNL2v1: 5'-GCATGAGCTGAGGAAGAGGT-3 ', 5'-ACCT AACGGAGAAATTCTGGA-3', 5'-NXNLv2: TCTGCACCCCCACGTTTATT-3 ', 5'-AGGGCCTCCT TTTCCATCTA-3'.
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Discussion
L'élaboration d'une procédure de recouvrement de tissu du bloc opératoire a été essentielle à l'analyse du transcriptome de décollement de la rétine. Il faut remarquer que ce type de chirurgie est pratiquée en urgence et que les ophtalmologistes exploitation ont peu de temps pour participer à un programme de recherche biologique quand ils opèrent. Cette rétinectomie est également effectuée stochastique dans chaque service, de sorte que le plus simple pour atteindre le nombre statistiques est de travailler avec un réseau. Dans un tel réseau, la standardisation de la collecte des tissus est essentielle au succès de l'analyse biologique. En fournissant un matériau très facile à utiliser et des instructions précises, qui peuvent être stockées à température ambiante dans une armoire de la chirurgie, à proximité du bloc opératoire, nous avons encouragé les chirurgiens à participer à notre étude.
En outre, la standardisation de la purification de l'ARN a été réalisée pour obtenir le meilleur de ces précieux clspécimens inical. Les collections d'ARN pures peuvent être stockées pendant des années à -80 ° C et seraient utilisés pour poursuivre des études en nouvelles technologies génomiques émergent. Le protocole est prévue pour prélèvement chirurgical rétine, mais peut aussi être utilisé avec succès pour isoler l'ARN à partir de la rétine de rongeurs après dissection. Si les ARN sont dégradés, a) Vérifier le pH de la solution de CsCl / EDTA. b) prendre toutes les solutions de produits chimiques inutilisés. La principale limite de cette technique est la quantité de matière qui doit correspondre à au moins 50.000 cellules de départ.
Ce qui distingue la méthode utilisée ici de la plupart des réactifs commerciaux prévus pour isoler l'ARN total est le degré de pureté. L'ARN est épuisé de toute contamination d'ADN qui élimine la nécessité d'utiliser un traitement DNAse qui peut être préjudiciable à toute autre procédure. En outre, les préparations d'ARN total sont ici épuisées dans ARNt, qui sont connus pour être de puissants inhibiteurs de polymérase ARN qui sont couramment utilisés dansl'étape d'amplification avant l'hybridation de puces microarray. Nous avons observé que les sondes synthétisées à partir de ces préparations d'ARN ont une activité spécifique très élevée. Le degré de pureté de l'ARN préparé selon la méthode décrite ici est très bien adapté pour les puces d'hybridation, mais aussi pour la construction de banques d'ADNc de haute qualité et de séquençage de l'ARN comme nous l'avons observé. Le laboratoire doit être RNAse. Le pH de la CsCl / EDTA doit être acide pour éviter la dégradation de l'ARN par lyse alcaline. La densité du CsCl / EDTA doit être soigneusement vérifiée afin de ne pas être trop élevée et pour prévenir la sédimentation de l'ARN.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Sacha Reichman et Dominique Santiard-Baron pour leur aide dans l'édition du protocole de purification d'ARN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Aventi J-E | |
| Rotor | Beckman Coulter | JS-5.3 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | LE 80K | |
| Rotor | Beckman Coulter | SW41 | |
| Power supply | Biorad | Pac 3000 | |
| PolytronTM | Kinematica | PT 2100 | Supplied with PT-DA 2105:2 |
| Agarose gel electrophoresis device | Biorad | MiniGel Cell GT | |
| Imaging System | Biorad | GelDoc-It Imager | |
| 5 ml sterile polyethylene tube | Greiner | 115261 | |
| Sterile polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 331372 | |
| Chemical reagents | Sigma | Molecular biology grade (RNase and DNase free products) | |
| Cleaning Solution | VWR | RBS | |
| Microarray chip | Affymetrix | Human U133 plus 2 array |
References
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