Summary
ラディカルベースの生体模倣化学、バイオマーカー開発のために必要な建物のアップライブラリに適用されています。
Abstract
ライフサイエンス分野におけるフリーラジカルの関与が絶えず時間とともに増加しており、いくつかの生理学的および病理学的プロセスに接続されています。この主題は、生命、健康と高齢化の質の改善への応用では、物理的、生物学的および生物有機化学から生物学や医学にまたがる多様な科学分野を包含する。学際的なスキルは生物学的環境におけるラジカルプロセスの多くの面の全面的な調査のために必要な化学的知識は、基本的なプロセスとメカニズムを発表する上で重要な役割を果たしています。我々は、機械論的な経路および製品に関する情報を提供して、生物学的過程でフリーラジカル化学反応を接続することができ、化学生物学のアプローチを開発した。このアプローチの核心は、同様の反応経路の洞察を得て、水性系における生体分子の挙動（脂質、核酸やタンパク質）を研究するためのバイオミメティックモデルのデザインですsはフリーラジカル反応生成物の分子ライブラリーを構築する。このコンテキストは正常にバイオマーカー探索に用いることができ、例としては、化合物の二つのクラスで提供されています：合成とヒト血漿中で検出するための参照として使用されるコレステリルエステルのモノ - トランス異性体、およびプリン5 '-1,8 - シクロ-2 ' - デオキシ調製し、DNAサンプルでこのような病変の検出のためのプロトコルの参照として使用され、電離放射線の後、または別の健康状態から得られた。
Introduction
フリーラジカルの反応性は、老化や炎症を含む多くの生物学的イベントのためにその巨大な重要性を明らかにした。最近では、フリーラジカルや損傷の修復を制御するための基本的なメカニズムと想定効果的な戦略を理解するために、ますます明らかに、この反応に関与するそれぞれの化学的工程の明確化が必要であるということです。化学的研究からの貢献が基本であるが、異なるプロセスの重ね合わせが複雑になり、結果と関連の結論の検討を乱すので、生物学的な環境での直接の研究では、困難になる可能性があります。したがって、生物学的に関連する条件の下でフリーラジカル反応をモデル化する戦略は、生物学における化学的メカニズムの研究の基本的なステップとなっています。
過去10年間で当社グループは、バイオミメティック条件下でフリーラジカルプロセスのモデルを開発しました。特に、我々は、EN不飽和脂肪酸、ヌクレオシド、および含硫アミノ酸の生物学的に関連する変換をvisagedと健康状態のバイオマーカーとして評価され、検証されるトラックにそれらを置く。1-4
私たちの一般的なアプローチは、3つのモジュールで構成されています：
- 適切に変更された生体分子へのアクセスを提供し、有機合成、。合成計画はまたこうしてバイオミメティックラジカル化学の原理で対象の生物学的プロセスをシミュレートすることができる条件を適用すること、生物学的な環境で発生するフリーラジカルプロセスをシミュレートするために設計することができます。バイオミメティックモデルでは、反応媒体は、水または親水性と疎水性区画の共存のために異質的な媒体です。バイオミメティックモデルで動作する利点は、おそらく発見し、反応性および製品は、より詳細に調べることができる公知の反応パートナーと簡略化された環境を持つことである新規化学経路。このステップの機序と運動情報から収集することができる;
- 製品の精製、分析とキャラクタリゼーション、分子ライブラリを整理し、より複雑な生物環境をrecognition.in容易にするために修正された生体分子の構造と化学的な情報を提供する。プロトコルは、生物標本に由来するもののような化合物の複雑な混合物の解決の観点からも確立されています。
- 培養細胞を用いたin vitro の実験では 、動物とヒトのin vivo研究のいずれかによって導出生体試料を用いたバイオマーカーの開発、。バイオミメティックモデルで開発されたプロトコルは、異なる条件下でフリーラジカル変換を想定することは、試料の複雑な解析に適用されます。合成によって開発された分子ライブラリーでは、生命科学の発見の大きな助けである。フリーラジカル変換GIVで得られた情報電子修理や予防戦略を把握する機会を。結果のデータベースは、バイオマーカーの意義と可能な関連因子の多変量解析による慎重な評価のために使用することができます。
コレステリルエステルおよびプリン5 '-1,8 - シクロ-2'-デオキシ：我々は、このアプローチを認定するために関連するバイオマーカーの二つのクラスを選択しました。
Protocol
1。コレステリルエステルのモノ - トランス異性体の合成
- 2 - プロパノール中コレステリルエステル（リノール酸やアラキドン酸コレステリルエステル）（15 mM）を溶解する。良い可溶化のために、サンプルを、アルゴン下で15分間超音波処理した。
- （7 mM濃度に到達するために、チオールの2 Mのストック溶液から）2 - プロパノール、2 - メルカプトエタノールを加え、石英光化学反応器に溶液を移します。溶液中の酸素の存在を排除するために、20分間アルゴンで反応混合物をフラッシュします。
- 22℃で5.5W低圧水銀ランプを用いて紫外線によって反応混合物を照射±2℃で4分間。証拠の分析のAg-TLC（銀薄層クロマトグラフィー）モノ-トランスコレステリルエステル（化学式については図1を参照）を形成することによってモニター。 TLCの染色はセリウムアンモニウムmolibdate（CAM）の溶液中でプレートを注ぐことによって行われ、スポット加熱に表示されているプレート。全収率の増加を求め、異性の他のラウンドを実行するために再利用することができる出発物質を、回復するために、早い段階で反応をクエンチ。
- 2 - プロパノール数mlで装置を洗浄し、丸底フラスコ内の反応混合液を収集します。溶媒を除去し、そして、文献に記載されたAg-TLCによるコレステリルエステルのモノ-トランス異性体を清める。5を使用して、モノ-トランスコレステリルリノール酸異性体の溶出液としてヘキサン-ジエチルエーテル（9:1 v / v）で、一方、使用ヘキサンモノトランスコレステリルアラキドン酸の異性体について - ジエチルエーテル - 酢酸（9:1:0,1 v / v）である。
2。ヒト血清からのコレステリルエステル画分の単離
- 食塩水1mlでヒト血清（血液の遠心分離により得られたもの）1mlを希釈し、成果物（ 例えば酸化付加物）のを避けるために、アルゴン気流下、分液漏斗に溶液を注ぐ。 10ミリリットルのクロロホルム - メタノール（2を追加：1 v / v）の三度。アルブミンの存在に起因するエマルジョンの形成を制限するために、非常にゆっくりと分液漏斗を振ります。
- 食塩水（10ml）で一回有機層を洗浄し、次いで無水硫酸ナトリウムで乾燥し、アルゴン気流下三角フラスコに集める。黄色油（血漿総脂質画分）を得ロータリーエバポレーターで揮発物を除去。
- クロロホルム - メタノール1ml（2:1 v / v）を、アルゴン気流下取TLC上に負荷で原油を取り上げて、溶離剤としてヘキサン - ジエチルエーテル（9:1 v / v）の混合物を使用。コレステリルエステル画分を含有するシリカ部分を掻き、バイアルに注ぐ。その後、クロロホルム - メタノール（2:1 v / v）を用いて（3×5ml）でシリカを抽出した有機層を収集し、コレステリルエステル（通常〜1.5 mg）の純粋な画分を得て、蒸発させた後、溶媒を除去する。
- -20℃でアルゴン·ストアの下にアルミ箔で覆われて暗いバイアル内コレステリルエステルを保つコレステリル電子stersは光や酸素に敏感である。
3。ラマン分光法によるモノトランスコレステリルエステルのキャラクタリゼーション
- セクション2で説明したように、ヒト血清（≥0.7 mg）をからコレステリルエステルを抽出し、四塩化炭素（≤10μL）とバイアル内の場所の少量で溶解する。そのラマン信号は、コレステリルエステル分析の関心領域と重なっていないので、 四塩化炭素を溶媒として選択されています。
- 使い捨てガラスピペットを介して試料ホルダーへの解決策を移し、その後慎重にアルゴンの遅い流れによって溶媒を除去する。均一な油性膜は試料ホルダの内壁に形成されると、測定のための測定器に後者を置く。
- フーリエ変換は、コレステリルエステルのラマンスペクトルを直接任意の誘導体化反応することなく、脂質抽出で得られた形質転換された。試料上のレーザーパワーは、試料の損傷を避けるために<100 mWです。スキャンの合計数各スペクトルのバックグラウンドノイズを最小限に抑えることが≥800である。
- それは分子中に存在するC = C二重結合（C = C伸縮モード）からの寄与を反映するので、ラマンスペクトルの1,700-1,630 cm -1の範囲が分析される。カーブフィッティング解析は、このようにします （ 図2を参照）シスおよびアルキル鎖脂肪酸やコレステロールのB環の二重結合でトランス二重結合から重畳貢献の区別を可能にする、この領域で実行されます。
- 正しく振動バンドに合わせて、いくつかのパラメータは固定または合理的な範囲内に拘束されるべきである。ハーフハイトの帯域幅は最高のコンピュータ最適化ルーチンによって決定されるのに対し、成分ピークプロファイルは、ローレンツとガウス関数の線形結合として記述されている。成分ピークの数と位置はまた、いくつかの弱い成分バンドを検出できるように第四次微分スペクトルを使用することによって得られる。以降の信号信号の分化時に劣化対雑音比13ポイントSavitsky-Golayの機能を持つ第四の誘導体を平滑化、第四誘導体の使用を排除することができ、有利である、したがって、対雑音比分解能と信号の間の適切な妥協点が得られた。最高のカーブフィッティングは、可能な限り低いC 2の値で得られる。
- トランス異性体の存在は、1671年にコンポーネント±1脂肪酸鎖に起因する若干低い周波数に向かってシフトに加えて、cm -1で 、少なくとも、2つのコンポーネント、およびコレステロールC = C二重結合によって明らかにされています。血漿コレステリルエステルの代表的なラマンスペクトルを図9に示します。挿入図にコレステリルリノール酸とモノトランスコレステリルリノール酸異性体との特異的な領域の比較が示されています。
4。ガスクロマトグラフィーによる脂肪酸メチルエステル（FAME）と分析への誘導体化
- ディゾルブベンゼン - メタノール（2:3 v / v）を、アルゴン下アルミ箔で覆われて暗いバイアル内の所定の位置に水酸化ナトリウムの1M溶液0.5mlとコレステリルエステル（〜1.5 mg）を得た。
- 混合物は、溶離液としてヘキサン - ジエチルエーテル（9:1 v / v）の混合物を用いてTLCによる室温とモニターで撹拌したままにしておきます。反応時間は通常30分ですが、慎重な反応モニタリングが必要です。対応するメチルエステルが形成されると、実際には、反応が低下し、側副生成物の形成を避けるために、急冷する必要があります。 TLCは、メチルエステルの定量的な形成を示した。
- 食塩水1mlを添加することにより反応混合物をクエンチし、n-ヘキサン（3×2ml）でメチルエステルを抽出します。バイアルに有機層を回収した後、さらに精製せずにGC分析のために使用されているメチルエステル画分を、余裕を回転蒸発によって溶媒を除去する。
- n-ヘキサンの最小量（通常は5分の1ミリグラムのメチルエステルを溶解0μL）と60メートル×0.25ミリメートル×0.25ミクロン（50％ - シアノプロピル） - メチルポリシロキサンカラムを装備したGCに注入します。以下のオーブンプログラムと水素炎イオン化検出器（FID）を使用して：165における低温始動°Cは、1の増加が続く3分間、ホールド℃/ 195分℃まで、第二に続いて40分間、保持最大240°C /分℃、10分間保持する10の増加となりました。定圧モード（29 PSI）が選ばれています。ヘリウムや水素をキャリアガスとして使用することができます。メチルエステルは、本物のサンプルの保持時間と比較することによって識別されます。 図10は、血漿コレステリルエステルから得られたFAMEの代表的なGC分析を示しています。
5。の合成（5'R） - および（5'S）-5 '、8 - シクロ-2'-デオキシアデノシン
- 1mMの濃度に到達するために、アセトニトリル（100ml）中の8 - ブロモ-2'-デオキシアデノシンの33ミリグラム（の8-Br-腰羽目）を溶かす。光反応器内のガス流量（Ar又はN2）を規制し、APPAを埋めるの8-Br-腰羽目の溶液でratus。
- 光反応器の入力に適したサイズとセプタムを準備して、それの中心を通って不活性ガスラインに接続された針を渡します。セプタムでシステムカバーを閉じます。 30分間、不活性ガスをフラッシュします。
- 22℃で125W中圧水銀灯を用いて紫外線による照射±2℃で15分間、250mlの丸底フラスコに溶液を回収。 10mlのアセトニトリルで光反応器を洗い、同じフラスコ内の洗浄液を回収する。
- 1 MのNH 4 OH溶液と粗反応混合物をクエンチし、ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させる。
- 既知の条件下で分析カラムによる高速液体クロマトグラフィー分析（HPLC-UV）を（インストゥルメンテーションの項を参照）を実行し、参照化合物を使用してプロファイルを比較します。
- 以下のゾルを用いて分析カラム（インスツルメンテーション·セクションを参照してください）、高性能液体クロマトグラフィー分析（HPLC-UV）を実行通気口やグラデーション：2 mMギ酸アンモニウムを溶媒として、アセトニトリル溶媒Bは1ミリリットル/分および2.2分で到達するために0％溶媒Bから0.3％溶媒Bの勾配に流量を設定として。その後、4.0分、4.8分の1％溶媒Bの中で、0.8％溶媒B。 9分に1％溶媒Bのままで、その後6分間で8％溶媒Bに進みます。 4分で10％溶媒Bに行くと30％溶媒B〜5分で、他の5分で30％溶媒Bで推移した後。二つの異なるバイアル内の2つのジアステレオマーの製品に対応するクロマトグラムのピークを収集します。
- UV分光光度計で2回収した画分の吸光度を測定し、産期の雌羊·ベールの法則（吸光度=εlC、ε吸光係数とlセルの長さ）に基づいて正確な濃度を計算します。 2'-デオキシアデノシンの吸光係数ε（茶道）（260 nmで15400 M -1 cm -1）を使用します。
6。の合成（5'R） -D（5'S）-5 '、8 - シクロ-2'-デオキシグアノシン
- それぞれ1mmと2mMの濃度に到達するために、蒸留水（100ml）中の8 - ブロモ-2'-デオキシグアノシン35mgの（8-BR-dGuo）およびヨウ化ナトリウム（NaI）の30 mgを溶解します。光反応器に接続されている不活性ガス（ArまたはN 2）の流れを調節し、反応溶液を光反応器を埋める。
- （ステップb）の手順5で説明したように、反応混合物を脱気。
- 22℃で125W中圧水銀灯を用いて紫外線による照射±2℃で30分間、250mlの丸底フラスコに溶液を回収。 10mlの水で光反応器を洗い、同じフラスコ内の洗浄液を回収する。
- 1 MのNH 4 OH溶液と粗反応混合物をクエンチし、真空下で溶媒を蒸発させる。
- （gのステップe）の手順5で説明したように分析を実行します。 2'-デオキシグアノシンの吸光係数ε（dGuo）（260 nmで11700 M -1 cm -1）を使用します。
7。同位体標識されたプリン（5'R）の合成 - （5'S）-5 '、8 - cyclonucleosides
- セプタムキャップ付きガラスバイアル（4mL）中の15 Nの同位体標識されたプリンヌクレオシドの1mMの水溶液（蒸留水）（[15N 5]腰羽目または[15N 5] dGuo）2 mlを準備します。
- セプタムキャップでバイアルを接続して、バイアルの底に達した中隔の針を通してガスライン（溶液の飽和のために、N 2 O）に接続します。セプタムキャップ内の別の短い針がガス出口として働いています。
- 30分間N 2 Oを備えたソリューションをフラッシュします。ガスの流れは非常に低くなるように調整される。
- 出口の針が最初取り出して1 'の後に長い1は、バイアルの中に小さな圧力を持たせるために、次のされています。
- 8時間（線量率約4.5 Gyで/分の単位で計算）のガンマ放射線分解の装置で溶液を入れた。
- 反応後、1M NH 4で原油をクエンチ
- 6、既知の条件下で高速液体クロマトグラフィー分析（HPLC-UV）を実行し、標準的な参考文献とクロマトグラムを比較します。
8。 DNA水溶液のガンマ放射線分解
- ウシ胸腺DNAの0.5 mg / mlの溶液1ml（蒸留水）を準備し、セプタムキャップ付きガラスバイアル（2ml）中に入れた。
- （ステップBD）手順7で説明したように反応を脱気。
- 30分（用量/速度約4.5 Gyで/分の単位で計算）のガンマ放射線分解の装置で溶液を入れた。
9。 DNAの酵素消化
- DNAの80μgを含むエッペンドルフチューブに、ヌクレアーゼP1、ホスホジエステラーゼII、300 mMの酢酸ナトリウム（pH 5.6）、10mMの塩化亜鉛20μl中EHNA 20 nmolの0.01 Uの8 Uを追加します。 48時間37℃で混合物をインキュベートする。
- 次にphosphodiesteras 0.02 U、アルカリホスファターゼの8 Uの混合物を追加E私は、混合物の消化に0.5Mトリス - 塩酸緩衝液（pH 8.9）40μlのインチサンプルを2時間37℃でインキュベートする。
- 混合物を10％ギ酸を加えて中和する。
- アミコンウルトラ0.5遠心フィルター装置（カット3kDaの）にサンプルを移し、tridistilled H 2 Oの200μlを加える15分間、14,000×gで遠心ローターに超フィルターを置きます。その後、遠心管からウルトラフィルタ装置を分離します。マイクロチューブに酵素を含まない溶液を凍結乾燥。
10。分析に先立ってDNAサンプル淡水化
- 分析カラムによる高速液体クロマトグラフィー分析（HPLC-UV）（インストゥルメンテーションのセクションを参照）、既知の条件に従って。6実行
- H 2 O20μlに凍結乾燥消化されたDNAを溶解し、HPLC-UVで注入する。
- 塩溶出（最初の数分間）の後、右溶出ティム前にバイアルにサンプルを収集クロマトグラフィープログラムの終了時まで先制ヌクレオシド（5'R-cdGuo）のe。
- 試料を凍結乾燥し、20μlの水に再溶解されています。
11。 LC-MS/MS定量分析
- 分析法およびMS検出器（ESI）をするための方法をロードすることによって、分析を開始する前にHPLC-MS/MS（トリプル四重極）を準備します。6
- 手順7で調製したサンプルの同位体標識化合物の混合物の1μlを添加する。
- 蒸留水でスパイク消化されたDNA溶液20μlを注入します。
- 得られたクロマトグラフデータは、参照化合物との以前のキャリブレーションに基づいて詳しく説明されます。代表的なHPLCは、アデノシン、2'-デオキシグアノシンを含むとその酸化およびシクロ誘導体は図11に示されて実行されます。
Representative Results
異性化プロセスは、リノール酸および生物学的環境におけるフリーラジカルストレス条件下で発生する可能性があり、この攻撃の最初の製品として、 図1に示されているアラキドン酸のモノ-トランス異性体を与えるコレステリルエステルのために特に記載されている。5
図3では、シス-トランス二重結合異性化に関与する化学メカニズムが示されています。ラジカル源は、S-中心ラジカルを得た一般的な方法で示されている。記載されているプロトコルでラジカル源はhomoliticallyチオール分子のRSHのSH結合の存在を破壊することができます紫外線である。
図4は、ヒト血漿中の変性脂質クラスとそれらの検出を合成するための3ステッププロトコルをまとめたものです合成はバイオミメティックフリーラジカルプロセスを表し、また、幾何学的にワンポット便利なエントリを提供しています位置異性体によるいかなる汚染なしrical異性体は、精製および単離プロトコールが続く。
いくつかの分析手法は、モノ - トランスコレステリルエステルライブラリのトランス異性体含有量とキャラの高感度検出のために適用することができます。具体的には、ラマン分光法（ 図2と図9を参照）誘導体化せずに直接、コレステリルエステル画分で行うことができる。
2番目の例では、懸念のプリン5 '-1,8 - シクロ-2'-デオキシリボヌクレオシド、位置糖部分のC5'と糖と塩基との間の共有結合のその後の形成にフリーラジカルの攻撃によって作成されたDNAの病変である部分。 4つの構造を製造することができる、それは両方5'Rと5'Sジアステレオマー形態（ 図5）に存在する、-デオキシアデノシンおよび5 '-1,8 -シクロ-2'-デオキシグアノシン、5'、8 -シクロ-2 'です。 図6トンで彼の反応機構は、分子内で選択的に2'-deoxyadenosin-5'-イルラジカル7を得たC5 'の位置から水素原子を引き抜き、対応C8ラジカル6を与えるために、8 bromopurine誘導体5の光分解を伴うことが示されている。ラジカル7は最終製品9を得ヘテロラジカル8の酸化に続いて10 5〜10 6 s -1の2の範囲内の一定の割合で環化を経る。 2'-デオキシアデノシンおよび2'-デオキシグアノシンと水の放射線分解によって生成されたヒドロキシルラジカルとの反応は、、（10）CAをすることが明らかになった。 C5 'の位置からの水素引き抜きで10％。7
プリン5のライブラリ'-1,8 -シクロ-2'-デオキシリボヌクレオシド（標識化合物を含む）のための私たちのケミカルバイオロジーのアプローチは、オリゴヌクレオチドで同様VAから得られたDNA試料中のこれらの病変の同定と、 図7に示されてなどいろいろな読み取り方法源は、例えば、ラジカルストレス条件の模倣として、電離放射線の条件下で処理。
図8に、典型的な光反応装置が示されています。デバイスは、適切な溶媒に溶解した化合物の照射が可能になります。それは以下から成ります：i）不活性ガス用の入口（下）及びガス出口用と試薬添加のための2つの注入口を備えた反応室と、冷却システムに接続されている適切な水銀ランプを含むii）内部チャンバーガラスジョイントを介して、反応チャンバー内に挿入され、電力、。
図1。コレステリルリノール酸とアラキドン酸のモノ-トランス異性体。
図2。ラマン分光法を用いたモノ-トランス異性体のためのヒト血清および直接分析でコレステリルエステル。
図3。 thiylラジカルによる二重結合のシス-トランス異性化につながる付加-脱離過程。
図4。フリーラジカルストレスのバイオマーカーとしてのモノ-トランスコレステリルエステルの開発のための三つのステッププロトコル。
図5。 4プリン5 '-1,8 -シクロ-2'-デオキシリボジアステレオマーは 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図6。 C5の世代'基、どちらか5の光分解によってまたはHO•ラジカルと10の反応、およびプリン5の機構によって' -1,8 -シクロ-2 'デオキシリボ形成。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図7。プロトコルFいくつかの根本的なベースのDNA損傷または識別;のmtDNA：ミトコンドリアDNA、nDNA：核DNA。
図8。光化学反応。
図9。血漿コレステリルエステルの代表的なラマンスペクトル。コレステリルリノール酸およびコレステモノトランスリノール酸異性体との特異的な領域の挿入図の比較で。
図10。血漿コレステリルエステルから得られたFAMEの代表的なGC分析。
<strong>の図11。代表的なHPLCは、2'-デオキシアデノシン含有し、それらの酸化およびプリン5と共に2'deoxyguanosine実行'-1,8 -シクロ-2'-デオキシリボヌクレオシド。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
Discussion
自然に幾何トランス異性体にシス不飽和脂肪酸を発生の変換は生物学的環境におけるラジカルストレスの生産と接続変換です。脂肪酸を含んでいる細胞膜脂質は、急進的なストレスに関連する生物学的標的であり、我々は最初の細胞培養、動物やそれぞれのケースで分析プロトコルを評価する人間に内在シス-トランスリン脂質の異性化を検討した。8月10日我々は、この変換を実証異なるラジカルストレス条件下thiylラジカルを生成することができるチオール、チオエーテルとジスルフィド、 すなわち異性化剤（ 図3）を含むS含有化合物、様々な方法で発生する可能性があります。この記事で示した例では、厳密にリポ蛋白代謝に関与する血漿脂質のよく知られた分数を表すコレステリルエステルのクラスに焦点を当てています。脂肪酸と町の間にエステル結合lesterolはコレステロールにホスファチジルコリンのグリセロール部分、トランスフェラーゼ酵素レシチンコレステロールアシル（LCAT）によって触媒されるステップの位置2からの脂肪酸の転送によって生合成される。したがって、血漿コレステリルエステルは厳密に膜脂質の代謝回転と接続され、ホスファチジルコリン、 すなわちリノール酸、アラキドン酸に典型的に存在する多価不飽和脂肪酸（PUFA）の比較的高い比率を含んでいます。リポタンパク質の形成は、心血管疾患や代謝性疾患に関与している。フリーラジカルとの自然なコレステリルエステルの反応性は、対応するトランス幾何異性体に変換することができるリノール酸とアラキドン酸残基の二重結合、（構造については図1を参照）で発生する可能性があります。生体試料中のトランスコレステリルエステル含有量の特性評価は、バイオマーカー開発のための興味深いものです。間接的な方法論はcholesteryの変態で構成されていますリットルエステルはガスクロマトグラフィープロトコルによってプラズマからの対応する脂肪酸メチルエステル（FAME）と分離して単離した。この場合、シス及びトランス脂肪酸メチルエステルの標準的な参照のキャリブレーションは、サンプル中のトランス含量の定量を可能にするために、実行されます。コレステリルエステルライブラリで行った分析の研究に基づき、我々は、（ 図を参照して対応する名声にさらに誘導体化することなく、また、血漿から単離さコレステリルエステルの割合に直接行うことができるラマン分光法に基づく手法を適用することを提案2,9）。それが今は成功した方法はその代わりとしてコレステリルエステルヒドロペルオキシドによって記述され、別のシスおよびHPLCにより脂質を含有する脂肪酸のトランス異性体、に記載されていないようにということは注目に値する。これまでのところ、間接的なガスクロマトグラフ法は今のところまだ利用可能な最良の方法です。このメソッドは、最初に定量evaluによって健常者の血漿から単離さコレステリルエステルに由来するモノ - トランスコンテンツのationが提供されました。水素炎イオン化検出器（FID）検出可能性の制限を使用すると、満足です（ppb）の化合物とのナノモル量が検出されています5。異なる検出システムではこの制限があっても下げることができる。コレステリルエステルに電離放射線の影響は線形応答が適用線量に対して相対的を得ているかどうか、さらなる研究の問題である。
2番目の例として、我々は、DNAのフリーラジカルによる損傷により製造することができる修飾されたヌクレオシドを選びました。ヒドロキシルラジカル（HO•）DNAに化学修飾を引き起こす能力にとって最も有害な活性酸素種（ROS）であることが知られている。単一または複数の病変は、真核細胞内で核とミトコンドリアに置かれていることを、DNAに発生することがあります。 approprを必要とするDNAに酸化生成された損害のメインクラスの識別と測定分析プロトコルを設定するために分子ライブラリをiate。我々は、ベースとフリーラジカルの攻撃によって作成された糖部分との間に追加の共有結合を有するプリン5アール最小のタンデム病変、 '-1,8 - シクロ-2'-デオキシリボヌクレオシドの私たちの関心を集中。化合物は、5 '、8 -シクロ-2'-デオキシアデノシンおよび5' -1,8 -シクロ-2'-デオキシグアノシン5'Rと5'Sジアステレオマー形態（ 図5）に存在しています。フリーラジカルストレスマーカーになるため、その可能性は基礎研究の問題である。2確かに、DNAがHOにさらされているとき•砂糖のC5 'の位置から水素ラジカルの抽象化は、これらのタンデム病変の形成につながる可能性のあるイベントの一つである。プリン5 '、8 - cyclonucleosidesは酸素の生理的なレベルへの酸素のフォームが存在しないことを行く1から12病変/ 10 6ヌクレオシド/ Gyから変える酵素消化γ線照射DNAサンプルでHPLC-MS/MSによってジアステレオマーの和として測定することができる私nの組織、ジアステレオマー比は5'R / 10'S〜5の4、〜3 '-3,8 - cdAdoおよび5' ,8-cdGuo、それぞれ（ 図11）図11は、それは注目する価値があるされている放射線量との関係細胞のDNAの中に検出された5 '、8 - cdAdoおよび5' ,8-cdAdo病変が理解されているとは程遠い。実験で報告2kGy照射に基づく単一の実験が決定的と見なすことはできません。11この種のさらなる実験と4病変の定量分析は、そのような関係を定義するために必要である。これらの病変の検出、より人気の酸化的変換（例えば、8 -オキソ-2'-デオキシグアノシン、8 oxodGuoなど）を酸化的代謝の間に両方の病変の重要性を証明する、強烈な調査の問題である。6,13 HPLCの使用-MS/MS（トリプル四重極）は、4つのすべての病変の近く30fmolの検出限界を持っています。最後の改善が楽器のproduによってattomolレベルの検出限界に到達するために主張されている役員。非常に最近の文献に基づいて、6分析手順は、使用するMS / MS / MS（イオントラップ）、またはMS / MSの（トリプル四重極）の検出限界を達成するために、サンプルと充実の適切なクリーンアップを含める必要が我々の場合インチ
化合物1-4のバイオインスパイアード合成手順は、8 bromopurine·デリバティブに基づくまたは光分解から始めて開発されました。7,12これらの手順は、5の形成のDNA損傷機構を模倣したラジカルカスケード反応'-1,8 - cdAdoと5'巻き込む-1,8 - cdGuo病変。生物学的な観点から、それはこれらの病変は、DNA修復機構は、これらの病変からの遺伝物質を維持するには不十分であるという証拠を提供し、組織特異的（肝臓>腎臓>脳）に加齢に伴って蓄積することが判明した13は、確かに、ヌクレオチド除去修復（NER）は、現在、これらの病変の修復のために識別された唯一の経路である。2
2クラス図1及び図5に示される化合物のesは現時点で市販されていない、しかし、文献に記載された合成戦略により、それは商業的な使用のためにこれらの化合物を調製することは困難ではないでしょう。
ケミカルバイオロジー研究が提供する学際的なアプローチは、生物学的な環境で発生する新たなメカニズムの同定に非常に大きな価値を持っているだけでなく、最終的には、ヘルスケアと予防戦略に目新しさをもたらし、バイオマーカーの発見と診断に基本的な貢献を与えるだけでなく、図14化学物質の寄与は、彼らが予測することができたときに不確実性や失敗を減らし、治療や栄養のいずれか、介入の設計の最適な合理化を可能にするために期待されているメタボリック·プロファイリングのための統合されたプラットフォームやパネルを作成、分子薬の開発に成功するために必要です。
Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
Ministero dell'Istruzione、dell'UniversitáデッラRicerca（PRIN-2009K3RH7N_002）とマリー·キュリー欧州域内フェローシップ（CYCLOGUO-298555）と同様にケミカルバイオロジーとコストアクションの 'フリーラジカルいるCOSTアクションCM0603のスポンサーからの財政支援"バイオミメティックラジカル化学"のCM1201は感謝して承諾されます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MATERIALS | |||
| Cholesteryl linoleate ≥98% | Sigma-Aldrich | C0289-100 mg | |
| Cholesteryl arachidonate≥95% | Sigma-Aldrich | C8753-25mg | |
| 2-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250-100 ml | |
| 2-propanol | Sigma-Aldrich | 34965-1L | |
| Methanol 215 SpS | Romil | H409-2,5 L | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 02860-2.5L | |
| Chloroform SpS | Romil | H135 2,5 L | |
| n-Hexane 95% SpS | Romil | H389 2,5 L | |
| Acetonitrile 230 SpS | Romil | H047 2,5 L | |
| Dichloromethane SpS | Romil | H2022,5 L | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 107344-1L | |
| Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
| Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966-1L | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-5KG | |
| NaOH solid | Sigma-Aldrich | 221465-25G | |
| NH4OH sol. 28%-30% | Sigma-Aldrich | 221228-1L-A | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | |
| Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride | Sigma-Aldrich | 221759-100G | |
| Ammonium Molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302-100G | |
| Sulfuric Acid 95%-98% | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| Silver Nitrate | Sigma-Aldrich | 209139-25G | |
| Sodium sulfate anhydrous | Sigma-Aldrich | 238597-500G | |
| Nuclease P-I from penicillium citrinum | Sigma-Aldrich | N8630-1VL | |
| Phosphodiesterase II type I-sa | Sigma-Aldrich | P9041-10UN | |
| Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc | Sigma-Aldrich | E114-25MG | |
| Phosphatase alkaline type VII-t from*bov | Sigma-Aldrich | P6774-1KU | |
| Phosphodiesterase I type VI | Sigma-Aldrich | P3134-100MG | |
| Deoxyribonuclease II type IV from*porcin | Sigma-Aldrich | D4138-20KU | |
| Trizma(r) base, biotechnology performanc ce | Sigma-Aldrich | T6066-100G | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644-100G | |
| Succinic acid bioxtra | Sigma-Aldrich | S3674-250G | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670-100G | |
| Formic acid, 98 % | Sigma-Aldrich | 06440-100ML | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane | Millipore | UFC500324 | |
| 8-Bromo-2'-deoxyguanosine | Berry Associates | PR3290-1 g | |
| 8-Bromo-2'-deoxyadenosine | Berry Associates | PR3300-1 g | |
| Sodium iodide | Sigma-Aldrich | 383112-100G | |
| Sodium hydrogen carbonate | Carlo Erba | 478536-500 g | |
| 2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3899-CA-0.1 | |
| 2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY | Cambridge Isotope Laboratories, Inc | CILNLM-3895-0.1 | |
| Nitrous oxide (N2O) | Air Liquide | ||
| Deoxyribonucleic acid from calf thymus | Sigma Aldrich | D4522-5MG | |
| EQUIPMENT | |||
| 60Co-Gammacell | AECL- Canada | 220 | |
| Immersion well reaction medium pressure 125 watts | Photochemical reactors ltd | Model 3010 | |
| Evaporating flask 250 ml | Heidolph | P/N NS 29/32 514-72000-00 | |
| Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm | Phenomenex | 00A-4252-E0 | |
| Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm | Grace | 88081 | Semipreparative |
| SecurityGuard Kit | Phenomenex | KJ0-4282 | Analytical holder kit and accessories |
| Holder for 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7220 | Semipreparative holder |
| 10.0 mm ID cartridges | Phenomenex | AJ0-7221 | |
| High-performance liquid chromatography (HPLC) | Agilent | 1100 | |
| LC/MS/MS | Applied Biosystems | 4000QTRAP System | |
| Tandem mass ESI spectrometer | (Bruker Daltonics) | Esquire 3000 plus | |
| Vial 2-4 ml | SUPELCO | Cod 27516 | |
| Vial 4 ml | SUPELCO | Cod 27517 | |
References
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