Free Radicals in Chemical Biology: van chemische gedrag tot Biomarker Development

Summary

Radicaal gebaseerde biomimetische chemie werd toegepast op opbouw libraries nodig biomarkerontwikkeling.

Abstract

De betrokkenheid van vrije radicalen in de biowetenschappen voortdurend toegenomen met de tijd en is aangesloten op een aantal fysiologische en pathologische processen. Dit onderwerp omvat diverse wetenschappelijke gebieden, variërend van fysische, biologische en bio-organische chemie biologie en geneeskunde, met toepassingen in de verbetering van de kwaliteit van leven, gezondheid en veroudering. Multidisciplinaire vaardigheden zijn vereist voor het volledig onderzoek van de vele facetten van de radicale processen in de biologische omgeving en chemische kennis speelt een cruciale rol in de onthulling van fundamentele processen en mechanismen. We ontwikkelden een chemische biologie aanpak, waarmee vrije radicalen chemische reactiviteit verbinden met biologische processen, het verstrekken van informatie over de mechanistische paden en producten. De kern van deze benadering is het ontwerp van biomimetische modellen biomolecule gedrag (lipiden, nucleïnezuren en eiwitten) bestuderen in waterige systemen verkrijgen inzichten van de reactieroutes en eens opbouw moleculaire bibliotheken van de vrije radicalen reactieproducten. Deze context kan succesvol gebruikt worden voor biomerkers en voorbeelden zijn voorzien van twee soorten verbindingen: mono-trans isomeren van cholesteryl esters die worden gesynthetiseerd en gebruikt als referentie voor de detectie in menselijk plasma en purine 5 ',8-cyclo-2 '-deoxyribonucleosides, bereid en gebruikt als referentie in het protocol voor detectie van dergelijke laesies in DNA monsters na ioniserende straling of verkregen uit verschillende gezondheidsproblemen.

Introduction

De reactiviteit van vrije radicalen bleek zijn enorme belang voor vele biologische gebeurtenissen, waaronder veroudering en ontstekingen. Tegenwoordig is steeds duidelijker dat de opheldering van elke chemische stap bij deze reactiviteit nodig is om de onderliggende mechanismen te begrijpen en te overwegen effectieve strategieën voor de bestrijding van vrije radicalen en herstel van de schade. De bijdrage van chemisch onderzoek is van fundamenteel belang, maar de directe studie in de biologische omgeving kan moeilijk zijn, omdat de superpositie van verschillende processen bemoeilijkt en verstoort het onderzoek van de resultaten en de conclusies. Daarom is de strategie van het modelleren van reacties van vrije radicalen onder biologisch verwante omstandigheden uitgegroeid tot een fundamentele stap in het onderzoek van de chemische mechanismen in de biologie.

In het laatste decennium onze groep modellen van vrije radicalen processen ontwikkeld onder biomimetische omstandigheden. We en met namevisaged biologisch relevante veranderingen van onverzadigde vetzuren, nucleosiden en zwavelhoudende aminozuren en zet ze in het spoor te evalueren en gevalideerd als biomarkers van de gezondheidstoestand. ^1-4

Onze algemene aanpak bestaat uit drie modules:

• Organische synthese, die de toegang tot behoren gewijzigde biomoleculen biedt. De synthetische programma kan ook worden ontworpen om de vrije radicaal processen in de biologische omgeving na te bootsen, waardoor de toepassing van voorwaarden kan het biologische proces van belang, dat het principe van biomimetische radicale chemie simuleren. In biomimetische modellen het reactiemedium water of een heterogeen medium door de coëxistentie van hydrofiele en hydrofobe compartimenten. Het voordeel om te werken met biomimetische modellen is een vereenvoudigde omgeving te hebben met bekende reactiepartners, waarvoor de reactiviteit en producten kunnen worden onderzocht in meer details, mogelijk ontdekkennieuwe chemische routes. Vanaf deze stap mechanistische en kinetische gegevens kunnen worden verzameld;
• Zuivering, analyse en karakterisering van de producten, die structurele en chemische informatie van het gemodificeerde biomoleculen om moleculaire bibliotheken organiseren en faciliteren recognition.in de meer complexe biologische omgeving. Protocollen worden ook vastgesteld om het oplossen van complexe mengsels van verbindingen zoals die verkregen uit biologische monsters;
• Biomarkerontwikkeling met biologische monsters, hetzij verkregen door in vitro experimenten met celculturen en in vivo studies van dieren en mensen. De protocollen ontwikkeld biomimetische modellen worden vervolgens de complexe analyse van monsters, het vrije radicale veranderingen overwogen onder verschillende omstandigheden. Moleculaire bibliotheken ontwikkeld door synthese zijn een enorme hulp voor life science ontdekkingen. De verzamelde informatie over de vrije radicale transformaties give de mogelijkheid om erachter te komen reparatie en preventiestrategieën. Databases van de resultaten kan worden gebruikt voor een zorgvuldige evaluatie van multivariate analyse van de biomarker betekenis zo goed mogelijk geassocieerde factoren.

We kozen twee klassen relevante biomarkers deze benadering erkennen: cholesterylesters en purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides.

Protocol

1. Synthese van Mono-transisomeren van cholesterylesters

1. Los cholesteryl esters (linoleaat of arachidonaat cholesteryl ester) in 2-propanol (15 mM). Voor een betere oplosbaarheid, werden de monsters 15 min gesonificeerd onder argon.
2. Breng de oplossing een kwarts fotochemische reactor, voeg 2-mercaptoethanol in 2-propanol (7 mM concentratie bereiken van een 2 M voorraadoplossing van de thiol). Spoelen van het reactiemengsel met argon gedurende 20 min om de aanwezigheid van zuurstof in de oplossing te verwijderen.
3. Het reactiemengsel bestralen met UV-licht met een 5.5W lagedruk kwiklamp bij 22 ± 2 ° C gedurende 4 minuten. Monitor door analytische TLC-Ag (zilver-dunnelaagchromatografie) dat hij de vorming van het mono-trans cholesteryl esters (zie figuur 1 voor de chemische formules). De TLC kleuring wordt uitgevoerd door gieten plaat in de ceriumammoniumnitraat molibdate (CAM) oplossing, en de vlekken bij verhittingde plaat. Quench de reactie in een vroeg stadium, om het uitgangsmateriaal, dat kan worden hergebruikt voor andere rondes isomerisatie verkrijgen van een verhoging van de totale opbrengst voeren herstellen.
4. Verzamel het reactiemengsel in een rondbodemkolf, wassen van de inrichting met enkele ml 2-propanol. Verwijder oplosmiddel en zuiver het mono-trans isomeren van cholesteryl esters door Ag-TLC zoals beschreven in de literatuur. ⁵ Gebruik hexaan-diethylether (9:1 v / v) als eluens voor mono-trans isomeren cholesteryl linoleaat, dat gebruik hexaan -diethyl ether-azijnzuur (9:1:0,1 v / v) voor mono-trans cholesteryl arachidonaat isomeren.

2. Isolatie van cholesterylesters fractie uit humaan serum

1. Verdun 1 ml humaan serum (verkregen door centrifugeren van bloed) met 1 ml pekel en giet het mengsel in een scheitrechter onder een stroom argon om artefacten (bijvoorbeeld oxidatie adducten) voorkomen. Voeg 10 ml chloroform-methanol (2: 1 v / v) driemaal. Schud de scheitrechter zeer langzaam om de vorming van de emulsie door de aanwezigheid van albumine beperken.
2. Ze wast de organische lagen met pekel (10 ml), verzamel dan in een Erlenmeyer kolf onder een argonstroom, droog over watervrij natriumsulfaat. Verwijderen vluchtige stoffen door roterende verdamper tot een gele olie (totaal plasma lipide fractie) werd verkregen.
3. Neem het ruwe met 1 ml chloroform-methanol (2:1 v / v), laden op een preparatieve TLC onder een stroom argon en een mengsel van hexaan-diethylether (9:1 v / v) als eluens . Schraap de silica gedeelte met de cholesterylester fractie en giet het in een flesje. Vervolgens extract silica (3 x 5 ml) met chloroform-methanol (2:1 v / v), verzamelt de organische lagen en verwijder het oplosmiddel na verdamping van de zuivere fractie van cholesterylesters (meestal ~ 1,5 mg) werd verkregen.
4. Houden cholesteryl esters in een donkere fles onder aluminiumfolie onder argon en bij -20 ° C. Cholesteryl esters zijn gevoelig voor licht en zuurstof.

3. Karakterisering van Mono-trans cholesterylesters door Raman Spectroscopy

1. Uittreksel cholesteryl esters uit humaan serum (≥ 0,7 mg) zoals beschreven in hoofdstuk 2, oplossen in een kleine hoeveelheid tetrachloorkoolstof (≤ 10 pl) en in een flesje. _CCl4 geselecteerd als oplosmiddel omdat de Raman-signaal niet overlapt met het gebied van belang van cholesterylester analyse.
2. Breng de oplossing van de monsterhouder door een wegwerp glazen pipet, verwijder voorzichtig het oplosmiddel een langzame argonstroom. Zodra een uniform olieachtige film wordt gevormd op de binnenwand van de monsterhouder, plaatst deze in het instrument voor de meting.
3. Fourier Getransformeerde Raman spectrum van cholesterylesters direct opgehaald op lipide extracten zonder derivatisering reactie. Het laservermogen op het monster <100 mW tot monster te voorkomen. Het aantal scansvoor elk spectrum is ≥ 800 tot de ruis te minimaliseren.
4. De 1,700-1,630 cm ^-1 bereik van het Raman spectrum wordt geanalyseerd aangezien weerspiegelt de bijdrage van de C = C dubbele bindingen in het molecuul (C = C strekken mode). Een curve fitting analyse is op dit gebied, zodat het onderscheiden van de bovenliggende bijdragen van cis en trans dubbele bindingen in de vetzuren alkylketen en dubbele binding in de ring B van cholesterol (zie figuur 2).
5. Om correct de vibrationele banden passen, moet een aantal parameters worden vastgesteld of beperkt binnen redelijke grenzen. De component piek profielen worden beschreven als een lineaire combinatie van Lorentz en Gaussian functies, terwijl de halve hoogte bandbreedtes best bepaald door de computer optimalisatie routine. Het aantal en de positie van de component pieken worden verkregen door de vierde afgeleide spectra, waardoor ook gedetecteerd in zwakke component bands. Aangezien het signaalruisverhouding die verslechtert na differentiatie van het signaal uitsluit dat de vierde derivaat, vierde derivaten gladgemaakt met een dertien punten Savitsky-Golay functie zijn van voordeel, dus recht compromis tussen resolutie en signaal-ruisverhouding wordt verkregen . De beste curve-fitting worden verkregen op het laagst mogelijke c ² waarden.
6. De aanwezigheid van trans-isomeren blijkt uit de component 1671 ± 1 cm ^-1, naast ten minste twee elementen, iets verschoven naar lagere frequenties vanwege de vetzuurketen en cholesterol C = C-dubbele bindingen. Representatieve Raman spectrum van plasma cholesterylester wordt getoond in figuur 9. In de inzet de vergelijking van een specifieke regio cholesteryl linoleaat en mono-trans cholesteryl linolzuur isomeren getoond.

4. Derivatisering naar Fatty Acid Methyl Esters (FAME) en analyse met gaschromatografie

1. Ontbindencholesteryl esters (~ 1,5 mg) met 0,5 ml van een 1 M oplossing van natriumhydroxide in benzeen-methanol (2:3 v / v) en in een donkere fles onder aluminiumfolie onder argon.
2. Laat het mengsel roeren bij kamertemperatuur en monitor TLC met een mengsel van hexaan-diethylether (9:1 v / v) als eluens. Reactietijd bedraagt ​​doorgaans 30 min maar een zorgvuldige reactie controle vereist. In feite, zodra de overeenkomstige methyl esters worden gevormd, moet de reactie worden afgeschrikt om de vorming van afbraakproducten en bijproducten te vermijden. TLC toonde de kwantitatieve vorming van methylesters.
3. Quench het reactiemengsel door 1 ml pekel en extraheren methyl esters met n-hexaan (3 x 2 ml). Breng de organische lagen in een flesje en verwijder het oplosmiddel door verdamping onder rotatie de methylester fractie, die dan voor GC-analyse gebruikt zonder verdere zuivering verkregen.
4. Los de methylesters in de minimum hoeveelheid n-hexaan (gewoonlijk 1 mg in 50 pi) en injecteer in de GC met een 60 m x 0,25 mm x 0,25 urn (50%-cyaanpropyl)-methylpolysiloxane kolom. Gebruik een vlamionisatiedetector (FID) met de volgende oven programma start temperatuur bij 165 ° C, gedurende 3 min, gevolgd door verhoging van 1 ° C / min tot 195 ° C, houden gedurende 40 minuten, gevolgd door een tweede verhogen van 10 ° C / min tot 240 ° C en houd gedurende 10 minuten. Een constante druk mode (29 psi) wordt gekozen. Helium of waterstof worden gebruikt als dragergas. Methylesters worden geïdentificeerd door vergelijking met retentietijden van authentieke monsters. Figuur 10 toont een representatief FAME GC-analyse van plasma verkregen cholesterylesters.

5. Synthese van (5'R) - en (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-deoxyadenosine

1. Los 33 mg van 8-broom-2'-deoxyadenosine (8-Br-Dado) in acetonitril (100 ml) om 1 mM concentratie te bereiken. Regeling van de gassnelheid (Ar of N2) in de fotoreactor en vul de appatellen in de oplossing van 8-Br-Dado.
2. Bereid een septum met de juiste grootte voor de ingang van de fotoreactor en passeren een naald verbonden met het inerte gas lijn door het midden van het. Sluit het systeem met de septum. Spoel de inert gas gedurende 30 minuten.
3. Bestralen met UV-licht met een 125W medium kwiklamp bij 22 ± 2 ° C gedurende 15 min, de oplossing verzameld in een 250 ml rondbodemkolf. Was de fotoreactor met 10 ml acetonitril en verzamelen wassen in dezelfde kolf.
4. Quench het ruwe reactiemengsel met 1 M _NH4OH oplossing en damp het oplosmiddel in een rotatieverdamper.
5. Run HPLC-analyse (HPLC-UV) met analytische kolom (zie instrumentatie sectie) onder bekende omstandigheden, en vergelijken het profiel met referentie verbindingen.
6. Run HPLC-analyse (HPLC-UV) met een analytische kolom (zie instrumentatie sectie) met behulp van de volgende solopeningen en gradiënten: 2 mM ammoniumformaat als solvent A en acetonitrile als solvent B. Stel het debiet van 1 ml / min en gradiënt van 0% solvent B tot 0,3% solvent B wordt bereikt in 2,2 min. Dan 0,8% oplosmiddel B in in 4,0 min, vervolgens 1% solvent B in 4,8 min. Blijf op 1% oplosmiddel B voor 9 min en ga vervolgens naar 8% oplosmiddel B in 6 minuten. Na naar 10% oplosmiddel B in 4 min en 30% solvent B in 5 min en blijven 30% solvent B gedurende 5 min andere. Verzamel de chromatografische pieken die overeenkomen met de twee diastereomere producten in twee verschillende flesjes.
7. Meet de absorptie van de twee fracties opgevangen in de UV spectrofotometer en bereken de exacte concentratie op basis van het Lamber-Beer wet (A = εlC, waarbij A de absorptie, ε de extinctiecoëfficiënt en l de lengte van de cel). Gebruik de extinctiecoëfficiënt ε van 2'-deoxyadenosine (Dado) (15.400 ^{M-1 cm-1} bij 260 nm).

6. Synthese van (5'R) - eend (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-deoxyguanosine

1. Los 35 mg van 8-broom-2'-deoxyguanosine (8-Br-dGuo) en 30 mg natriumjodide (Nal) in gedestilleerd water (100 ml) om 1 mM en 2 mM respectievelijk concentratie bereiken. Reguleren inert gas (Ar _of N2) stroom verbonden met de fotoreactor en vul de fotoreactor met de reactieoplossing.
2. Degass het reactiemengsel zoals beschreven in procedure 5 (stap b).
3. Bestralen met UV-licht met een 125W medium kwiklamp bij 22 ± 2 ° C gedurende 30 min, de oplossing verzameld in een 250 ml rondbodemkolf. Was de fotoreactor met 10 ml water en het verzamelen van wassen in dezelfde kolf.
4. Quench het ruwe reactiemengsel met 1 M _NH4OH oplossing en damp het oplosmiddel onder vacuüm.
5. Voeren analyse zoals beschreven in Procedure 5 (stap E tot G). Gebruik de extinctiecoëfficiënt ε van 2'-deoxyguanosine (dGuo) (11.700 ^{M-1 cm-1} bij 260 nm).

7. Synthese van Isotopische Labeled Purine (5'R) - en (5 'S) -5' ,8-cyclonucleosides

1. Bereid 2 ml van 1 mM waterige oplossing (gedestilleerd water) van de ¹⁵ N isotopische label purinenucleosiden ([15N ^5] Dado of [15N ^5] dGuo) in een glazen flesje (4 ml) met een septumdop.
2. Sluit de flacon met de septumafsluiting en sluit de gasleiding (N ₂ O verzadiging van de oplossing) door een naald in het septum dat de bodem van het flesje bereikt. Een andere korte naald in de septumafsluiting werkt als het gas af te sluiten.
3. Spoel de oplossing met ₂ O N gedurende 30 minuten. De gasstroom wordt zo geregeld dat deze zeer laag.
4. De uitgang naald wordt eerst afgesloten en na 1 'lang volgt om een ​​kleine druk in de flacon hebben.
5. Plaats de oplossing in de inrichting gamma radiolysis gedurende 8 uur (berekend op basis van een dosis ca. 4,5 Gy / min).
6. Na reactie blussen van de ruwe olie met 1 M NH ₄
7. Run HPLC-analyse (HPLC-UV) onder bekende omstandigheden, ⁶ en vergelijk het chromatogram met de standaard referenties.

8. Gamma radiolyse van DNA waterige oplossingen

1. Bereid 1 ml van 0,5 mg / ml oplossing (gedestilleerd water) van kalfsthymus DNA en in een glazen flacon (2 ml) met een septumafsluiting.
2. Degass de reactie als beschreven in Procedure 7 (stappen bd).
3. Plaats de oplossing in de inrichting gamma radiolysis gedurende 30 min (berekening op basis van dosis / rate ca. 4,5 Gy / min).

9. Enzymatische digestie van DNA

1. Een Eppendorf buis met 80 ug DNA, voeg 8 U nuclease van P1, 0,01 U van fosfodiësterase II, 20 nmol van EHNA in 20 pl 300 mM natriumacetaat (pH 5,6) en 10 mM zinkchloride. Incubeer het mengsel bij 37 ° C gedurende 48 uur.
2. Voeg vervolgens een mengsel van 8 U alkalische fosfatase, 0,02 U van phosphodiesterase I, in 40 pl 0,5 M Tris-HCl buffer (pH 8,9) aan mengsel spijsvertering. Het monster wordt geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 2 uur.
3. Het mengsel wordt geneutraliseerd door toevoeging van 10% mierenzuur.
4. Breng het monster een Amicon Ultra-0.5 centrifugale filterinrichting (3 kDa cutoff), voeg 200 ul tridistilled H ₂ O. Plaats de Ultra-filter in de centrifuge rotor bij 14.000 xg gedurende 15 minuten. Dan scheiden de Ultra filter apparaat van de microcentrifugebuis. Lyofiliseren het enzym-vrije oplossing in de microcentrifugebuis.

10. DNA-monster ontzilting voorafgaand aan de analyse

1. Run HPLC-analyse (HPLC-UV) met analytische kolom (zie paragraaf instrumentatie) na bekende omstandigheden. ⁶
2. Los het gevriesdroogde gedigereerd DNA in 20 ul _H2O en injecteer in HPLC-UV.
3. Verzamel het monster in een flesje nadat het zout elutie (eerste minuten) en vlak voor de elutie time van het eerste nucleoside (5'R-cdGuo) tot het einde van de chromatografische programma.
4. Het monster wordt gelyofiliseerd en resolubilized in 20 pi water.

11. LC-MS/MS Kwantitatieve Analyse

1. Bereid de HPLC-MS/MS (triple quadrupole) voordat de analyse van het laden van de analysemethode en de wijze van MS detector (ESI). ⁶
2. Voeg 1 ul van de isotopische gemerkte verbindingen mengsel in het monster bereid in Procedure 7.
3. Injecteer 20 pi van het verrijkte gedigereerd DNA oplossing in gedestilleerd water.
4. De verkregen chromatografische data worden uitgewerkt op basis van eerdere kalibratie met referentieverbindingen. Een vertegenwoordiger HPLC run met adenosine en guanosine 2'-deoxyribonucleosides en hun oxidatieve en cyclo derivaten is weergegeven in Figuur 11.

Representative Results

De isomerisatiewerkwijze is beschreven in het bijzonder voor cholesterylesters leveren dat mono-trans isomeren van linolzuur en arachidonzuur zuren in figuur 1 weergegeven als de eerste producten van deze aanval, die onder omstandigheden van vrije radicalen stress voorkomen in de biologische omgeving. ⁵

In figuur 3 de chemische mechanisme van de cis-trans isomerisatie dubbele binding getoond. De radicale bronvermelding op een generieke manier om S-gecentreerde radicalen veroorloven. In de beschreven protocollen de radicaalbron is UV licht kan homolitically breken SH binding aanwezig in de thiol RSH molecule.

Figuur 4 vat de drie stappen protocol voor de synthese van de gemodificeerde lipide klasse en de detectie in humane plasma: de synthese is een biomimetische vrije radicalen proces en ook een een-pot gemakkelijk toegang tot de geometrischerical isomeren, zonder verontreiniging met positionele isomeren gevolgd door zuivering en isolatie protocollen.

Verschillende analysemethoden kunnen worden toegepast voor een zeer gevoelige detectie van de trans isomeren en karakterisering van mono-trans cholesteryl ester bibliotheek. In het bijzonder kan Raman spectroscopie worden uitgevoerd direct aan de cholesterylester fractie zonder derivatisering (zie figuur 2 en figuur 9).

Het tweede voorbeeld betreft purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, die DNA laesies die door de aanval van vrije radicalen om de positie C5 'van het suikergedeelte en de daaropvolgende vorming van een covalente binding tussen het suiker en het basisstation groepen. Vier structuren kunnen worden geproduceerd, dat wil zeggen 5 ',8-cyclo-2'-deoxyadenosine en 5 ',8-cyclo-2'-deoxyguanosine, zowel die in de 5'R en 5'S diastereomere vormen (Figuur 5). In figuur 6 thij reactiemechanisme wordt en waaraan fotolyse met 8-bromopurine derivaten 5 om de overeenkomstige C8 groep 6 die intramoleculair onttrekt een waterstofatoom uit de stand C5 'selectief leveren dat 2'-deoxyadenosin-5'-yl groep 7. Groep 7 ondergaat cyclisering met een snelheidsconstante tussen 10 ⁵ -10 ⁶ s ^{-1, 2,} gevolgd door oxidatie van de heteroaromatische rest 8 om de eindproducten ^9. De reactie van hydroxyl radicalen, gegenereerd door radiolyse van water, met 2'-deoxyadenosine en 2'-deoxyguanosine (10) bleek ca optreden. 10% waterstofabstractie van positie C5. ⁷

Onze chemische biologische aanpak voor de bibliotheken van purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosiden (waaronder gemerkte verbindingen) is weergegeven in figuur 7, de identificatie van deze laesies in oligonucleotiden als in DNA monsters verkregen uit various bronnen zoals bijvoorbeeld behandeld onder ioniserende straling voorwaarden, nabootser van radicale stress.

In figuur 8 een typisch fotoreactor apparatuur weergegeven. De inrichting maakt bestraling van verbindingen opgelost in het geschikte oplosmiddel. Het bestaat uit: i) de reactiekamer met de inlaat voor het inert gas (op de bodem) en twee inlaten voor de gas uitstappen en reagentia toevoeging, ii) een inwendige kamer die de juiste kwiklamp verbonden met een koelsysteem en elektriciteit, dat in de reactiekamer ingebracht door een glazen verbindingsstuk.

Figuur 1. Mono-trans isomeren van cholesteryl linoleaat en arachidonaat.

Figuur 2. Cholesterylesters in menselijk serum en directe analyse van mono-trans isomeren met Raman spectroscopie.

Figuur 3. De additie-eliminatie proces dat leidt tot de cis-trans isomerisatie van dubbele bindingen door thiyl radicalen.

Figuur 4. Drie stappen protocol voor de ontwikkeling van mono-trans cholesteryl esters als biomarker van vrije radicalen stress.

Figuur 5. De vier purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleoside diastereoisomeren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 6. Generatie C5 'radicalen, door fotolyse van 5 of door reactie van 10 met HO • radicalen, en het mechanisme van purine 5' ,8-cyclo-2 'deoxyribonucleoside formatie. Klik hier om groter bedrag bekijken .

Figuur 7. Protocol fof identificatie van een aantal radicaal-gebaseerde DNA-beschadigingen; mtDNA: mitochondriaal DNA, nDNA: nucleair DNA.

Figuur 8. Fotochemische reactor.

Figuur 9. Representatieve Raman spectrum van plasma cholesteryl ester. In de inzet de vergelijking van een specifieke regio cholesteryl linoleaat en cholesteryl mono-trans isomeren linolzuur.

Figuur 10. Representatieve FAME GC-analyse van plasma verkregen cholesterylesters.

<strong> Figuur 11. Vertegenwoordiger HPLC run die 2'-deoxyadenosine en 2'deoxyguanosine samen met hun oxidatieve en purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribo nucleosiden. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussion

De omzetting van natuurlijke cis onverzadigde vetzuren tot geometrische isomeren trans is een transformatie op de productie van radicalen stress in de biologische omgeving. Celmembraanlipiden, die vetzuren bevatten, een relevant biologisch doelwit voor radicale stress en we onderzocht eerst de endogene cis-trans isomerisatie fosfolipiden in celkweken, dieren en mensen beoordelen analytische protocollen deelneemt. ^8-10 We hebben aangetoond dat deze transformatie kan optreden door diverse S-bevattende verbindingen, zoals thiolen, thioethers en disulfiden die onder verschillende radicalen stress omstandigheden kunnen thiyl radicalen genereren, namelijk de isomerisatie agent (Figuur 3). Het voorbeeld in dit artikel staat de klasse van cholesteryl esters, die een bekende fractie van plasmalipiden strikt betrokken lipoproteïnemetabolisme vertegenwoordigen. De esterbinding tussen vetzuren en cholesterol wordt gebiosynthetiseerd door de overdracht van vetzuren uit de positie 2 van het glycerol deel van fosfatidylcholine cholesterol, een stap gekatalyseerd door het enzym lecithine cholesterol acyl transferase (LCAT). Daarom zijn plasma cholesterylesters nauw verbonden met turnover en bevatten relatief hoog gehalte aan meervoudig onverzadigde vetzuren (PUFA) typisch aanwezig in fosfatidylcholinen, zoals linolzuur en arachidonzuur zuren. Lipoproteïne vorming is betrokken bij cardiovasculaire en metabole ziekten. De reactiviteit van natuurlijke cholesteryl esters met vrije radicalen kunnen op de dubbele bindingen van linoleaat en arachidonaat resten die kunnen worden omgezet in de overeenkomstige trans geometrische isomeren (zie Figuur 1 voor de structuur). Karakterisering van de trans cholesterylester gehalte in biologische monsters is interessant voor biomarkerontwikkeling. Een indirecte methode bestaat uit de transformatie van cholesteryl esters geïsoleerd uit plasma met de overeenkomstige vetzuurmethylesters (FAME) en scheiding door gaschromatografische protocollen. In dit geval wordt de kalibratie van de referenties van cis en trans fatty acid methyl esters uitgevoerd om de kwantificering van de trans-gehalte in de monsters mogelijk. Gebaseerd op de analytische studies op het cholesterylester bibliotheek uitgevoerd, stelden wij eveneens een methode waarbij Raman spectroscopie, kunnen worden die rechtstreeks op de cholesterylester fractie geïsoleerd uit plasma, zonder verdere derivatisering op de overeenkomstige FAME (zie figuren 2 en 9). Het is vermeldenswaard dat tot nu toe geen succesvolle werkwijzen beschreven om afzonderlijke cis en trans isomeren van vetzuren bevattende lipiden door HPLC zoals beschreven in plaats cholesteryl ester hydroperoxiden. Tot nu toe, de indirecte gaschromatografische methode is nog steeds de beste beschikbare methode tot nu toe. Door deze werkwijze wordt de eerste kwantitatieve evaluatieatie van de mono-trans dat afkomstig is van cholesteryl esters geïsoleerd uit plasma van gezonde personen werd verstrekt. Met vlamionisatiedetector (FID) het maximum van detecteerbaarheid bevredigend (ppb) en nanomolaire hoeveelheden van de verbindingen zijn vastgesteld. ^5. Met verschillende detectiesystemen deze limiet kan zelfs worden verlaagd. Het effect van ioniserende straling op cholesterylesters is kwestie van verder onderzoek, of een lineaire respons ten opzichte van de toegediende dosis verkregen.

Als tweede voorbeeld kozen we gemodificeerde nucleosiden kan worden door vrije radicalen van DNA. Hydroxylradicalen (HO •) is bekend dat de meest schadelijke reactieve zuurstof species (ROS) voor hun vermogen om chemische wijzigingen veroorzaken DNA. Enkele of meerdere laesies voorkomen op DNA dat in eukaryote cellen is gelegen in kern en mitochondria. Identificatie en meting van de belangrijkste klassen van oxidatieve schade aan DNA gegenereerd vereisen approprIATE moleculaire bibliotheken om het opzetten van de analytische protocollen. We concentreerden ons belang op de kleinste tandem laesies, die purine 5 ',8-cyclo-2'-deoxyribonucleosides, met een aanvullende covalente binding tussen de basis en de suikergroepen die door de vrije radicalen. De verbindingen zijn 5 ',8-cyclo-2'-deoxyadenosine en 5 ',8-cyclo-2'-deoxyguanosine die in de 5'R en 5'S diastereomere vormen (Figuur 5). Hun vermogen om vrije radicalen stress marker geworden is van fundamenteel onderzoek. ^Twee Inderdaad, als DNA wordt blootgesteld aan HO • radicaal waterstofabstractie van positie C5 "van de suiker is een van de mogelijke gebeurtenissen die leiden tot de vorming van deze laesies tandem. Purine 5 ',8-cyclonucleosides kan worden gemeten som van diastereomeren door HPLC-MS/MS in enzymatisch gedigereerd γ-bestraalde DNA monsters variërend 1 tot 12 laesies / 10 ⁶ nucleosiden / Gy gaat vorm afwezigheid van zuurstof fysiologische zuurstofgehalte ikn weefsels, de diastereomere verhouding 5'R / 5 wezen ~ 4 ~ en 3 voor 5 ',8-cdAdo en 5' ,8-cdGuo respectievelijk (Figuur 11). ¹¹ Het is vermeldenswaard dat de relatie tussen stralingsdosis en 5 ',8-cdAdo en 5' ,8-cdAdo laesies in cellulair DNA verre van begrepen. De enkel experiment gebaseerd op 2kGy bestraling vermeld in het experimentele niet afdoende worden beschouwd. ¹¹ Verdere experimenten dergelijke en analytische kwantificering van de vier laesies worden genomen voor deze verhouding. De detectie van deze laesies en de meer populaire oxidatieve transformaties (zoals 8-oxo-2'-deoxyguanosine, 8-oxodGuo) zijn enkele intense onderzoeken, waaruit het belang van beide lesies gedurende oxidatieve metabolisme. ^6,13 Het gebruik van HPLC -MS/MS (triple quadrupole) een detectiegrens nabij 30fmol voor alle vier laesies. Laatst verbeteringen wordt beweerd dat detectiegrenzen van attomol niveaus te bereiken door het instrument produproducenten. Gebaseerd op de recente literatuur, ⁶ analytische procedures moeten de juiste opruiming van het monster en verrijking omvatten om de detectielimieten van de MS / MS / MS (ion trap) of de MS / MS (triple quadrupole) gebruikt, voldoen in ons geval.

Bio-geïnspireerde synthetische procedures van verbindingen 1-4 werden ontwikkeld vanuit 8-bromopurine derivaten onder of fotolyse. ^7,12 Deze procedures omvatten een groep cascade reactie die de DNA schade vormingsmechanisme van 5 nabootst ',8-cdAdo en 5' ,8-cdGuo laesies. Van biologische perspectieven, bleek dat deze beschadigingen ophopen rijping in een weefsel-specifieke wijze (lever> nieren> hersenen), aan te tonen dat DNA herstelmechanismen niet volstaan ​​om het genetisch materiaal behoeden deze laesies. ¹³ immers nucleotide excision repair (NER) is de enige weg die momenteel aan de reparatie van deze laesies. ^twee

De twee klassees van verbindingen getoond in figuren 1 en 5 zijn niet commercieel beschikbaar op dit moment echter door de synthetische strategieën beschreven in de literatuur niet moeilijk deze verbindingen te bereiden voor commercieel gebruik.

De multidisciplinaire aanpak die door chemische biologie studies heeft niet alleen een enorme waarde in de identificatie van nieuwe mechanismen die zich in de biologische omgeving, maar geeft ook een fundamentele bijdrage aan de ontdekking van biomarkers en diagnostiek, uiteindelijk brengen nieuwigheid in de gezondheidszorg en preventie strategieën. ¹⁴ De chemische bijdrage nodig is voor een succesvolle ontwikkeling van de moleculaire geneeskunde, het creëren van geïntegreerde platforms en panels voor metabool profiel die naar verwachting zorgen voor een optimale rationalisering van interventie ontwerp, hetzij therapeutische en voedingswaarde, het verminderen van de onzekerheden en mislukkingen als ze kunnen zijn voorspelbaar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATERIALS
Cholesteryl linoleate ≥98%	Sigma-Aldrich	C0289-100 mg
Cholesteryl arachidonate≥95%	Sigma-Aldrich	C8753-25mg
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M6250-100 ml
2-propanol	Sigma-Aldrich	34965-1L
Methanol 215 SpS	Romil	H409-2,5 L
Ethanol	Sigma-Aldrich	02860-2.5L
Chloroform SpS	Romil	H135 2,5 L
n-Hexane 95% SpS	Romil	H389 2,5 L
Acetonitrile 230 SpS	Romil	H047 2,5 L
Dichloromethane SpS	Romil	H2022,5 L
Carbon tetrachloride	Sigma-Aldrich	107344-1L
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	309966-1L
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
NaOH solid	Sigma-Aldrich	221465-25G
NH4OH sol. 28%-30%	Sigma-Aldrich	221228-1L-A
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride	Sigma-Aldrich	221759-100G
Ammonium Molybdate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	A7302-100G
Sulfuric Acid 95%-98%	Sigma-Aldrich	320501-1L
Silver Nitrate	Sigma-Aldrich	209139-25G
Sodium sulfate anhydrous	Sigma-Aldrich	238597-500G
Nuclease P-I from penicillium citrinum	Sigma-Aldrich	N8630-1VL
Phosphodiesterase II type I-sa	Sigma-Aldrich	P9041-10UN
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc	Sigma-Aldrich	E114-25MG
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov	Sigma-Aldrich	P6774-1KU
Phosphodiesterase I type VI	Sigma-Aldrich	P3134-100MG
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin	Sigma-Aldrich	D4138-20KU
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce	Sigma-Aldrich	T6066-100G
EDTA	Sigma-Aldrich	E1644-100G
Succinic acid bioxtra	Sigma-Aldrich	S3674-250G
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670-100G
Formic acid, 98 %	Sigma-Aldrich	06440-100ML
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane	Millipore	UFC500324
8-Bromo-2'-deoxyguanosine	Berry Associates	PR3290-1 g
8-Bromo-2'-deoxyadenosine	Berry Associates	PR3300-1 g
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3899-CA-0.1
2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3895-0.1
Nitrous oxide (N2O)	Air Liquide
Deoxyribonucleic acid from calf thymus	Sigma Aldrich	D4522-5MG
EQUIPMENT
60Co-Gammacell	AECL- Canada	220
Immersion well reaction medium pressure 125 watts	Photochemical reactors ltd	Model 3010
Evaporating flask 250 ml	Heidolph	P/N NS 29/32 514-72000-00
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm	Phenomenex	00A-4252-E0
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm	Grace	88081	Semipreparative
SecurityGuard Kit	Phenomenex	KJ0-4282	Analytical holder kit and accessories
Holder for 10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7220	Semipreparative holder
10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7221
High-performance liquid chromatography (HPLC)	Agilent	1100
LC/MS/MS	Applied Biosystems	4000QTRAP System
Tandem mass ESI spectrometer	(Bruker Daltonics)	Esquire 3000 plus
Vial 2-4 ml	SUPELCO	Cod 27516
Vial 4 ml	SUPELCO	Cod 27517