Summary
Este documento describe un nuevo método para la infección oral de ratones utilizando
Abstract
L. monocytogenes son facultativos patógenos bacterianos intracelulares que causan las infecciones transmitidas por los alimentos en los seres humanos. Muy poco se sabe acerca de la fase gastrointestinal de listeriosis debido a la falta de un modelo animal pequeño que imita la enfermedad humana. Este documento describe un modelo de ratón novedoso para la transmisión oral de L. monocytogenes. Usando este modelo, los ratones alimentados con L. monocytogenes-contaminada pan tiene una fase discreta de infección gastrointestinal, seguido por diversos grados de propagación sistémica en cepas de ratones susceptibles (BALB / c / Por / J) o resistentes (C57BL / 6). Durante las últimas etapas de la infección, se observa la difusión de la vesícula biliar y el cerebro. El modelo transmitidas por los alimentos de la listeriosis es altamente reproducible, no requiere habilidades especializadas, y se puede utilizar con una amplia variedad de cepas bacterianas y las cepas de ratón de laboratorio. Como tal, es el modelo ideal para estudiar tanto las estrategias de virulencia utilizados por L. monocytogenes
Introduction
Listeria monocytogenes son facultativos patógenos bacterianos intracelulares que causan las infecciones transmitidas por los alimentos en los seres humanos. Las bacterias son resistentes a muchos de los procesos que se utilizan para proteger nuestro suministro de alimentos, tales como el secado, la salazón, o 1,2 refrigeración y las infecciones son generalmente vinculados a los alimentos procesados y "listos para comer" que no son calentados antes de su consumo . En varios brotes anteriores, la fuente de L. alimentos monocytogenes-contaminada se identificó, y el grupo restringido de los individuos expuestos se controló estrechamente 3-6. En estos ejemplos, la enfermedad clínica en individuos por lo demás sanos varió desde una leve gastroenteritis autolimitada a las infecciones intestinales y sistémicas más graves que requirieron hospitalización. L. infecciones monocytogenes en los individuos inmunocomprometidos, incluyendo tanto los recién nacidos y los ancianos, se han asociado con una alta tasa de mortalidad (25-30%), a pesar del tratamiento antibiótico
El modelo más ampliamente utilizado de la listeriosis es la inoculación intravenosa (iv) de los ratones. El modelo IV es altamente reproducible, y ha sido extremadamente útil para estudiar las respuestas de células T, tanto naïve y de memoria durante la infección 9,10. El inconveniente del modelo IV es que se evita por completo la fase intestinal de la infección. Después de la transmisión transmitidas por los alimentos, la mucosa intestinal proporciona una barrera que, presumiblemente, se ralentiza y limita el número de bacterias que pueden difundir continuamente a los tejidos periféricos. Por el contrario, todo el inóculo se puede encontrar en el bazo y el hígado en cuestión de minutos de la administración iv, y esta gran bolo de organismos puede abrumar d inmune innatoefenses en estos tejidos. La infección oral de los ratones por sonda se utiliza con menor frecuencia, ya que las dosis grandes (10 9 -10 11 CFU) suelen ser necesarios para lograr la colonización intestinal 10. Además, la inoculación intragástrica (IG) con una aguja de alimentación no genera un período reproducible de infección gastrointestinal antes de la diseminación sistémica. Algunos laboratorios han informado de que L. monocytogenes alcanzan el bazo y el hígado dentro de 4-12 horas después de la infección (hpi), mientras que otros no mostraron diseminación sistémica hasta 48 hpi 11-15. Esta variación de laboratorio a laboratorio puede ser una consecuencia de la naturaleza invasiva de la inoculación ig, lo cual puede resultar en menor trauma en el revestimiento del esófago, y promover la circulación sanguínea invasión directa de las bacterias.
Recientemente hemos desarrollado un modelo de ratón de la novela oral de L. infección monocytogenes que imita muy de cerca todas las fases de la enfermedad humana 16. La infección se produce cuando los ratones ingieren trozos de contaminado alimentos, un proceso que es no traumática, y no requiere de habilidades especiales por los investigadores de laboratorio. Durante un período discreto de tiempo (36-48 horas), L. monocytogenes reproducible sólo colonizan el tracto gastrointestinal, permitiendo de este modo la investigación de los mecanismos utilizados por patógena Listeria a trasladar a través de la mucosa intestinal y difundir a los tejidos periféricos. Es importante destacar que, el modelo se puede utilizar para estudiar las diferencias en la resistencia innata huésped a la infección. En un estudio anterior, hemos demostrado que BALB / c / A / J ratones fueron altamente susceptibles a la listeriosis transmitida por los alimentos, con la replicación exponencial de L. monocytogenes que ocurren en el intestino, el bazo, el hígado, la vesícula biliar y 16. En contraste, los ratones C57BL / 6 fueron resistentes a la infección transmitida por alimentos, con sólo la colonización transitoria de L. monocytogenes se producen en cada uno de estos tejidos. Una característica adicional del modelo transmitidas por los alimentos que imita la enfermedad humana es que la difusión naturalesal cerebro se produjo durante las últimas etapas de la infección (dpi 5-7).
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Protocol
1. Preparación de medios de agar selectivos (BHI / L + G) para inhibir la microbiota intestinal
- Pesar 26 g de cerebro y corazón Infusion Agar (Difco), 7,5 g de LiCl y 5,0 g de glicina y colocar en un matraz de 1 litro. Añadir 500 ml de agua desionizada.
- Calentar en un agitador magnético hasta que hierva el agar, agitando continuamente. Tome el frasco del fuego, deje que las burbujas se establecen brevemente y, a continuación, llevar de nuevo a hervir de nuevo.
- . Autoclave durante 30 minutos a 121 ° C en 16 a 19 psi en un ciclo de líquido Nota: deje la barra de agitación en matraz.
- Equilibrar los medios de comunicación a 55 ° C en un baño de agua o deje que se enfríe a temperatura ambiente. No permita que la solución para llegar más fresco a 55 ° C o los cristales se forman en el agar. Los cristales no inhiben L. monocytogenes o afecta a las propiedades selectivas de los medios de comunicación. Sin embargo, los cristales serán similares en apariencia a las pequeñas colonias y hará que sea difícil para contar UFC bacteriana.
- Mezclar suavemente elagar durante 1 min utilizando un agitador magnético. Evite la formación de burbujas de aire. Vierta el agar en placas de Petri (~ 25 ml / placa).
Nota: Este soporte no es compatible con el crecimiento de toda L. cepas monocytogenes. Por ejemplo, L. monocytogenes EGDe crece bien en este agar, con colonias visibles dentro de 36-48 horas, pero 10403S no crece en este medio.
2. Preparación del Inóculo
- Cortar el pan blanco en rodajas (Kroger) en pequeñas (2-3 mm) cubos con tijeras ora bisturí estéril estéril. No utilice las costras. La tienda de piezas individuales en tubos de microcentrífuga a -20 ° C hasta el día de la infección.
- Usando un bisturí estéril, cortar pequeños (0.5-1 cm) trozos de mantequilla salada (Kroger) y coloque cada uno en un tubo estéril de microcentrífuga. Cada tubo contendrá mantequilla suficiente para preparar 50 a 60 piezas de pan. Almacenar a -20 ° C hasta que se necesite.
- Crecer L. monocytogenes en caldo BHI agitación a 30 y°; C hasta que el cultivo alcanza una DO 600 de ~ 0,8-1,0. Preparar 500 ml de alícuotas en tubos de microcentrífuga, teniendo cuidado de vórtice de la muestra con frecuencia por lo que todos los tubos contienen el mismo número de bacterias. Almacenar a -80 ° C.
- A título de las alícuotas bacterianas, descongelar un tubo en hielo y añadir 500 l de 9,5 ml de caldo BHI. Incubar durante 1,5 horas de pie a 30 ° C. Diluciones en serie de placas de agar BHI. Esperar un título de ~ 1-5 x 10 8 UFC / ml Nota:. Si se preparan alícuotas homogéneos, pueden esperar cada uno de los tubos para rendir este título cuando se preparan de una manera similar con una varianza de 2 a 4 veces.
- Para infectar ratones, preparar una alícuota de L. monocytogenes como se describe en el paso 2.4. Acerca de 20 minutos antes de la L. cultura monocytogenes está listo, descongelar los trozos de pan a temperatura ambiente. Derrita una alícuota de mantequilla a 55 ° C y precalentar un pequeño volumen de PBS a 55 ° C. Preparar trozos lo suficientemente pan de manera que hay al menos una por ratónde estar infectados y al menos una pieza adicional para la determinación del título de la inóculo real.
- Basado en el título predeterminado de la alícuota bacteriana, calcular el volumen total de L. cultura monocytogenes necesario para preparar los inóculos para el número requerido de piezas de pan. Pellet las bacterias por centrifugación a 14.000 xg durante 10 min Aspirar todo el caldo BHI y resuspender las bacterias en un pequeño volumen de PBS precalentado (2 l / pan pieza).
- Vortex la mantequilla derretida, añadir a las bacterias (con un volumen total igual a 3 l / pedazo de pan) y mezclar bien Nota:. No trate de preparar más de 10 a 15 piezas de pan en un momento o la mantequilla se solidifique.
- Trabajando rápidamente, pipeta de 5 l de la suspensión bacteriana en un único trozo de pan en un tubo de microcentrífuga. La solución debe ser completamente absorbida por la pieza de pan.
- Para determinar el título real del inóculo, añadir 1 ml de PBS estéril a una de las piec panes. Vórtice vigorosamente durante 1 min. Preparar diluciones en serie y la placa tanto BHI y BHI / L + g de agar.
- Procedimiento alternativo para la alta concentración (> 10 9 CFU) inóculos. Si el sedimento bacteriano es demasiado grande, puede ser difícil a suspender en un volumen tan pequeño, y el material resultante es muy viscosa, como una pasta, y algunos de los inóculo puede pegarse a las paredes del tubo de microcentrífuga. En este caso, es mejor para inocular el pan en una placa de cultivo mm estéril 60, y para ofrecer todo el plato (sin la tapa) en el ratón (véase más adelante). Cualquier exceso de inóculo que no es absorbida por el pan, entonces puede ser consumido directamente por el ratón. En general, se necesita más tiempo para que los ratones a comer todo el pan y lamer el plato limpio que el protocolo estándar que se describe a continuación, por lo que esto sólo es el método preferido cuando se trata de muy alto inóculos título.
3. La infección de ratones
- Compra hembra BALB / c / A / J (de stock # 0010026) y C57BL/6/J (acción# 000644) de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME) y el uso de 6-9 semanas de edad.
- Rápida a los ratones un día (24 horas) antes de la infección mediante la eliminación de la comida y la colocación de los ratones en elevada (1 pulgada) de suelos de alambre (# 3 malla; Allentown) para prevenir coprofagia. Deja sólo lo suficiente ropa de cama en la jaula para absorber la orina, pero no lo suficiente como para elevar las heces derramadas. Permitir el acceso restringido al agua.
- Infect los ratones en el inicio del ciclo de oscuridad, de trabajo en una campana de flujo laminar equipada con una bombilla de luz roja. Transferencia de un solo ratón a una jaula vacía (sin ropa de cama). Usando unas pinzas esterilizadas, transferir la pieza de pan contaminado a la parte inferior de la jaula vacía. Por lo general, el ratón coger el trozo de pan y consumir por completo dentro de 2-10 min. Si el ratón no come el pan de inmediato, volver a la jaula para acumular y dejar mouse en reposo durante 20-30 min. La mayoría de los animales se comen el pan dentro de este plazo, sin embargo, los ratones se pueden dejar sin tocar, sin acceso a otla comida o el agua durante un máximo de 2 horas.
- Después de la infección, devuelva el ratón a su jaula original y reponer la comida para ratones. Continuar para alojar a los ratones en los suelos de alambre elevado para la duración del experimento.
4. Controlar el nivel de bacterias en las heces
- Tubos de la etiqueta y pre-pesaje microcentrífuga para ser utilizados para la recogida de las heces.
- Trabajando rápidamente después de recuperar la jaula de los ratones, coloque cada ratón en un vaso de 500 ml de plástico. Normalmente los ratones expulsar 1-4 pastillas de heces dentro de los 5 min.
- Utilice unas pinzas estériles para transferir heces de tubos etiquetados adecuadamente.
- Pesar cada tubo y calcular el peso de las heces restando el peso del tubo de vacío. Pesos típicos de los pellets fecales van desde 10-30 mg.
- Añadir PBS a cada tubo (200 mg μl/30 heces) y usar un palillo de dientes estéril para triturar las partículas fecales.
- Vortex cada tubo durante 30 segundos, a continuación, preparar diluciones en serie y la placa de BHI / L+ G de agar. Contar el número de colonias y calcular UFC / mg heces.
5. Procesamiento de los tejidos intestinales infectadas
- La eutanasia a los ratones, asépticamente cosechar el estómago y los intestinos de cada ratón como un único tejido y recoger en vacío 100 mm placas de Petri.
- Separe el intestino delgado, el ciego y el colon y el lugar en platos separados 60 mm almacenados en hielo. El intestino delgado se pueden dividir aún más por la longitud en tres partes iguales se aproximan el duodeno, yeyuno, íleon y para facilitar la eliminación de los contenidos del lumen. Las terceras partes de tejido se pueden procesar ya sea juntos (por UFC por intestino delgado enteras) o por separado. Tejidos húmedos con ~ 0,5 ml de PBS estéril para mantener flexible y evitar las lágrimas durante la manipulación.
- Llene una jeringa de 10 ml con 8 ml de PBS estéril y adjuntar una aguja de calibre 25. El uso de fórceps estériles para exprimir los contenidos luminales en un vaso de precipitados de residuos (o un tubo de 50 ml estéril si la recogida de los bacterias luminales). Gripesh 4 ml de PBS a través de uno de los extremos del tejido, utilice las pinzas para exprimir el contenido, y luego darle la vuelta al tejido una y repetir en el otro extremo.
- Para cuantificar el número de Listeria en los contenidos luminales, centrifugar los rubores agrupados de 20 min a 12.000 xg, suspender el precipitado en 0,5 a 1,0 ml de agua estéril.
- Para cuantificar el número total de cantidad asociada a las células de Listeria, abrir cada tejido lavado cortando longitudinalmente con hoja de bisturí estéril, y luego hacer varios cortes laterales para cortar el tejido en fragmentos más pequeños Nota:. Este paso es esencial para asegurar que el tejido intestinal no se ajusta alrededor de la hoja homogeneizador. Transferir las piezas intestinales a un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 2 ml de agua estéril.
- Esterilizar un homogeneizador de tejidos (Fisher PowerGen 1000) mediante la colocación de la sonda en etanol al 70% a la potencia 60% durante 30 s. Esperar a que el etanol se seque al aire, o proceso en agua estéril durante 10 segundos. Homogeneizar cada tiN ú mero de 1 min. Repita el tratamiento con agua estéril entre cada muestra, y el uso de etanol al 70% entre los grupos de muestra.
- Preparar diluciones seriadas de cada muestra en agua estéril y placa en BHI / L + g de agar.
6. Procesamiento de infectados ganglios linfáticos mesentéricos
- Ganglios linfáticos Harvest asépticamente, colocar en una placa estéril de 60 mm en el hielo, y el uso de pinzas estériles para eliminar toda la grasa adjunta. Espera encontrar 3-6 nudos por ratón.
- Preparar pantallas de tela metálica cortando pedazos de 1.5-2 pulgadas cuadradas de acero inoxidable # 80 mesh. Hacer un pequeño corte en cada esquina, y abatir los cuatro lados, creando una cama elevada. Sumerja en el 95% de etanol y luego llama para esterilizar, y colocar en una placa de Petri de 60 mm que contiene 0,75 ml de agua estéril. Después de cada uso, las pantallas pueden ser reciclados por inmersión en etanol al 70% durante 20 min, lavado con un cepillo para eliminar los tejidos incrustados, ebullición durante 20-30 min en NaOH 2N, y luego lavado extensivamente con agua.
- Utilice el émbolode un ml jeringa estéril 3 a puré los nodos a través de la pantalla de malla. Asegúrese de empujar hacia abajo en la pantalla a la parte inferior del plato por lo que hace contacto con el agua en el plato.
- Pasar 0,75 ml de agua estéril a través de la pantalla y, a continuación pipetear arriba y abajo varias veces para aclarar la pantalla. Transferir la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga.
- Vortex cada muestra vigorosamente durante 30 segundos para lisar las células. Prepare diluciones en serie y la placa a cada + g de agar BHI / L.
7. Procesamiento de bazos infectados, hígados y vesículas biliares
- Agarre bazo con pinzas estériles y liberar haciendo dos cortes, uno en cada extremo. Colocar en un tubo de 15 ml que contiene 2,5 ml de agua estéril. (Nota: los tubos con fondos redondos pueden ser más fáciles de usar con el homogeneizador.)
- Busque la vesícula biliar (un pequeño saco lleno de líquido amarillo conectado al hígado) y recorte cuidadosamente con tijeras estériles se desprenda de hígado sin estallar. Transfer a un tubo de microcentrífuga que contiene 1 ml de agua estéril.
- Asépticamente quitar el hígado, y asegúrese de eliminar todos los lóbulos, y transferir a un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 2,5 ml de agua estéril.
- Homogeneizar bazos e hígados como se describió anteriormente durante 30 segundos en 60% de potencia. Vejigas Forgall, utilizan unas tijeras estériles para desgarrar en el tubo de microcentrífuga, y luego agitar vigorosamente durante 30 segundos.
- Prepare diluciones en serie y la placa cada muestra a cada BHI o BHI / L + g de agar.
8. Procesamiento de cerebros infectados
- Trabajando desde el lado posterior del ratón, cortar la piel y el tejido por encima del cuello, y a través de ambas orejas en un ángulo de 45 °. Utilice un fórceps estériles que se despeguen la solapa en forma de U de la piel tirando hacia la nariz y exponer el cráneo y los huesos faciales.
- Inmovilizar el cráneo por la celebración de la cresta ósea entre los ojos con unas pinzas, y utilizar tijeras para hacer cortes superficiales a través de los bordes laterales del cráneo. Sercuidado de cortar sólo el hueso y no del tejido cerebral. A continuación, cortar la cresta ósea entre los ojos. Use una pinza para sujetar la parte superior del cráneo y tire hacia atrás (hacia el cuello) para exponer el cerebro.
- Levante con cuidado el cerebro de su cavidad utilizando una pinza estéril y colocar en un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene 1,5 ml de agua estéril.
- Homogeneizar durante 20 seg en el poder 60% como se describió anteriormente. Prepare diluciones en serie y la placa a cada BHI o BHI / L + g de agar.
9. Procedimiento de consulta: Fraccionamiento de tejidos intestinales
9.1 Aislamiento de bacterias en la Fracción Moco
- Para cada tejido intestinal, preparar 3 tubos que contenían 3 ml de 6 mM de N-acetilcisteína (NAC, Sigma # A-9165).
- Coloque el enrojecida y longitudinalmente cortar el tejido en el primer tubo durante 1-2 minutos, girando vigorosamente cada 20-30 segundos. Usando una pinza estéril, coger el tejido y apretar suavemente contra el borde del tubo para eliminar el exceso de jabón lIdentificación.
- Repita el paso 9.1.2 dos veces más utilizando los tubos de NAC restantes. Retire el tejido intestinal y dejar de lado para su posterior procesamiento.
- Piscina la NAC se lava (total de 9 ml), y se centrifuga durante 20 min a 12.000 x g.
- Resuspender el precipitado en agua estéril y agitar durante 30 segundos, se preparan diluciones en serie y la placa de BHI / L + G.
9.2 Aislamiento de bacterias en el teléfono (CE) fracción epitelial
- Cortar cada tejido en trozos pequeños con tijeras estériles y colocar en un tubo de 50 ml que contiene 5 ml de medio RPMI (Invitrogen # 21870) suplementado con 5% de FBS (RP-5), EDTA 5 mM, y DTT 1 mM. Incubar con agitación a 37 ° C durante 20 min.
- Transferir las piezas intestinales a un tubo fresco que contenía 5 ml RP5/EDTA/DTT e incubar con agitación a 37 ° C durante 20 min. Guarde los medios de comunicación desde el primer tubo y dejar de lado a 37 ° C. Repita este proceso una vez más para un total de tres incubaciones de 20 min en RP5/EDTA/DTT. Si proceder a la lámina propia isopaso ción, transferir las piezas intestinal restantes en vacío tubo de 50 ml.
- Combinar las tres lavados RP5/EDTA/DTT (volumen total de 15 ml) y centrifugar a baja velocidad (1.200 x g) para sedimentar las células.
- Para cuantificar las bacterias extracelulares, recoger el sobrenadante y se centrifuga durante 20 min a 12.000 x g. Resuspender el precipitado en 0,5 a 1,0 ml de agua estéril y diluciones en serie de placas de BHI / L + g de agar.
- Para enumerar las bacterias intracelulares, resuspender el precipitado CE en 5 ml de RP-5, que contiene 25 mg / ml de gentamicina. Se incuba la suspensión de células individuales durante 30 min a 37 ° C más 7% de CO 2 para matar cualquier L. extracelular restante monocytogenes. Lavar las células dos veces en PBS, suspender en 0,5 ml de agua estéril, y agitar durante 30 segundos para lisar las células. Preparar diluciones seriadas en agua y plato en BHI / L + G.
Nota: Las células recogidas en esta etapa también contendrán las células de los parches de Peyer subyacente. Si se desea, la Peyer es visibleLos parches pueden ser retirados de los tejidos intestinales antes de su salida y cortar longitudinalmente.
9.3 Aislamiento de bacterias en la propia (LP) Fracción Lamina
- Enjuague el exceso de TDT / EDTA a partir de las piezas intestinales mediante la adición de 25 ml de PBS estéril al tubo. Agitar enérgicamente, transferir a un tubo nuevo y repetir dos veces.
- Transferir las piezas intestinales a un tubo de 50 ml que contenía 4 ml de solución de digestión que consiste en RP-5 suplementado con 1 mg / ml de colagenasa tipo IV y 40 mg / ml de DNAsa I. Se incuba con agitación a 37 ° C durante 40 min.
- Transferencia de las piezas no digeridas en un tubo fresco que contenía 4 ml de solución de digestión y repetir una o dos veces hasta que las piezas de tejido se digirieron completamente. Guardar cada una de las soluciones de digestión, que contienen células LP liberadas, a 37 ° C.
- Centrifugar las soluciones de digestión agrupados a baja velocidad (1.200 x g) para sedimentar las células. Procesar el sobrenadante y el sedimento de células por separado como el descrIBED arriba para enumerar las bacterias extracelulares e intracelulares, respectivamente.
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Representative Results
L. monocytogenes colonias serán visibles en BHI / L + G placas después de 36 a 48 h de incubación a 37 ° C. Las colonias tienen un aspecto liso, con forma de cúpula de color blanco cremoso (Figura 1A). El crecimiento se inhibe durante la mayoría de la microbiota intestinal, pero es común para ver algunas colonias que no son L. monocytogenes, particularmente cuando placas intestino delgado o el colon directamente sin dilución significativa (Figura 1B). Colonias sospechosas se pueden confirmar mediante chapado en CHROMagar TM placas Listeria. L. monocytogenes aparecen como colonias de color azul rodeadas por un halo blanco en estas placas (Figura 1C). El límite de detección para L. monocytogenes en cada tejido depende del volumen de agua utilizado para homogeneizar el tejido. Los volúmenes de muestra que se muestran en la Tabla 1 representan el volumen mínimo necesario para procesar con eficacia cada tejido. Homogeneizados de bazo, gtodos los de vejiga, cerebro, o tejido intestinal fraccionado se pueden almacenar a 4 ° C durante 1-2 días y re-sembraron si es necesario. Colon, el intestino delgado o el hígado homogeneizado pueden inhibir algunos L. monocytogenes menos que la muestra se diluye lo suficiente (Figura 1D), y estos homogeneizados no dió UFC cargos similares si resembrado después de almacenamiento a 4 ° C.
Anteriormente mostró que ratones BALB / c / Por / J ratones (BALB) fueron significativamente más susceptibles a la listeriosis transmitida por alimentos de ratones C57BL / 6 (B6) ratones 16. Un inóculo de 10 7 UFC es suficiente para establecer la infección intestinal en ratones BALB, pero al menos 10 8 UFC es necesario para colonizar el tracto gastrointestinal de los ratones B6 (Figura 2). Como se muestra en la Figura 2, la carga bacteriana en la vejiga intestinos, el bazo, el hígado y la vesícula biliar será proporcional a la dosis de exposición dada a los ratones. Estudios preliminares sugieren que 5 x 10 9 UFC esel LD de aproximadamente el 50 por BALB / c / A / J ratones utilizando este modelo 16.
Figura 1. Representante crecimiento de la colonia en placas de agar selectivas. A) L. monocytogenes colonias después de 48 horas de crecimiento en BHI / L + g de agar. B) BHI / L de agar + T inhibe el crecimiento de la mayoría de la microbiota intestinal, pero algunas colonias no-Listeria (flecha) se puede observar en diluciones bajas. La placa de agar se muestra aquí contiene 100 l de una dilución 10 -1 en la mitad de la placa, y de 50 l cada uno de los 10 -2 y 10 -3 diluciones de un homogeneizado de colon. C) L. monocytogenes colonias pueden ser confirmados por el crecimiento en placas de agar CHROM Listeria. L. monocytogenes aparecen de color azul con un halo blanco que rodea la colonia. D) No es raro que see una inhibición de L. monocytogenes, lo que resulta en colonias de diferentes tamaños, en la dilución más baja de cualquiera intestinal o el hígado homogeneizado en placas de BHI / L + g de agar.
Figura 2. Respuesta a la dosis de infección transmitida por alimentos en ratones BALB / c / Por / J y C57BL / 6 ratones. Ratones BALB / c / Por / J (ratones BALB) y C57BL / 6 (B6) Los ratones fueron infectados con 10 9 (n = 7), 10 8 (n = 8), 10 7 (n = 6) y 10 6 (n = 4) Lm InlA m y el número de UFC en cada tejido se determinó 5 dpi. Los valores medios + / - SD se muestran. Se analizaron los datos combinados de los dos experimentos diferentes. Las líneas discontinuas indican el límite de detección en cada órgano.
| Tejido | Volumen de la muestra (ml) una | Límite de detección (CFU) |
| Intestino delgado | 2.0 | 50 |
| Ciego | 2.0 | 50 |
| Colon | 2.0 | 50 |
| Los nodos linfáticos mesentéricos | 1.5 | 15 |
| Bazo | 2.5 | 50 |
| Hígado | 2.5 | 50 |
| La vesícula biliar | 0.5 | 10 |
| Cerebro | 1.5 | 15 |
Tabla 1. Límite de detección de L. monocytogenes en tejido homogeneizado. un volumen total de la muestra media que consiste en agua estéril, más el tejido homogeneizado.
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Discussion
Ratones consanguíneos no son uniformemente receptiva a la alimentación en todo momento del día, y su disposición a comer el pan contaminado dependerán tanto de la cepa de tipo y la edad de los ratones 17. En nuestra experiencia, 6-9 semanas de edad ratones B6 son receptivos a la alimentación en cualquier momento del día, pero los ratones BALB no comen constantemente la pieza de pan a menos que se ofrece durante su ciclo oscuro. El ciclo de luz de la habitación se utiliza para albergar a los animales puede alterarse por lo que la fase oscura coincide con la jornada ordinaria de trabajo para el personal de laboratorio. Sin embargo, los ratones deben tener por lo menos dos semanas para aclimatarse al ciclo de luz alterada antes de la infección. Durante la infección, sólo lámparas rojas deben utilizarse en o en la campana de flujo laminar o bien la habitación en sí.
En el desarrollo de este modelo, el pan fue elegido como la fuente de alimento para transmitir L. monocytogenes en gran medida porque el pan es absorbente. Por lo tanto, fue fácil para saturar trozos pequeños con the inóculo bacteriano y asegúrese de que cada ratón se ingiere la misma dosis. Sin embargo, este modelo podría ser fácilmente adaptado para utilizar otras fuentes de alimentos. En efecto, este es el único modelo de ratón que se puede utilizar para probar directamente el efecto de la composición de los alimentos o las condiciones de almacenamiento sobre la infectividad bacteriana. L. monocytogenes puede adaptarse fácilmente al crecimiento elevado de sal, pH bajo, o las temperaturas frías 1,2,18, pero no se sabe si estas condiciones de crecimiento alteran la capacidad de las bacterias para establecer la infección intestinal.
Se necesita aproximadamente 10 minutos para cosechar todos los órganos infectados de un solo ratón. La vesícula biliar es fácilmente roto, así que lo mejor es quitarlo primero. Los ganglios linfáticos mesentéricos son más fáciles de detectar cuando el intestino no se han alterado, por lo que deben ser retirados siguiente. Los intestinos se pueden cosechar como un único tejido cortando justo por debajo del estómago y justo por encima del apéndice, y luego separados en duodeno, yeyuno, ileum, el ciego y el colon justo antes de lavado y homogeneizar. El bazo y el hígado se eliminan normalmente al lado, y el cerebro se cosecha después de recuperar los órganos de la cavidad peritoneal, ya que es necesario girar el ratón para acceder al cráneo. Cuando se trabaja con varios ratones, todos los tejidos deben conservarse en hielo hasta su transformación. Para la mayoría de los tejidos, se utilizó una placa de agar para determinar el número total de UFC presentes en el tejido. La placa se divide en tres partes, y una l de muestra de tres diluciones separadas del homogeneizado de tejido 50-100 se sembró en cada tercio.
Los métodos descritos aquí serán identificar el número total de L. monocytogenes en cada tejido del ratón, no sólo los organismos intracelulares. El estilo de vida intracelular única de L. monocytogenes se piensa que es un determinante clave de la virulencia durante la infección 18,19. Sin embargo, L. monocytogenes son facultativos, no obligados, patógenos intracelulares, y allíe hay informes publicados definitivas para indicar el porcentaje de Listeria que actualmente residen dentro de las células in vivo. La mayoría de estudios anteriores utilizando L. orales infección monocytogenes se basó en el tratamiento de gentamicina de los tejidos intestinales para inhibir el crecimiento de la microbiota intestinal. Pre-tratamiento con gentamicina tiene el potencial de eliminar L. extracelular monocytogenes, permitiendo la recuperación de sólo las bacterias intracelulares, aunque no está claro en qué medida la gentamicina es capaz de penetrar en los tejidos intestinales enteros in vitro. El protocolo suplementario descrito aquí permite la determinación de ambas bacterias extracelulares e intracelulares en la capa de moco, el epitelio, y el compartimiento de lámina propia de los tejidos intestinales infectadas. En este procedimiento, la gentamicina se utiliza para el tratamiento de suspensiones de células individuales, asegurando que todas las bacterias fueron recuperadas dentro de las células dentro del tejido.
Tres lavados con NAC normalmente removido la mayor parte de la mucosidad de los tejidos intestinales, y los lavados combinados no contienen ningún células eucariotas (viables o muertos), como se determina por tinción con azul de tripano. Lavados adicionales no producen moco visible según lo determinado por Diff-Quik tinción de portaobjetos cytospin. La celularidad de la CE y fracciones PT también puede ser confirmado con Diff-Quik o tinción de Giemsa. La fracción CE debe consistir principalmente de células epiteliales, que fácilmente puede ser distinguido de los pocos linfocitos intraepiteliales presentes en el epitelio intestinal. La fracción de LP es más diverso, que contiene una mezcla de células mononucleares que cambia la composición después de la infección cuando los monocitos inflamatorias se infiltran en el tejido.
El modelo transmitidas por los alimentos de la listeriosis se puede utilizar con una amplia variedad de L. monocytogenes aislados, como el ratón adaptado InlA m-expresando cepa 15 se describe aquí, EGDe tipo salvaje y mutante de deleción derivados de estas cepas 16. En un estudio anterior, hemos demostrado que el nivel de colonización intestinal no varió significativamente entre estas cepas, sin embargo, los aislamientos que no expresan un ligando de alta afinidad para murino E-cadherina tenía un ligero defecto de difusión a los ganglios linfáticos mesentéricos y bazo 16. Del mismo modo, cualquier cepa de ratón puede ser utilizado para la infección, haciendo de este un sistema de modelo atractivo para estudiar tanto la patogénesis bacteriana y las respuestas a la infección del huésped. Por último, a pesar de que todavía no hemos probado esto directamente, se propone que los procedimientos básicos que se utilizan aquí deben ser ampliamente aplicable a los alimentos otros patógenos bacterianos soportados tales como Salmonella, Yersinia, Escherichia, Campylobacter y especies de Citrobacter.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia. Todos los experimentos descritos aquí se han realizado en cumplimiento de la Oficina de Bienestar de Animales de Laboratorio (OLAW) con la aprobación de la ICAUC en la Universidad de Kentucky.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de los Institutos Nacionales de Salud (AI079442 y AI091918) otorgados a SEFD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Agar | Difco | BD-241830 | |
| Lithium chloride | Sigma | L9650 | |
| Glycine | Omnipur | 4840 | |
| EDTA | Gibco | 15575-038 | |
| DTT | Sigma | D5545 | |
| Collagenase, type IV | Worthington | LS004089 | |
| DNAse I | Worthington | LS002007 | |
| Diff-Quik | Dade-Behring | B4132-1A | |
| PowerGen 1000 homogenizer | Fisher | 14-261-06 | |
| stainless steel type 304 mesh #80 | Small Parts, Inc. | CX-0080-C | |
| Cytospin | Statspin | M801-22 |
References
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