Radicaux libres en biologie chimique: de Comportement chimique au développement de biomarqueurs

Summary

Radical basé sur la chimie biomimétique a été appliquée à la construction-up bibliothèques nécessaires pour le développement de biomarqueurs.

Abstract

L'implication des radicaux libres dans les sciences de la vie n'a cessé d'augmenter avec le temps et a été relié à plusieurs processus physiologiques et pathologiques. Ce sujet englobe divers domaines scientifiques, allant de physique, de chimie biologique et bio-organique de la biologie et de la médecine, avec des applications à l'amélioration de la qualité de vie, la santé et le vieillissement. Compétences multidisciplinaires sont nécessaires pour une enquête complète sur les nombreuses facettes de processus radicaux dans l'environnement biologique et chimique des connaissances joue un rôle crucial dans les processus de dévoilement de base et les mécanismes. Nous avons développé une approche de biologie chimique capable de se connecter sans réactivité chimique radicale des processus biologiques, fournissant des informations sur les voies mécanistiques et des produits. Le cœur de cette approche est la conception de modèles biomimétiques pour étudier le comportement des biomolécules (lipides, les acides nucléiques et les protéines) dans les systèmes aqueux, l'obtention d'un aperçu de la réaction de voies ainsi unes la construction des bibliothèques moléculaires des produits de réaction du radical libre. Ce contexte peut être utilisé avec succès pour la découverte de biomarqueurs et des exemples sont fournis avec deux classes de composés: les mono-trans isomères d'esters de cholestérol, qui sont synthétisés et utilisés comme références pour la détection dans le plasma humain, et purines en 5 ',8-cyclo-2 '-désoxyribonucléosides, préparé et utilisé comme référence dans le protocole pour la détection de ces lésions dans des échantillons d'ADN, après radiations ionisantes ou obtenus à partir de différents problèmes de santé.

Introduction

La réactivité des radicaux libres a révélé son énorme importance pour de nombreux événements biologiques, y compris le vieillissement et l'inflammation. De nos jours, il est de plus en plus évident que la clarification de chaque étape chimique impliquée dans cette réactivité est nécessaire, afin de comprendre les mécanismes sous-jacents et des stratégies efficaces pour envisager le contrôle des radicaux libres et de réparation des dommages. La contribution des études chimiques est fondamental, mais l'étude directe dans le milieu biologique peut être difficile, car la superposition des différents processus complique et perturbe l'examen des résultats et des conclusions connexes. Par conséquent, la stratégie de la modélisation des réactions radicalaires dans des conditions biologiquement voisines est devenu une étape fondamentale dans la recherche de mécanismes chimiques en biologie.

Dans la dernière décennie, notre groupe a développé des modèles de procédés radicalaires dans des conditions biomimétiques. En particulier, nous FRvisaged transformations biologiquement pertinentes d'acides gras insaturés, les nucléosides, et du soufre contenant des acides aminés et les mettre dans la bonne voie pour être évalué et validé en tant que biomarqueurs de l'état de santé ^1-4.

Notre approche générale se compose de trois modules:

• Synthèse organique, qui donne accès à des biomolécules, dûment adaptée. Le plan de synthèse peut également être conçu de manière à simuler les processus de radicaux libres présents dans l'environnement biologique, appliquant ainsi les conditions capables de simuler le processus biologique d'intérêt, qui est le principe de la chimie biomimétique radicale. Dans les modèles biomimétiques le milieu réactionnel est l'eau ou un milieu hétérogène en raison de la coexistence de compartiments hydrophiles et hydrophobes. L'avantage de travailler avec des modèles biomimétiques est d'avoir un environnement simplifié avec des partenaires de réaction connues, où la réactivité et de produits peuvent être examinés plus en détail, peut-être découvrirvoies chimiques nouveaux. A partir de cette étape informations mécanistiques et cinétiques peuvent être recueillies;
• Purification, l'analyse et la caractérisation des produits, fournir des informations structurales et chimiques des biomolécules modifiées afin d'organiser et de faciliter les bibliothèques moléculaires recognition.in l'environnement plus complexe biologique. Les protocoles sont mis en place aussi en vue de résoudre des mélanges complexes de composés tels que ceux issus de spécimens biologiques;
• Le développement de biomarqueurs en utilisant des échantillons biologiques, dérivés soit par des expériences in vitro sur des cultures cellulaires et des études in vivo sur des animaux et des humains. Les protocoles développés dans des modèles biomimétiques sont ensuite appliqués à l'analyse d'échantillons complexes, d'envisager les transformations de radicaux libres dans des conditions différentes. Bibliothèques moléculaires développés par synthèse sont d'une grande aide à la découverte des sciences du vivant. Les informations collectées sur le libre giv radicale des transformationse l'occasion de comprendre les stratégies de réparation et de prévention. Bases de données sur les résultats peuvent être utilisés pour une évaluation approfondie par une analyse multivariée de l'importance biomarqueur aussi bien que possible les facteurs associés.

Nous avons choisi deux classes de biomarqueurs pertinents pour accréditer cette approche: les esters de cholestérol et de purines en 5 ',8-cyclo-2'-désoxyribonucléosides.

Protocol

1. Synthèse des mono-trans isomères des esters de cholestérol

1. Dissoudre esters de cholestérol (ou le linoléate de cholestérol ester acide arachidonique) dans le 2-propanol (15 mM). Pour une meilleure solubilisation, les échantillons ont été soumis à une sonication pendant 15 min sous atmosphère d'argon.
2. Transférer la solution dans un réacteur en quartz photochimique, ajouter le 2-mercaptoéthanol dans le 2-propanol (pour atteindre 7 mM de concentration, d'une solution 2 en stock M du thiol). Rincer le mélange réactionnel avec de l'argon pendant 20 min afin d'éliminer la présence d'oxygène dans la solution.
3. Irradier le mélange réactionnel par de la lumière UV à l'aide d'une lampe à mercure à basse pression 5,5 W à 22 ± 2 ° C pendant 4 min. Moniteur d'analyse par Ag-CCM (chromatographie sur couche mince d'argent) à la preuve de la formation des esters de cholestérol mono-trans (voir la figure 1 pour les formules chimiques). La coloration CCM est réalisée par coulée de la plaque dans le molybdate d'ammonium cérium (CAM) en solution, et les taches sur le chauffagela plaque. Stopper la réaction à un stade précoce, afin de récupérer le produit de départ, qui peut être réutilisé pour effectuer d'autres tours d'isomérisation, l'obtention d'une augmentation du rendement global.
4. Recueillir le mélange réactionnel dans un ballon à fond rond, laver l'appareil avec quelques ml de 2-propanol. Éliminer le solvant et purifier les isomères mono-trans des esters de cholestérol par Ag-CCM comme décrit dans la littérature. ⁵ Utilisation hexane-éther éthylique (9:1 v / v) comme éluant pour mono-isomères trans cholestéryl linoléate, l'hexane utilisation, alors que -diéthyléther-acide acétique (9:1:0,1 v / v) pour les mono-trans arachidonate cholestérol.

2. Isolement de la fraction esters de cholestérol de sérum humain

1. Diluer 1 ml de sérum humain (obtenu par centrifugation du sang) avec 1 ml de saumure et versez la solution dans une ampoule à décanter sous un courant d'argon afin d'éviter les artefacts (adduits d'oxydation, par exemple). Ajouter 10 ml de chloroforme-méthanol (2: 1 v / v) trois fois. Agiter l'ampoule à décanter très lentement de façon à limiter la formation de l'émulsion en raison de la présence de l'albumine.
2. Laver les couches organiques une fois avec de la saumure (10 ml), puis recueillir dans un erlenmeyer sous flux d'argon, on sèche sur sulfate de sodium anhydre. Éliminer les substances volatiles par évaporateur rotatif pour donner une huile jaune (fraction lipidique totale du plasma).
3. Relevez le brut avec 1 ml de chloroforme-méthanol (2:1 v / v), la charge sur une CCM preparative sous un courant d'argon et d'utiliser un mélange d'hexane-éther éthylique (9:1 v / v) comme éluant . Grattez la partie de silice contenant la fraction des esters de cholestérol et verser dans un flacon. Ensuite, l'extraction de la silice (3 x 5 ml) avec du chloroforme-méthanol (2:1 v / v), de recueillir les couches organiques et éliminer le solvant après évaporation de payer la fraction pure des esters de cholestérol (habituellement environ 1,5 mg).
4. Gardez esters de cholestérol dans une fiole de verre sombre couverte par une feuille d'aluminium sous argon et à -20 ° C. Cholesteryl eSters sont sensibles à la lumière et à l'oxygène.

3. Caractérisation des mono-esters de cholestérol trans par spectroscopie Raman

1. Extrait esters de cholestérol de sérum humain (≥ 0,7 mg) comme décrit dans la section 2, dissoudre dans une petite quantité de tétrachlorure de carbone (≤ 10 pi) et placer dans un flacon. CCl ₄ est choisi comme solvant car son signal Raman ne chevauche pas la région d'intérêt de l'analyse des esters de cholestérol.
2. Transférer la solution dans le porte-échantillon à travers une pipette de verre jetable, puis retirez délicatement le solvant par un lent courant d'argon. Une fois un film huileux uniforme est formée sur la paroi interne du porte-échantillon, placer celui-ci dans l'instrument de mesure.
3. Transformée de Fourier du spectre Raman des esters de cholestérol est obtenu directement sur les extraits lipidiques sans aucune réaction de dérivatisation. La puissance du laser sur l'échantillon est <100 mW pour éviter d'endommager l'échantillon. Le nombre total de numérisationspour chaque spectre est ≥ 800 à minimiser le bruit de fond.
4. La gamme 1,700-1,630 cm ^-1 du spectre Raman est analysée car elle reflète la contribution des C = C doubles liaisons présentes dans la molécule (C = C stretching mode). Une analyse de la courbe d'ajustement est effectué sur cette région, permettant ainsi à la distinction des contributions superposées de cis et trans des doubles liaisons dans la chaîne alkyle gras et double liaison dans le noyau B du cholestérol (voir Figure 2).
5. Pour monter correctement les bandes de vibration, certains paramètres doivent être fixes ou limités dans des limites raisonnables. Les profils de crête de composants sont décrits comme une combinaison linéaire de fonctions de Gauss et de Lorentz, alors que les largeurs de bande à mi-hauteur sont plus déterminée par la routine d'optimisation informatique. Le nombre et la position des pics de composants sont obtenus à l'aide des spectres quatrième dérivé, ce qui permet de détecter également des bandes de composantes faibles. Comme le signalpar rapport au bruit qui se détériore lors de la différenciation du signal peut empêcher l'utilisation de la dérivée quatrième, lissé dérivés quatrième avec un treize points Savitsky-Golay fonction, sont d'avantage: ainsi, un bon compromis entre la résolution et le rapport signal sur bruit est obtenu . Raccord meilleure courbe sont obtenus à plus faibles possibles c ² valeurs.
6. La présence d'isomères trans est révélée par le composant à 1671 ± 1 cm ^-1, en ​​outre, au moins, les deux composants, légèrement décalée vers les basses fréquences, due à la chaîne d'acide gras et de cholestérol liaisons C = C doubles. Représentant spectre Raman de cholestérols esters est illustré à la figure 9. Dans l'encadré de la comparaison d'une région spécifique de cholestéryle et le linoléate de mono-trans d'acide linoléique isomères cholestéryle est représenté.

4. Dérivation pour esters méthyliques d'acides gras (EMAG) et analyse par chromatographie en phase gazeuse

1. Dissoudreesters de cholestérol (environ 1,5 mg) avec 0,5 ml d'une solution 1 M d'hydroxyde de sodium dans le benzène-méthanol (2:3 v / v) et placer dans un flacon sombre couverte par une feuille d'aluminium sous atmosphère d'argon.
2. Laisser le mélange sous agitation à température ambiante et contrôle par CCM avec un mélange d'hexane-éther éthylique (9:1 v / v) comme éluant. Le temps de réaction est généralement de 30 minutes, mais une surveillance attentive est requise réaction. En effet, une fois que les esters méthyliques correspondants sont formés, la réaction doit être arrêtée afin d'éviter la formation de produits de dégradation et de côté. CCM a montré la formation quantitative des esters méthyliques.
3. Étancher le mélange réactionnel par ajout de 1 ml de saumure et extrait les esters méthyliques avec du n-hexane (3 x 2 mL). Rassembler les phases organiques dans un flacon et éliminer le solvant par évaporation rotative pour donner l'ester méthylique de la fraction, qui est ensuite utilisé pour l'analyse GC sans autre purification.
4. Dissoudre les esters méthyliques dans la quantité minimum de n-hexane (généralement 1 mg à 50 pi) et de l'injecter dans le GC équipé d'un 60 m × 0,25 mm x 0,25 um (50%-cyanopropyle)-méthylpolysiloxane colonnes. Utilisez un détecteur à ionisation de flamme (FID) avec le programme du four suivante: start température à 165 ° C, maintenir pendant 3 min, puis augmentation de 1 ° C / min jusqu'à 195 ° C, maintenir pendant 40 minutes, suivie d'une seconde augmenter de 10 ° C / min jusqu'à 240 ° C, et maintenir pendant 10 min. Un mode de pression constante (29 psi) est choisi. L'hélium ou l'hydrogène peut être utilisé comme gaz porteur. Les esters méthyliques sont identifiés par comparaison avec les temps de rétention des échantillons authentiques. La figure 10 montre une analyse représentative de FAME GC obtenu à partir esters de cholestérol plasmatique.

5. Synthèse de la (5'R) - et (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-désoxyadénosine

1. Dissoudre 33 mg de 8-bromo-2'-désoxyadénosine (8-Br-dAdo) dans de l'acétonitrile (100 ml) afin de parvenir à une concentration de 1 mM. Réguler le débit de gaz (Ar ou N2) dans le photoréacteur et remplir l'appareils avec la solution de 8-Br-dAdo.
2. Préparer un septum avec la taille appropriée pour l'entrée du photoréacteur et passer une aiguille reliée à la conduite de gaz inerte à travers le centre de celui-ci. Fermer le système avec le septum. Rincer le gaz inerte pendant 30 mn.
3. Irradier par lumière UV en utilisant une lampe au mercure 125W à pression moyenne à 22 ± 2 ° C pendant 15 min, recueillir la solution dans 250 ml d'un ballon. Laver le photoréacteur avec 10 ml d'acétonitrile et de recueillir de lavage dans le même ballon.
4. Étancher le mélange réactionnel brut avec 1 M de NH ₄ OH solution et évaporer le solvant à l'évaporateur rotatif.
5. Exécuter haute analyse chromatographique liquide haute performance (CLHP-UV) avec une colonne analytique (voir la section instrumentation) dans des conditions connues, et de comparer le profil avec des composés de référence.
6. Exécuter haute analyse chromatographique liquide haute performance (CLHP-UV) avec une colonne analytique (voir la section instrumentation) en utilisant les éléments suivants solévents et des dégradés: 2 mM formiate d'ammonium comme solvant A et l'acétonitrile comme solvant B. Régler le débit de 1 ml / min et le gradient de solvant B 0% à 0,3% de solvant B à atteindre en 2,2 min. Alors B 0,8% en solvant 4,0 min, puis le solvant B 1% en 4,8 min. Rester à solvant B à 1% pendant 9 min puis passez à solvant B 8% en 6 min. Après aller à solvant B à 10% en 4 min et le solvant B 30% en 5 min et rester à solvant b 30% pour les autres 5 min. Recueillir les pics chromatographiques correspondant aux deux produits diastéréoisomères dans deux flacons différents.
7. Mesurer l'absorbance des deux fractions collectées dans le spectrophotomètre UV et calculer la concentration exacte basée sur la loi de Beer-Lamber (A = εlC, où A est l'absorbance, ε le coefficient d'extinction et l la longueur de la cellule). Utilisez le coefficient d'extinction ε de la 2'-désoxyadénosine (Dado) (15 400 M ^-1 cm ^-1 à 260 nm).

6. Synthèse de (5'R) - und (5'S) -5 ',8-cyclo-2'-désoxyguanosine

1. Dissoudre 35 mg de 8-bromo-2'-désoxyguanosine (8-Br-dGuo) et 30 mg d'iodure de sodium (NaI) dans de l'eau distillée (100 ml) afin de parvenir à la concentration 1mM et 2 mM, respectivement. Réguler un gaz inerte (Ar ou N ₂₎ d'écoulement raccordé à la photoréacteur et remplir le photoréactif avec la solution de réaction.
2. Dégazer le mélange réactionnel comme décrit dans la procédure 5 (étape b).
3. Irradier par de la lumière UV en utilisant une lampe au mercure moyenne pression 125W à 22 ± 2 ° C pendant 30 min, recueillir la solution dans 250 ml d'un ballon à fond rond. Laver le photoréacteur avec 10 ml d'eau et récupérer l'eau de lavage dans le même ballon.
4. Étancher le mélange réactionnel brut avec 1 M de NH ₄ OH solution et évaporer le solvant sous vide.
5. Procéder à l'analyse comme décrit dans la procédure 5 (étapes e à g). Utilisez le coefficient d'extinction ε de la 2'-désoxyguanosine (dGuo) (11 700 M ^-1 cm ^-1 à 260 nm).

7. Synthèse de la purine marqué isotopique (5'R) - et (5'S) -5 ',8-cyclonucleosides

1. Préparer 2 ml de 1 mM solution aqueuse (eau distillée) des ¹⁵ N isotopique nucléosides marqués ([15N ^5] dAdo ou [15N ^5] dGuo) dans un flacon en verre (4 ml) avec un bouchon septum.
2. Raccorder le flacon avec le bouchon septum et se connecter à la conduite de gaz (N ₂ O pour la saturation de la solution) par l'intermédiaire d'une aiguille dans le septum qui atteint le fond du flacon. Une autre petite aiguille dans le septum fonctionne comme la sortie de gaz.
3. Rincer la solution de N ₂ O pendant 30 min. Le flux de gaz est réglée pour être très faible.
4. L'aiguille est sortie premier sorti et après 1 'l'une à long suit, afin d'avoir une faible pression à l'intérieur du flacon.
5. Mettez la solution dans l'appareil de la radiolyse gamma pendant 8 heures (calcul sur la base d'un débit de dose ca. 4,5 Gy / min).
6. Après la réaction étancher le brut avec 1 M NH ₄
7. Exécuter haute analyse chromatographique liquide haute performance (CLHP-UV) dans des conditions connues, ⁶ et comparer le chromatogramme avec les références normalisées.

8. La radiolyse gamma de DNA Solutions aqueuses

1. Préparer 1 ml de 0,5 mg / ml solution (eau distillée) de l'ADN de thymus de veau et mettre dans un flacon en verre (2 ml) avec un bouchon septum.
2. Dégazer la réaction comme décrit dans Procédure 7 (étapes bd).
3. Mettez la solution dans l'appareil de la radiolyse gamma pendant 30 min (calcul sur la base de la dose / taux de ca. 4,5 Gy / min).

9. La digestion enzymatique de l'ADN

1. Dans un tube Eppendorf contenant 80 pg d'ADN, ajouter 8 U de nucléase P1, 0,01 U de la phosphodiestérase II, 20 nmoles de EHNA dans 20 ul de 300 mM d'acétate de sodium (pH 5,6) et 10 mM de chlorure de zinc. Incuber le mélange à 37 ° C pendant 48 heures.
2. Ensuite, ajoutez un mélange de 8 U de phosphatase alcaline, 0,02 U de phosphodiesterase I, dans 40 ul de 0,5 M tampon Tris-HCl (pH 8,9) à la digestion mélange. L'échantillon est incubé à 37 ° C pendant 2 heures.
3. Le mélange est neutralisé par addition d'acide formique 10%.
4. Transférer l'échantillon dans un Amicon Ultra-0.5 dispositif de filtre centrifuge (coupure 3 kDa), ajouter 200 ul de tridistilled H O. ₂ Placez l'Ultra-filtre dans le rotor de la centrifugeuse à 14.000 xg pendant 15 min. Puis séparer le dispositif Ultra filtre du microtube. Lyophiliser la solution sans enzyme dans le tube à centrifuger.

10. Dessalement échantillon d'ADN avant analyse

1. Exécuter haute analyse chromatographique liquide haute performance (CLHP-UV) avec une colonne analytique (voir la section instrumentation) à la suite des conditions connues ^6.
2. Dissoudre l'ADN digéré lyophilisé dans 20 ul de H ₂ O et injecter en HPLC-UV.
3. Recueillir l'échantillon dans un flacon après l'élution de sel (premières minutes) et juste avant le tim élutione du premier nucléoside (5'R-cdGuo), jusqu'à la fin du programme chromatographique.
4. L'échantillon est lyophilisé et resolubilisée dans 20 pi d'eau.

11. LC-MS/MS Analyse quantitative

1. Préparer les CLHP-SM/SM (triple quadripôle) avant de commencer l'analyse en chargeant la méthode analytique et la méthode pour le détecteur MS (ESI) ^6.
2. Ajouter 1 pl du mélange isotopique des composés marqué dans l'échantillon préparé dans la procédure 7.
3. Injecter 20 ul de la solution d'ADN digéré pointes dans l'eau distillée.
4. Les données chromatographiques obtenus sont élaborés sur la base de l'étalonnage précédent avec des composés de référence. Un représentant de fonctionner HPLC contenant l'adénosine et guanosine 2'-désoxyribonucléosides et leur oxydation et dérivés cyclo est illustré à la figure 11.

Representative Results

Le procédé d'isomérisation a été décrit en particulier pour les esters de cholestérol offrant les isomères mono-trans des acides linoléique et arachidonique montre la figure 1 que les premiers produits de cette attaque, qui peuvent se produire dans des conditions de stress radicaux libres dans le milieu biologique ^5.

Dans la figure 3 le mécanisme chimique impliquée dans l'isomérisation cis-trans double liaison est affichée. La source de radicaux est indiqué de façon générique pour permettre S radicaux centrés. Les protocoles décrits dans la source de radicaux libres est une lumière UV qui est capable de rompre la liaison présente homolitically SH dans la molécule thiol RSH.

La figure 4 résume le protocole trois étapes pour la synthèse de la catégorie de lipides modifiés et leur détection dans le plasma humain: la synthèse biomimétique représente un procédé de radicaux libres et fournit également une entrée d'un pot facile à l'GEOMETisomères riques, sans aucune contamination par les isomères de position suivie de protocoles de purification et d'isolement.

Plusieurs méthodes d'analyse peuvent être appliquées pour une détection hautement sensible de la teneur en isomères trans et la caractérisation de la bibliothèque mono-trans des esters de cholestérol. En particulier, la spectroscopie Raman peut être effectuée directement sur ​​la fraction des esters de cholestérol sans dérivatisation (voir Figure 2 et Figure 9).

Le deuxième exemple concerne la purine 5 ',8-cyclo-2'-désoxyribonucléosides, qui sont créés par des lésions de l'ADN de l'attaque des radicaux libres à la position "C5 de la partie sucre et la formation subséquente d'une liaison covalente entre le sucre et la base fragments. Quatre structures peut être réalisé, c'est-à-5 ',8-cyclo-2'-désoxyadénosine et 5 ',8-cyclo-2'-désoxyguanosine, qui sont dans les deux 5'R et 5'S formes diastéréoisomères (Figure 5). Dans la figure 6 til est représenté mécanisme réactionnel, qui comprend la photolyse des dérivés de 8-bromopurine 5 pour donner le radical correspondant C8 6, qui fait abstraction intramoléculaire d'un atome d'hydrogène à partir de la position de l'C5 'sélectivement pour donner le 7-2'-5'-deoxyadenosin yle. 7 subit une cyclisation radicalaire avec une vitesse constante dans la gamme de 10 ⁵ -10 ⁶ s ^{-1, 2} suivie de l'oxydation du radical hétéroaromatique 8 pour donner les produits finals ^9. La réaction des radicaux hydroxyle, généré par radiolyse de l'eau, avec la 2'-désoxyadénosine et 2'-désoxyguanosine (10) a été trouvée pour produire env. 10% par abstraction d'hydrogène à partir de la position C5. ⁷

Notre approche de la biologie chimique pour les bibliothèques de purine 5 ',8-cyclo-2'-désoxyribonucléosides (y compris les composés marqués) est illustrée à la figure 7, avec l'identification de ces lésions dans les oligonucléotides ainsi que dans des échantillons d'ADN provenant de vaférents sources telles que, par exemple, traité dans des conditions de rayonnement ionisant, comme imiter des conditions de stress radicalaire.

Dans la figure 8 un équipement photoréacteur typique est montrée. Le dispositif permet l'irradiation de composés dissous dans le solvant approprié. Il se compose de: i) la chambre de réaction équipé de l'arrivée du gaz inerte (en bas) et deux entrées pour la sortie du gaz et de l'addition des réactifs, ii) une chambre interne contenant la lampe à mercure approprié relié à un système de refroidissement et l'énergie électrique, qui est inséré dans la chambre de réaction à travers un joint de verre.

Figure 1. Mono-trans de linoléate de cholestéryle et l'arachidonate.

Figure 2. Esters de cholestérol dans le sérum et l'analyse directe de l'homme de mono-trans par spectroscopie Raman.

Figure 3. Le processus d'addition-élimination qui conduit à l'isomérisation cis-trans de liaisons doubles par des radicaux thiyles.

Figure 4. Trois étapes protocole pour le développement des esters de cholestérol mono-trans comme biomarqueur du stress radicaux libres.

Figure 5. La purine quatre 5 ',8-cyclo-2'-désoxyribonucléosides diastéréoisomères. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 6. Génération de C5 'radicaux, soit par photolyse de 5 ou par réaction de 10 avec HO • radicaux, et le mécanisme de la purine 5' ,8-désoxyribonucléoside formation cyclo-2 '. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 7. Protocole fou l'identification de certaines lésions de l'ADN des radicaux base; ADNmt: l'ADN mitochondrial, ADNn: l'ADN nucléaire.

Figure 8. Réacteur photochimique.

Figure 9. Représentant spectre Raman de cholestérols esters. Dans l'encart de la comparaison avec une région spécifique de cholestéryle et le linoléate de cholestérol mono-trans d'acide linoléique.

Figure 10. Représentant GC analyse des FAME obtenu à partir esters de cholestérol plasmatique.

<strong> Figure 11. Représentant HPLC fonctionner contenant 2'-désoxyadénosine et 2'deoxyguanosine avec leur oxydation et de la purine 5 ',8-cyclo-2'-désoxyribo nucléosides. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

La conversion d'origine naturelle d'acides gras insaturés cis à trans isomères géométrique est une transformation liée à la production de stress radicalaire dans le milieu biologique. Lipides des membranes cellulaires, qui contiennent des acides gras, sont une cible biologique pertinent pour le stress radicale et nous avons d'abord étudié le endogène isomérisation cis-trans phospholipides dans les cultures cellulaires, les animaux et les humains évaluation des protocoles d'analyse dans chaque cas ^8-10. Nous avons démontré que cette transformation peut se faire par divers composés contenant S, y compris les thiols, les thioéthers et les disulfures, qui, sous différentes conditions de stress radicalaire capables de générer des radicaux, c'est-à thiyles l'agent d'isomérisation (figure 3). L'exemple présenté dans cet article se concentre sur la classe des esters de cholestérol, ce qui représente une fraction bien connue des lipides plasmatiques, strictement impliquée dans le métabolisme des lipoprotéines. La liaison ester entre les acides gras et les cholestérol est synthétisée par le transfert des acides gras à partir de la position 2 du fragment de glycérol phosphatidylcholine et le cholestérol, une étape catalysée par la lécithine cholestérol acyl enzyme transférase (LCAT). Par conséquent, les taux plasmatiques esters de cholestérol sont strictement liés au chiffre d'affaires lipidique de la membrane, et contiennent des proportions relativement élevées d'acides gras polyinsaturés (AGPI) habituellement présents dans les phosphatidylcholines, linoléique et les acides arachidonique dire. Formation des lipoprotéines est impliqué dans les maladies cardiovasculaires et métaboliques. La réactivité des esters de cholestérol naturelles avec les radicaux libres peuvent se produire au niveau des doubles liaisons de linoléate et les résidus arachidonate, qui peuvent être transformés en les trans correspondants isomères géométriques (voir la figure 1 pour les structures). Caractérisation de la teneur en esters de cholestérol trans dans des échantillons biologiques est intéressante pour le développement de biomarqueurs. Une méthode indirecte consiste en la transformation de cholesteryl esters isolé du plasma des correspondants esters méthyliques d'acides gras (FAME) et la séparation par chromatographie en phase gazeuse protocoles. Dans ce cas, la calibration des références normalisées de cis et trans esters méthyliques d'acides gras est effectuée, afin de permettre la quantification de la teneur en trans dans les échantillons. Sur la base des études analytiques réalisées sur la bibliothèque des esters de cholestérol, nous avons proposé d'appliquer également une méthode basée sur la spectroscopie Raman, qui peut être effectué directement sur ​​la fraction des esters de cholestérol isolé du plasma, sans dérivatisation à la suite de la FAME correspondant (voir les figures 2 et 9). Il est à noter que jusqu'à présent, aucune des méthodes efficaces sont décrits en cis et trans isomères séparés des acides gras contenant des lipides par HPLC, comme décrit par lieu hydroperoxydes d'ester de cholestérol. Jusqu'à présent, la méthode indirecte de gaz chromatographique est encore la meilleure méthode disponible à ce jour. Par cette méthode, la première quantitative évaation de la teneur en mono-trans dérivé d'esters de cholestérol, isolé à partir de plasma de sujets sains a été communiquée. Utilisation détecteur à ionisation de flamme (FID) la limite de détectabilité est satisfaisante (ppb) et les quantités nanomolaires des composés ont été détectés. ^5. Avec différents systèmes de détection de cette limite peut être abaissée encore. L'effet des rayonnements ionisants sur la matière esters de cholestérol est d'autres études, que ce soit une réponse linéaire est obtenu par rapport à la dose appliquée.

Comme second exemple, nous avons choisi nucléosides modifiés qui peuvent être produites par les dommages des radicaux libres de l'ADN. Les radicaux hydroxyles (HO •) sont connus pour être les espèces les plus nuisibles réactives de l'oxygène (ROS) pour leur capacité à provoquer des modifications chimiques de l'ADN. Lésions uniques ou multiples peuvent se produire sur l'ADN, que dans les cellules eucaryotes est situé dans le noyau et les mitochondries. L'identification et la mesure des principales classes d'oxydation des dommages à l'ADN générées nécessitent appropriate bibliothèques moléculaires dans le but de mettre en place les protocoles d'analyse. Nous avons concentré notre intérêt sur les lésions les plus petites en tandem, qui sont purine 5 ',8-cyclo-2'-désoxyribonucléosides, ayant une liaison covalente supplémentaire entre la base et les fragments de sucre créés par l'attaque des radicaux libres. Les composés sont des 5 ',8-cyclo-2'-désoxyadénosine et 5 ',8-cyclo-2'-désoxyguanosine qui sont dans les 5'R et 5'S formes diastéréoisomères (Figure 5). Leur potentiel à devenir libre marqueur de stress radicalaire est question de la recherche fondamentale. ^{2 En} effet, lorsque l'ADN est exposé à HO • abstraction radical hydrogène à partir de la position C5 'du sucre est l'un des événements possibles conduisant à la formation de ces lésions tandem. Purine 5 ',8-cyclonucleosides peut être mesuré comme la somme des diastéréoisomères par CLHP-SM/SM à une digestion enzymatique des échantillons d'ADN γ-irradiés variables de 1 à 12 lésions / 10 ⁶ / Gy nucléosides va absence forme d'oxygène au niveau physiologique de l'oxygène Jetissus n, le rapport diastéréoisomérique 5'R / 5'S étant ~ 4 et ~ 3 pour 5 ',8-cdAdo et 5' ,8-cdGuo, respectivement (figure 11). ¹¹ Il est intéressant de noter que la relation entre la dose de rayonnement et 5 ',8-cdAdo et 5' ,8-cdAdo lésions détectées dans l'ADN cellulaire est loin d'être compris. L'expérience unique fondée sur l'irradiation 2kGy signalés dans le groupe expérimental ne peut pas être considérée comme concluante. ¹¹ D'autres expériences de ce genre et la quantification analytique des quatre lésions sont nécessaires pour définir une telle relation. La détection de ces lésions et les transformations les plus populaires oxydants (comme la 8-oxo-2'-désoxyguanosine, 8-oxodGuo) sont des matières de recherches intenses, mettant en évidence l'importance des deux lésions au cours du métabolisme oxydatif. ^6,13 L'utilisation de HPLC -MS/MS (triple quadripôle) a une limite de détection proche de 30fmol pour les quatre lésions. Dernières améliorations sont demandées pour atteindre des limites de détection de niveaux attomol par le produ instrumentteurs. Sur la base de la littérature très récente, ⁶ procédures analytiques doivent inclure le nettoyage approprié de l'échantillon et d'enrichissement afin de respecter les limites de détection de la MS / MS / MS (piège à ions) ou de la MS / MS (triple quadripôle) utilisée dans notre cas.

Bio-inspirés des procédés de synthèse de composés 1-4 ont été développés à partir de 8-bromopurine dérivés dans ou photolyse. ^7,12 Ces procédures impliquent une réaction en cascade radicale qui imite le mécanisme de dommages à l'ADN de formation de 5 ',8-cdAdo et 5' ,8-cdGuo lésions. Du point de vue biologique, il a été constaté que ces lésions s'accumulent avec l'âge de façon tissu-spécifique (foie> rein cerveau>), ce qui prouve que les mécanismes de réparation de l'ADN sont insuffisantes pour préserver le matériel génétique de ces lésions. ¹³ En effet, la réparation par excision de nucléotides (TNS) est la seule voie actuellement identifiées pour la réparation de ces lésions. ²

Le cours de deuxes par les composés montrés dans les figures 1 et 5 ne sont pas disponibles dans le commerce pour le moment, mais par les stratégies de synthèse décrites dans la littérature, il ne serait pas difficile de préparer ces composés à des fins commerciales.

L'approche multidisciplinaire fournie par des études de biologie chimique a non seulement une valeur énorme à l'identification de nouveaux mécanismes qui se produisent dans l'environnement biologique, mais donne aussi une contribution fondamentale à la découverte de biomarqueurs et des diagnostics, en fin de compte apporter la nouveauté dans les soins de santé et les stratégies de prévention. ¹⁴ L' contribution chimique est nécessaire pour un développement réussi de la médecine moléculaire, la création de plates-formes intégrées et panneaux pour le profilage métabolique qui devraient permettre une rationalisation optimale de conception de l'intervention, soit thérapeutique et nutritionnel, de réduire les incertitudes et les échecs quand ils ne peuvent être prévisibles.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MATERIALS
Cholesteryl linoleate ≥98%	Sigma-Aldrich	C0289-100 mg
Cholesteryl arachidonate≥95%	Sigma-Aldrich	C8753-25mg
2-mercapt–thanol	Sigma-Aldrich	M6250-100 ml
2-propanol	Sigma-Aldrich	34965-1L
Methanol 215 SpS	Romil	H409-2,5 L
Ethanol	Sigma-Aldrich	02860-2.5L
Chloroform SpS	Romil	H135 2,5 L
n-Hexane 95% SpS	Romil	H389 2,5 L
Acetonitrile 230 SpS	Romil	H047 2,5 L
Dichloromethane SpS	Romil	H2022,5 L
Carbon tetrachloride	Sigma-Aldrich	107344-1L
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
Diethyl ether	Sigma-Aldrich	309966-1L
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-5KG
NaOH solid	Sigma-Aldrich	221465-25G
NH4OH sol. 28%-30%	Sigma-Aldrich	221228-1L-A
Acetic acid	Sigma-Aldrich	320099-500ML
Ammonium Cerium(IV)sulfate dihydride	Sigma-Aldrich	221759-100G
Ammonium Molybdate tetrahydrate	Sigma-Aldrich	A7302-100G
Sulfuric Acid 95%-98%	Sigma-Aldrich	320501-1L
Silver Nitrate	Sigma-Aldrich	209139-25G
Sodium sulfate anhydrous	Sigma-Aldrich	238597-500G
Nuclease P-I from penicillium citrinum	Sigma-Aldrich	N8630-1VL
Phosphodiesterase II type I-sa	Sigma-Aldrich	P9041-10UN
Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)adenine, hc	Sigma-Aldrich	E114-25MG
Phosphatase alkaline type VII-t from*bov	Sigma-Aldrich	P6774-1KU
Phosphodiesterase I type VI	Sigma-Aldrich	P3134-100MG
Deoxyribonuclease II type IV from*porcin	Sigma-Aldrich	D4138-20KU
Trizma(r) base, biotechnology performanc ce	Sigma-Aldrich	T6066-100G
EDTA	Sigma-Aldrich	E1644-100G
Succinic acid bioxtra	Sigma-Aldrich	S3674-250G
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C5670-100G
Formic acid, 98 %	Sigma-Aldrich	06440-100ML
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membrane	Millipore	UFC500324
8-Bromo-2'-deoxyguanosine	Berry Associates	PR3290-1 g
8-Bromo-2'-deoxyadenosine	Berry Associates	PR3300-1 g
Sodium iodide	Sigma-Aldrich	383112-100G
Sodium hydrogen carbonate	Carlo Erba	478536-500 g
2'-deoxyguanosine:H2O (U-15N5, 96-98%)	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3899-CA-0.1
2'-deoxyadenosine (U-15N5, 98%) 95%+ CHEMICAL PURITY	Cambridge Isotope Laboratories, Inc	CILNLM-3895-0.1
Nitrous oxide (N2O)	Air Liquide
Deoxyribonucleic acid from calf thymus	Sigma Aldrich	D4522-5MG
EQUIPMENT
60Co-Gammacell	AECL- Canada	220
Immersion well reaction medium pressure 125 watts	Photochemical reactors ltd	Model 3010
Evaporating flask 250 ml	Heidolph	P/N NS 29/32 514-72000-00
Luna 5 μm C18(2) 100 Å, LC Column 250 x 4.6 mm	Phenomenex	00A-4252-E0
Alltima C8 Column 250 x 10 mm 5 μm	Grace	88081	Semipreparative
SecurityGuard Kit	Phenomenex	KJ0-4282	Analytical holder kit and accessories
Holder for 10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7220	Semipreparative holder
10.0 mm ID cartridges	Phenomenex	AJ0-7221
High-performance liquid chromatography (HPLC)	Agilent	1100
LC/MS/MS	Applied Biosystems	4000QTRAP System
Tandem mass ESI spectrometer	(Bruker Daltonics)	Esquire 3000 plus
Vial 2-4 ml	SUPELCO	Cod 27516
Vial 4 ml	SUPELCO	Cod 27517