Summary
Detta dokument beskriver ett nytt förfarande för oral infektion av möss med användning
Abstract
L. monocytogenes är fakultativa intracellulära bakteriella patogener som orsakar livsmedelsburna infektioner hos människor. Mycket lite är känt om mag-fasen av listerios på grund av bristen på en liten djurmodell som nära efterliknar mänskliga sjukdomar. Detta dokument beskriver en ny musmodell för muntlig överföring av L. monocytogenes. Med hjälp av denna modell, möss matade L. monocytogenes-kontaminerat bröd har en diskret fas av gastrointestinal infektion, följt av olika grader av systemisk spridning i mottagliga (BALB / c / Av / J) eller resistenta (C57BL / 6) musstammar. Under de senare stadierna av infektionen, är spridningen till gallblåsan och hjärna observerats. Den foodborne modell av listerios är mycket reproducerbar, inte kräver speciella kunskaper, och kan användas med en mängd olika bakteriella isolat och laboratoriestammar mus. Som sådan är den idealiska modellen för att studera både virulens strategier som används av L. monocytogenes
Introduction
Listeria monocytogenes är fakultativa intracellulära bakteriella patogener som orsakar livsmedelsburna infektioner hos människor. Bakterierna är resistenta mot många av de processer som används för att skydda vår livsmedelsförsörjning, såsom torkning, saltning, eller kyl 1,2 och infektioner är oftast kopplade till bearbetade, "ready-to-eat" livsmedel som inte värms upp före konsumtion . I flera tidigare utbrott, källan till L. monocytogenes-förorenad mat identifierades, och begränsad grupp av exponerade individer övervakades noga 3-6. I dessa exempel, klinisk sjukdom hos annars friska individer varierade från en mild, självbegränsande gastroenterit till mer allvarliga intestinala och systemiska infektioner som krävde sjukhusvård. L. monocytogenes infektioner i nedsatt immunförsvar individer, både nyfödda och äldre, har förknippats med en hög dödlighet (25-30%), även med antibiotikabehandling
Den mest använda modellen för listerios är intravenös (iv) inokulering av möss. Den IV-modellen är mycket reproducerbar, och har varit mycket användbara för att studera både naiva och minne T-cellsvar under infektion 9,10. Nackdelen med iv-modellen är att det helt kringgår intestinal fasen av infektion. Efter livsmedelsburen smitta, ger tarmslemhinnan en barriär som förmodligen bromsar och begränsar antalet bakterier som ständigt kan sprida till perifera vävnader. Däremot kan hela ympen hittas i mjälten och levern inom minuter av intravenös administrering, och denna stora bolus av organismer kan överväldiga medfödda immunförsvaret defenses i dessa vävnader. Oral infektion hos möss genom sondmatning är mindre vanliga, eftersom stora doser (10 9 -10 11 CFU) typiskt krävs för att uppnå intestinal kolonisering 10. Dessutom genererar intragastriska (ig) ympning med en matningsnål inte en reproducerbar period av gastrointestinal infektion före systemisk spridning. Vissa laboratorier har rapporterat att L. monocytogenes når mjälte och lever inom 4-12 h efter infektion (HPI), medan andra inte visade någon systemisk spridning förrän 48 hpi 11-15. Detta lab-till-lab variation kan vara en konsekvens av den invasiva karaktär ig ympning, vilket kan resultera i mindre trauma på slemhinnan i matstrupen, och främja direkta blodomloppet invasion av bakterierna.
Vi har nyligen utvecklat en ny musmodell för oral L. monocytogenes infektion som nära efterliknar alla faser av mänskliga sjukdomar 16. Infektion uppstår när mössen äter bitar av fortsaminerad mat, en process som är icke-traumatisk, och inte kräver specialiserad kompetens genom laboratorie utredare. För en diskret tidsperiod (36-48 h), L. monocytogenes koloniserar reproducerbart endast mag-tarmkanalen, vilket möjliggör undersökning av de mekanismer som används av patogena Listeria att translokera över tarmslemhinnan och sprida till perifera vävnader. Viktigt kan modellen användas för att studera skillnader i värden medfödd motståndskraft mot infektioner. I en tidigare studie visade vi att BALB / c / Av / J-möss var mycket mottagliga för livsmedelsburen listerios, med exponentiell replikering av L. monocytogenes förekommer i tarmen, mjälte, lever och gallblåsa 16. Däremot var C57BL / 6 möss resistenta mot foodborne infektion, med endast övergående kolonisering av L. monocytogenes förekommer i var och en av dessa vävnader. En ytterligare egenskap hos foodborne modell som nära efterliknar människans sjukdom är att naturlig spridningtill hjärnan inträffade under de senare stadierna av infektionen (5-7 dpi).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Framställning av selektiva agarmedia (BHI / L + G) för att Inhibera Intestinal Microbiota
- Väg upp 26 g Brain Heart Infusion Agar (Difco), 7,5 g LiCl och 5,0 g glycin och placera det i en 1 liters kolv. Lägg 500 ml avjoniserat vatten.
- Värm på en magnetomrörare tills agar kokar under ständig omrörning. Ta kolven från värmen, låt bubblorna lösa kort, och sedan föra tillbaka till en koka igen.
- . Autoklav i 30 minuter vid 121 ° C under 16-19 psi på en flytande cykel Notera: lämna omröraren i kolven.
- Jämvikta medierna till 55 ° C i ett vattenbad eller låt svalna vid RT. Låt inte lösningen att få kallare än 55 ° C eller kristaller bildas i agar. Kristallerna hämmar inte L. monocytogenes tillväxt eller påverka de selektiva egenskaper medierna. Dock kommer kristallerna att vara liknande utseendemässigt till små kolonier och kommer att göra det svårt att räkna bakteriella CFU.
- Blanda försiktigtagar för 1 min med användning av en magnetomrörare. Undvik bildning av luftbubblor. Häll agar i petriskålar (~ 25 ml / platta).
Obs: Denna media inte stödja tillväxten av alla L. monocytogenes-stammar. Till exempel, L. monocytogenes EGDE växer väl på denna agar, med kolonier synliga inom 36-48 timmar, men 10403s inte växer på detta medium.
2. Beredning av Inokulum
- Skär skivor vitt bröd (Kroger) i små (2-3 mm) kuber med steril sax ora steril skalpell blad. Använd inte skorpor. Förvara enskilda bitar i mikrocentrifugrör vid -20 ° C tills dagen av infektionen.
- Med en steril skalpell, skär små (0,5-1 cm) bitar av saltat smör (Kroger) och placera varje i ett sterilt mikrocentrifugrör. Varje rör innehåller tillräckligt med smör för att framställa 50 - 60 bröd bitar. Förvara vid -20 ° C tills det behövs.
- Grow L. monocytogenes i BHI-buljong skakning vid 30 °, C tills kulturen når en OD 600 på ~ 0,8-1,0. Förbered 500 l alikvoter i mikrocentrifugrör, var noga med att skaka provet ofta så alla rör innehåller samma antal bakterier. Förvara vid -80 ° C.
- Att titrera bakteriella prover, tina ett rör på is, lägg sedan till 500 l till 9,5 ml BHI-buljong. Inkubera under 1,5 h stående vid 30 ° C. Plate serieutspädningar på BHI-agar. Räkna en titer av ~ 1-5 x 10 8 CFU / ml Anm. Om homogena alikvoter framställes, kan förvänta sig att alla av rören för att ge denna titer när de framställs på ett liknande sätt med en varians på 2 till 4-faldigt.
- Att infektera möss, förbereda en alikvot av L. monocytogenes såsom beskrivits i steg 2.4. Ca 20 min före L. monocytogenes kultur är klar, tina bröd bitar vid RT. Smält en alikvot av smör till 55 ° C och förvärma en liten volym PBS vid 55 ° C. Förbered tillräckligt bröd bitar så att det finns minst en per musvara infekterade och minst en extra bit för att bestämma titern av den faktiska inokulat.
- Baserat på den förutbestämda titern av den bakteriella alikvoten, beräkna den totala volymen av L. monocytogenes kultur som behövs för att förbereda ympning i önskat antal bröd bitar. Pelletera bakterierna genom centrifugering vid 14.000 xg under 10 min Aspirera all BHI-buljong och återsuspendera bakterierna i en liten volym av förvärmd PBS (2 ul / bröd bit).
- Vortex smält smör, lägg till bakterier (med en total volym motsvarande 3 l / bröd bit) och blanda väl Obs. Försök inte att förbereda mer än 10-15 bröd bitar på en gång eller smöret kommer att stelna.
- Att arbeta snabbt, pipett 5 | il av den bakteriella suspensionen på en enda bröd bit i ett mikrocentrifugrör. Lösningen ska absorberas helt av bröd bit.
- För att bestämma den faktiska titern för inokulum, tillsätt 1 ml steril PBS till en av brödet pieces. Vortex kraftigt i 1 min. Förbered spädningar och plåt både BHI och BHI / L + G agar.
- Alternativ procedur för hög titer (> 10 9 CFU) ympning. Om den bakteriella pelleten är för stor, kan det vara svårt att suspendera i en så liten volym, och det erhållna materialet är mycket viskös, som en pasta, och en del av inokulatet kan fastna på sidorna av mikrocentrifugrör. I detta fall är det bättre att inokulera brödet i en steril 60 mm odlingsskål, och erbjuda hela skålen (utan lock) till musen (se nedan). Eventuellt överskott av inokulum som inte absorberas av brödet kan sedan ätas direkt av musen. I allmänhet tar det längre tid för mössen att äta alla av brödet och slicka skålen ren än standard protokoll som beskrivs nedan, så detta är bara den bästa metoden när det handlar om mycket hög titer ympning.
Tre. Infektion av möss
- Köp BALB / c / Av / J (lager # 0.010.026) och C57BL/6/J (lager# 000.644) från The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) och använd vid 6-9 veckors ålder.
- Snabb mössen en dag (24 timmar) före infektion genom att ta bort maten och placera mössen på upphöjda (1 tum) tråd golv (# 3 mesh, Allentown) för att förhindra coprophagy. Lämna bara tillräckligt med strö i buren för att absorbera urin, men inte tillräckligt för att höja kasta avföring. Tillåt obegränsad tillgång till vatten.
- Infect mössen vid början av den mörka cykeln, som arbetar i ett dragskåp med laminärt flöde utrustad med en röd lampa. Överför en enda mus till en tom (inga sängkläder) bur. Använd en steril pincett, överföra den förorenade bröd bit till botten av den tomma buren. Typiskt kommer musen plocka upp brödet bit och konsumera det helt inom 2-10 min. Om musen inte äta bröd direkt, tillbaka buren till rack och lämna musen ostört i 20-30 min. Majoriteten av djuren äter brödet inom denna tidsram, dock kan mössen vara ifred, utan tillgång till othennes mat eller vatten i upp till 2 timmar.
- Efter infektion, tillbaka musen till sitt ursprungliga bur och fylla på musfoder. Fortsätt att hysa de möss på upphöjda tråd golv under hela experimentet.
4. Övervaka graden av bakterier Shed i avföring
- Label och pre-väga mikrocentrifug rören som skall användas för uppsamling av avföring.
- Arbeta snabbt efter att ha skaffat en bur av möss, placera varje mus i en 500 ml plastbägare. Typiskt mössen kommer utvisa 1-4 pall pellets inom 5 minuter.
- Använda en steril pincett för att överföra avföring till lämpligt märkta rör.
- Väg varje rör och beräkna vikten på avföringen genom att subtrahera vikten av det tomma röret. Typiska vikter för fekal pellets varierar från 10-30 mg.
- Lägg PBS till varje rör (200 μl/30 mg avföring) och använd en steril tandpetare för att mosa avföring pellets.
- Vortex varje rör i 30 sekunder, sedan förbereda seriespädningarna och platta på BHI / L+ G agar. Räkna antalet kolonier och beräkna CFU / mg avföring.
Fem. Behandling av infekterade tarmvävnader
- Euthanize mössen, aseptiskt skörda magen och tarmarna från varje mus som en enda vävnad och samla i tomma 100 mm petriskålar.
- Separera de små tarmarna, blindtarmen och kolon och plats i separata 60 mm rätter som lagras på is. De små tarmarna kan vidare delas med längden i tre lika stora bitar approximera duodenum, jejunum och ileum att underlätta avlägsnandet av de luminala innehållet. Vävnaden tredjedelar kan sedan bearbetas antingen tillsammans (CFU per hela tunntarmen) eller separat. Våtservetter med ~ 0,5 ml steril PBS att hålla smidig och förhindra tårar under hanteringen.
- Fyll en 10 ml spruta med 8 ml sterilt PBS och bifoga en 25 g nål. Använd steril tång för att pressa ut de luminala innehållet i en avfallsbägare (eller en steril 50 ml tub om att samla de luminala bakterier). Influensorh 4 ml PBS genom ena änden av vävnaden, använd pincett för att pressa ut innehållet, och sedan vända vävnad och upprepa på den andra änden.
- För att kvantifiera antalet Listeria i luminala innehåll, centrifugera poolade spolar för 20 min vid 12.000 xg, suspendera pelleten inom 0,5 - 1,0 ml sterilt vatten.
- För att kvantifiera det totala antalet cellassocierat belopp Listeria, öppnar varje tvättad vävnad genom att skära längs med steril skalpell blad, och sedan göra flera laterala snitt att skiva vävnaden i mindre fragment Anmärkning:. Detta steg är viktigt att säkerställa att tarmvävnaden betyder inte runt homogenisatorn bladet. Överför de intestinala bitar till ett 15 ml centrifugrör innehållande 2 ml sterilt vatten.
- Sterilisera en vävnadshomogenisator (Fisher PowerGen 1000) genom att placera sonden i 70% etanol vid 60% effekt under 30 sek. Vänta på etanol för att lufttorka, eller process i sterilt vatten i 10 sek. Homogenisera varje tissue i 1 min. Upprepa behandlingen med sterilt vatten mellan varje prov, och använda 70% etanol mellan urvalsgrupper.
- Bered seriespädningar av varje prov i sterilt vatten och platta på BHI / L + G agar.
6. Behandling av infekterade kröslymfknuta
- Harvest lymfkörtlar aseptiskt placera i en steril 60 mm skålen på is, och använder steril pincett för att ta bort alla bifogade fett. Räkna med att hitta 3-6 noder per mus.
- Förbered skärmar trådnät genom att skära 1,5-2 tums fyrkantiga bitar av rostfritt stål # 80 mesh. Gör ett litet snitt i varje hörn, och fäll ner de fyra sidorna, vilket skapar en upphöjd bädd. Doppa i 95% etanol och därefter lågan att sterilisera, och plats i en 60 mm petriskål innehållande 0,75 ml sterilt vatten. Efter varje användning kan skärmarna återvinnas genom blötläggning i 70% etanol under 20 min, skrubbning med en borste för att avlägsna inbäddade vävnader, kokning under 20-30 min i 2 N NaOH, och sedan spola extensivt med vatten.
- Använd kolvenfrån en steril 3 ml spruta till mäsk noderna genom mesh. Var noga med att trycka nedåt på skärmen till botten av skålen så att den får kontakt med vattnet i skålen.
- Pass 0,75 ml sterilt vatten genom skärmen och sedan pipettera upp och ned flera gånger för att skölja skärmen. Överför cellsuspensionen till ett mikrocentrifugrör.
- Vortex varje prov kraftigt i 30 sek för att lysera cellerna. Förbered spädningar och plåt på antingen BHI / L + G agar.
7. Behandling av infekterade mjälte, lever, och blåsor Gall
- Fatta mjälte med steril pincett och befria genom att göra två snitt, en i varje ände. Placera i ett 15 ml rör innehållande 2,5 ml sterilt vatten. (OBS: rör med runda bottnar kan vara lättare att använda med homogenisatom.)
- Leta gallblåsan (en liten gul vätskefylld säck ansluten till levern) och klipp försiktigt med steril sax att lösgöra från levern utan att brista. Transfer till ett mikrocentrifugrör innehållande 1 ml sterilt vatten.
- Aseptiskt bort levern, var noga med att ta bort alla lober, och överför till en 15 ml centrifugrör innehållande 2,5 ml sterilt vatten.
- Homogenisera mjältar och levrar som beskrivits ovan för 30 sek på 60% effekt. Forgall blåsor, använd steril sax för att slita sönder i mikrocentrifugrör, och sedan skaka kraftigt i 30 sekunder.
- Förbered spädningar och plåt varje prov på antingen BHI eller BHI / L + G agar.
8. Behandling av infekterade hjärnor
- Arbeta från baksidan av musen, skära in i huden och vävnaden ovanför halsen, och över båda öronen i 45 ° vinkel. Använda en steril pincett för att dra av den U-formade flik av hud genom att dra mot näsan och exponera skallen och ansiktet ben.
- Immobilisera skallen genom att hålla den beniga åsen mellan ögonen med en pincett och sax för att göra grunt nedskärningar över sidokanterna i skallen. Benoga med att skära endast benet och inte hjärnvävnaden. Därefter skär den beniga åsen mellan ögonen. Använd en pincett för att hålla toppen av skallen och dra bakåt (mot halsen) att exponera hjärnan.
- Lyft försiktigt hjärnan från dess hålighet med en steril pincett och placera i en 15 ml centrifugrör innehållande 1,5 ml sterilt vatten.
- Homogenisera under 20 s på 60% effekt såsom beskrivits ovan. Förbered spädningar och plåt på antingen BHI eller BHI / L + G agar.
9. Kompletterande Tillvägagångssätt: Fraktionering av tarmvävnader
9.1 Isolering av bakterier i Slem Fraktion
- För varje tarmvävnad, förbereda tre rör innehållande 3 ml 6 mM N-acetylcystein (NAC, Sigma # A-9165).
- Placera det spolade och längdled skära vävnad i det första röret i 1-2 minuter, kraftigt virvlande var 20-30 sek. Använda steril pincett, plocka upp vävnaden och kläm försiktigt mot sidan av röret för att avlägsna överskott liquid.
- Upprepa steg 9.1.2 två gånger med de återstående NAC rören. Avlägsna tarmvävnaden och ställ åt sidan för vidare behandling.
- Pool NAC tvättar (totalt 9 ml), och centrifugera i 20 minuter vid 12.000 x g..
- Suspendera pelleten i sterilt vatten, skaka i 30 sekunder, förbereda seriespädningarna och platta på BHI / L + G.
9.2 Isolering av bakterier i epitelceller (EG) Fraktion
- Skär varje vävnad i små bitar med steril sax och lägg i en 50 ml rör innehållande 5 ml RPMI (Invitrogen # 21870) kompletterat med 5% FBS (RP-5), 5 mM EDTA och 1 mM DTT. Inkubera under skakning vid 37 ° C i 20 minuter.
- Överför de intestinala bitar till ett nytt rör innehållande 5 ml RP5/EDTA/DTT och inkubera under skakning vid 37 ° C i 20 minuter. Spara media från det första röret och ställ åt sidan vid 37 ° C. Upprepa denna process en gång till totalt tre 20 min inkubationer i RP5/EDTA/DTT. Om man går vidare till lamina propria isoning steg, överföra de återstående intestinala bitar i tom 50 ml tub.
- Kombinera de tre RP5/EDTA/DTT tvättar (total volym av 15 ml) och centrifugera vid låg hastighet (1200 x g) för att pelletera cellerna.
- För att kvantifiera extracellulära bakterier, samla in supernatanten och centrifugera i 20 min vid 12000 x g. Suspendera pelleten inom 0,5 - 1,0 ml sterilt vatten och platta serieutspädningar på BHI / L + G agar.
- Att räkna intracellulära bakterier, resuspendera EG pelleten i 5 ml av RP-5 innehållande 25 fig / ml gentamicin. Inkubera den enda cellsuspension under 30 minuter vid 37 ° C plus 7% CO2 för att döda eventuellt kvarvarande extracellulära L. monocytogenes. Tvätta cellerna två gånger i PBS, suspendera i 0,5 ml sterilt vatten och virvelblandades under 30 sek för att lysera cellerna. Förbered spädningar i vatten och platta på BHI / L + G.
Obs: Cellerna som samlats i detta skede kommer också att innehålla celler från den underliggande Peyers plack. Om så önskas är det synliga PeyerPlåster kan avlägsnas från de intestinala vävnader före spolning och skärning i längdriktningen.
9.3 Isolering av bakterier i lamina propria (LP) Fraktion
- Skölj överskott DTT / EDTA från de intestinala bitar genom att tillsätta 25 ml steril PBS till röret. Skaka kraftigt, överföra till ett nytt rör och upprepa två gånger.
- Överför de intestinala bitar till ett 50 ml rör innehållande 4 ml av matsmältningen lösning bestående av RP-5 kompletterat med 1 mg / ml kollagenas av typ IV och 40 ^ g / ml DNAse I. Inkubera under skakning vid 37 ° C under 40 min.
- Överför osmälta bitar i ett nytt rör innehållande 4 ml av matsmältningen och upprepa en eller två gånger tills vävnaden bitarna är helt smält. Spara varje av digestionsmetoderna lösningar, som innehåller befriade LP celler, vid 37 ° C.
- Centrifugera poolade matsmältningen lösningarna vid låg hastighet (1200 xg) till pellets cellerna. Bearbeta supernatanten och cellpelletten separat som described ovan för att räkna upp extracellulära och intracellulära bakterier, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L. monocytogenes kolonier kommer att synas på BHI / L + G plattorna efter 36-48 timmars inkubation vid 37 ° C. Kolonierna har en jämn, kupolformad krämigt vitt utseende (Figur 1A). Tillväxten kommer att hämmas för majoriteten av tarmens mikroorganismer, men det är vanligt att se några kolonier som inte är L. monocytogenes, i synnerhet när plätering tunntarmen eller tjocktarmen direkt utan betydande utspädning (Figur 1B). Misstänkta kolonier kan bekräftas genom plätering på CHROMagar TM Listeria plattor. L. monocytogenes visas som blå kolonier omgivna av en vit gloria på dessa plattor (Figur 1C). Detektionsgränsen för L. monocytogenes i varje vävnad är beroende av den mängd vatten som används för att homogenisera vävnaden. De prowolymer som visas i tabell 1 representerar den minimala volym som krävs för att effektivt bearbeta varje vävnad. Homogenat av mjälte, galla urinblåsan, hjärnan, eller fraktionerad tarmvävnad kan lagras vid 4 ° C under 1-2 dagar och re-pläterades vid behov. Tjocktarmen eller homogenat levern kan hämma vissa L. monocytogenes tillväxt såvida provet späds tillräckligt (figur 1D), och dessa homogenaten inte ger liknande CFU räknas om re-klädd efter lagring vid 4 ° C.
Vi visade tidigare att BALB / c / Av / J (BALB) möss var betydligt mer mottaglig för livsmedelsburen listerios än C57BL / 6 (B6) möss 16. En ymp av 10 7 CFU är tillräcklig för att fastställa tarminfektion i BALB möss, men minst 10 8 CFU behövs för att kolonisera mag-tarmkanalen av B6-möss (Figur 2). Såsom visas i figur 2, kommer den bakteriella belastningen i tarmarna, mjälte, lever och gallblåsa vara proportionell mot den utmaningen dos som ges till mössen. Preliminära studier tyder på att 5 x 10 9 CFU ärden ungefärliga LD 50 för BALB / c / Av / J-möss med hjälp av denna modell 16.
Figur 1. Representant koloni tillväxt på selektiva agarplattor. A) L. monocytogenes kolonier efter 48 h tillväxt på BHI / L + G agar. B) BHI / L + G agar hämmar tillväxten av mest intestinal mikrobiota, men vissa icke-Listeria kolonier (pil) kan observeras vid låga utspädningar. Agarplattan visas här innehåller 100 ul av en 10 -1 spädning på halva tallriken, och 50 il vardera av de 10 -2 och 10 -3 utspädningar av ett kolon homogenat. C) L. monocytogenes kolonier kan bekräftas genom tillväxt på krom agar Listeria plattor. L. monocytogenes är blå med en vit gloria som omger kolonin. D) Det är inte ovanligt att see en hämning av L. monocytogenes tillväxt, vilket resulterar i kolonier av olika storlekar, i den lägsta utspädning av antingen tarm eller homogenat lever plattor på BHI / L + G agar.
Figur 2. Dosrespons av livsmedelsburen infektion hos BALB / c-/ Av / J och C57BL / 6 möss. BALB / c / Av / J (BALB) och C57BL / 6 (B6)-möss infekterades med 10 9 (n = 7), 10 8 (n = 8), 10 7 (n = 6) och 10 6 (n = 4) Lm inl m och antalet CFU i varje vävnad bestämdes 5 dpi. Medelvärden + / - SD visas. Sammanslagna data från två olika experiment analyserades. Streckade linjer anger detektionsgränsen i varje organ.
| Vävnad | Provvolym (ml) sattes en | Detektionsgränsen (CFU) |
| Tunntarmen | 2,0 | 50 |
| Blindtarmen | 2,0 | 50 |
| Colon | 2,0 | 50 |
| Kröslymfknuta | 1,5 | 15 |
| Mjälte | 2,5 | 50 |
| Lever | 2,5 | 50 |
| Gallblåsa | 0,5 | 10 |
| Hjärna | 1,5 | 15 |
Tabell 1. Detektionsgränsen för L. monocytogenes i vävnadshomogenat. en genomsnittlig total provvolym bestående av sterilt vatten plus den homogeniserade vävnaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inavlade möss är inte lika mottagliga för utfodring vid alla tider på dagen, och deras vilja att äta förorenad brödet beror både på stammen typ och ålder mössen 17. I vår erfarenhet, 6-9 veckor gamla B6-möss är mottagliga för utfodring när som helst på dagen, men BALB möss kommer inte konsekvent äta bröd bit om det inte erbjuds under deras mörker. Ljuset cykel av rummet används för att hysa djuren kan ändras så den mörka fasen sammanfaller med den normala arbetsdagen för laboratoriepersonal. Dock bör mössen ges minst två veckor för att acklimatisera sig till den förändrade ljuset cykeln före infektion. Under infektion bör endast röda lampor användas antingen i själva rummet eller i dragskåp med laminärt flöde.
Vid utvecklingen av denna modell, var brödet valdes som näringskälla att sända L. monocytogenes stor del eftersom brödet är absorberande. Således var det lätt att mätta små bitar med the bakteriell ymp och se till att varje mus intas samma dos. Detta kan dock modell lätt anpassas att använda andra livsmedel källor. Detta är faktiskt den enda musmodell som kan användas för att direkt testa effekten av livsmedlens sammansättning eller lagringsförhållanden på bakteriell smittsamhet. L. monocytogenes kan enkelt anpassas till tillväxt i hög salt, lågt pH, eller kalla temperaturer 1,2,18, men det är inte känt om dessa tillväxtbetingelser förändrar bakteriernas förmåga att etablera tarminfektion.
Ca 10 min behövs för att skörda alla de infekterade organ från en enda mus. Gallblåsan är lätt spruckit, så det är bäst att ta bort det först. Mesenteriala lymfkörtlar är lättast att upptäcka när tarmen inte har störts, så de bör tas bort nästa. Tarmen kan skördas som en enda vävnad genom att klippa precis under magen och strax ovanför bilagan, och sedan separeras i duodenum, jejunum, ileum, blindtarmen och tjocktarmen innan bara spolning och homogenisering. Mjälten och levern avlägsnas typiskt nästa, och hjärnan skördas efter att hämta organ från bukhålan, eftersom det är nödvändigt att vända musen över för att komma till skallen. När du arbetar med flera möss, bör alla vävnader lagras på is tills bearbetas. För de flesta vävnader, var en agarplatta användes för att bestämma det totala antalet CFU närvarande i vävnaden. Plattan var uppdelad i tredjedelar, och en 50-100 il prov av tre separata utspädningar av vävnadshomogenatet ströks ut på varje tredjedel.
De metoder som beskrivs här kommer att identifiera det totala antalet L. monocytogenes i varje mus vävnad, inte bara de intracellulära organismer. Den unika intracellulära livsstil L. monocytogenes är tänkt att vara en viktig virulensdeterminant under infektion 18,19. Emellertid L. monocytogenes är frivilliga, inte obligata, intracellulära patogener, och there finns inga definitiva publicerade rapporter att ange hur stor procentandel av Listeria som faktiskt bor inom celler in vivo. De flesta tidigare studier med oralt L. monocytogenes infektion åberopas gentamicin behandling av tarmen vävnader för att hämma tillväxten av tarmens mikroorganismer. Förbehandling med gentamicin har potential att eliminera extracellulära L. monocytogenes, vilket återvinning av enbart de intracellulära bakterier, men det är oklart i vilken utsträckning gentamicin kan tränga hela tarmvävnader in vitro. Den kompletterande Protokollet som beskrivs här möjliggör bestämning av både extracellulära och intracellulära bakterier i slem skiktet, epitelet, och lamina propria fack av infekterade tarmvävnader. I detta förfarande är gentamicin används för att behandla enkelcellsuspensioner, se till att alla återvunna bakterier var inne cellerna i vävnaden.
Tre tvättar med NAC re typisktflyttade majoriteten av slem från tarmen vävnader, och de sammanslagna tvättarna innehöll inga eukaryota celler (viabla eller döda), som bestäms av trypanblå färgning. Ytterligare tvättar gav inte synligt slem som bestäms med Diff-Quik färgning av cytospin slide preparat. Cellulariteten av EG-och LP-fraktioner kan också bekräftas med Diff-Quik eller Giemsa färgning. EG-fraktionen bör bestå av främst epitelceller, som lätt kan skiljas från de få intraepiteliala lymfocyter närvarande i tarmepitelet. LP fraktionen är mer varierande, innehåller en blandning av mononukleära celler som ändrar sammansättning efter infektion när inflammatoriska monocyter infiltrera vävnaden.
Den foodborne modell av listerios kan användas med ett brett utbud av L. monocytogenes isolat, inklusive mus-anpassad INLA m-uttryckande stammen 15 beskrivs här, vildtyp EGDE och deletionsmutanten derieningar av dessa stammar 16. I en tidigare studie visade vi att nivån av intestinal kolonisering inte varierar kraftigt bland dessa stammar, gjorde dock isolat som inte uttrycker en hög affinitet ligand för murina E-cadherin har ett mindre fel i spridningen till de kröslymfknuta samt mjälte 16. På samma sätt kan varje musstam användas för infektion, vilket gör detta till ett attraktivt modellsystem för att studera både bakterie-patogenes och värd svar på infektion. Slutligen, även om vi ännu inte har testat detta direkt, föreslår vi att de grundläggande förfaranden som används här bör vara allmänt tillämpliga på andra livsmedelsburna bakteriella patogener som salmonella, Yersinia, Escherichia, Campylobacter och Citrobacter arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen. Alla experiment som beskrivs här utfördes i enlighet med kontoret för Laboratory Animal Welfare (OLAW) med godkännande av ICAUC vid University of Kentucky.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health (AI079442 och AI091918) tilldelas SEFD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Agar | Difco | BD-241830 | |
| Lithium chloride | Sigma | L9650 | |
| Glycine | Omnipur | 4840 | |
| EDTA | Gibco | 15575-038 | |
| DTT | Sigma | D5545 | |
| Collagenase, type IV | Worthington | LS004089 | |
| DNAse I | Worthington | LS002007 | |
| Diff-Quik | Dade-Behring | B4132-1A | |
| PowerGen 1000 homogenizer | Fisher | 14-261-06 | |
| stainless steel type 304 mesh #80 | Small Parts, Inc. | CX-0080-C | |
| Cytospin | Statspin | M801-22 |
References
- Becker, L. A., Evans, S. N., Hutkins, R. W., Benson, A. K. Role of sigmaB in adaptation of Listeria monocytogenes to growth at low temperature. Journal of Bacteriology. 182, 7083-7087 (2000).
- Neunlist, M. R., et al. Effect of salting and cold-smoking on the culturability, viability, and virulence of Listeria monocytogenes strain Scott A. Journal of Food Protection. 68, 85-91 (2005).
- Aureli, P., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes. N. Engl. J. Med. 342, 1236-1241 (2000).
- Dalton, C. B., et al. An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk. N. Engl. J. Med. 336, 100-105 (1997).
- Frye, D. M., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with delicatessen meat contaminated with Listeria monocytogenes. Clin. Infect. Dis. 35, 943-949 (2002).
- Salamina, G., et al. A foodborne outbreak of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes. Epidemiol. Infect. 117, 429-436 (1996).
- Mead, P. S., et al. Food-related illness and death in the United States. Emerging Infectious Diseases. 5, 607-625 (1999).
- Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: Clinical and experimental update. The Journal of Infectious Disease. 185, S18-S24 (2002).
- Condotta, S. A., Richer, M. J., Badovinac, V. P., Harty, J. T. Probing CD8 T cell responses with Listeria monocytogenes infection. Advances in Immunology. 113, 51-80 (2012).
- Disson, O., et al. Modeling human listeriosis in natural and genetically engineered animals. Nat Protoc. 4, 799-810 (2009).
- Czuprynski, C. J., Faith, N. G., Steinberg, H. A/J mice are susceptible and C57BL/6 mice are resistant to Listeria monocytogenes infection by intragastric inoculation. Infect. Immun. 71, 682-689 (2003).
- Gajendran, N., et al. Regional IFNgamma expression is insufficient for efficacious control of food-borne bacterial pathogens at the gut epithelial barrier. Int. Immunol. 19, 1075-1081 (2007).
- Lecuit, M., et al. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infect. Immun. 66, 747-755 (1998).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
- Ghanem, B. ou, N, E., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathogens. , Submitted for publication (2012).
- Kowal, M., Buda-Lewandowska, D., Plytycz, B., Styrna, J. Day/night food consumption in mice is strain and age-dependent. Folia Biol. (Krakow). 50, 1-3 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature reviews. Microbiology. 7, 623-628 (2009).
- Camejo, A., et al. The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle. Virulence. 2, 379-394 (2011).
