Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Oral transmission af Published: May 6, 2013 doi: 10.3791/50381
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

Summary

Dette dokument beskriver en hidtil ukendt fremgangsmåde til oral infektion af mus under anvendelse

Abstract

L. monocytogenes er fakultative intracellulære bakterielle patogener, der forårsager fødevarebårne infektioner hos mennesker. Meget lidt er kendt om den gastrointestinale fase af listeriose grundet manglen på en lille dyremodel, der nøje efterligner human sygdom. Dette papir beskriver en ny musemodel til oral transmission af L. monocytogenes. Med denne model mus fodret L. monocytogenes-forurenet brød har en diskret fase af gastrointestinal infektion, efterfulgt af varierende grader af systemisk spredning i modtagelige (BALB / c / Af / J) eller resistente (C57BL / 6) musestammer. I de senere stadier af infektionen, er spredning til galdeblære og hjerne overholdes. Den fødevarebårne model for listeriose er meget reproducerbar, kræver ikke særlige færdigheder, og kan bruges med en bred vifte af bakterielle isolater og laboratorie musestammer. Som sådan er det den ideelle model til at studere både virulens strategier anvendes af L. monocytogenes

Introduction

Listeria monocytogenes er fakultative intracellulære bakterielle patogener, der forårsager fødevarebårne infektioner hos mennesker. Bakterierne er resistente over for mange af de processer, der anvendes for at beskytte vores fødevareforsyning, såsom tørring, saltning, eller køling 1,2 og infektioner er typisk knyttet til forarbejdede, "ready-to-eat" fødevarer, der ikke opvarmes før forbrug . I flere tidligere udbrud, kilde L. monocytogenes-forurenede fødevarer blev identificeret, og den begrænsede gruppe af udsatte personer blev overvåget nøje 3-6. I de eksempler, varieret klinisk sygdom hos ellers raske personer fra en mild, selvbegrænsende gastroenteritis til mere alvorlige tarm-og systemiske infektioner, som krævede hospitalsindlæggelse. L. monocytogenes infektioner hos immunkompromitterede individer, herunder både nyfødte og ældre, har været forbundet med en høj dødelighed (25-30%), selv med antibiotisk behandling L. monocytogenes, eller værten faktorer, der styrer modtagelighed for infektion efter oral transmission, primært som følge af manglen på en lille dyremodel, der rekapitulerer denne brede vifte af infektion resultater.

Den mest udbredte model af listeriose er intravenøs (iv) podning af mus. Den iv modellen er meget reproducerbar, og har været særdeles nyttige til at studere både naive og hukommelse T-celle responser under infektion 9,10. Ulempen ved iv modellen er, at det er helt omgår den intestinale fase af infektion. Efter fødevarebårne overførsel giver tarmslimhinden en barriere, der formentlig bremser og begrænser antallet af bakterier, der kan løbende formidle til perifere væv. I modsætning hertil kan hele inokulum findes i milt og lever i løbet af minutter iv administration, og denne store bolus af organismer kan overvælde medfødte immunsystem defenses i disse væv. Oral infektion i mus ved tvangsfodring er mindre almindeligt anvendt, fordi store doser (10 9 -10 11 CFU) typisk kræves for at opnå intestinal kolonisering 10.. Også, intragastrisk (IG) podning med en fodring nål ikke generere en reproducerbar periode for gastrointestinal infektion forud for systemisk spredning. Nogle laboratorier har rapporteret, at L. monocytogenes nå milt og lever inden 4-12 timer efter infektion (HPI), mens andre viste ingen systemisk spredning indtil 48 HPI 11-15. Dette laboratorium-til-lab variation kan være en konsekvens af den invasive natur ig inokulering, hvilket kan resultere i mindre trauma på foring af spiserøret, og fremme direkte blodbanen invasion af bakterier.

Vi har for nylig udviklet en ny musemodel af oral L. monocytogenes infektion, der nøje efterligner alle faser af human sygdom 16.. Infektion opstår, når musene indtage stykker af contaminerede mad, en proces, der er ikke-traumatisk, og kræver ikke særlige færdigheder ved laboratorie efterforskere. For en diskret tidsperiode (36-48 timer), L. monocytogenes reproducerbart kolonisere kun mavetarmkanalen, således tillader undersøgelse af de mekanismer, der anvendes af patogene Listeria at translokere over tarmslimhinden og udbrede det perifere væv. Vigtigt er det, kan modellen bruges til at studere forskelle i host medfødte modstandskraft over for infektioner. I en tidligere undersøgelse viste vi, at BALB / c / Af / J mus var meget modtagelige for fødevarebårne listeriose med eksponentiel replikation af L. monocytogenes forekommer i tarmen, milt, lever og galdeblære 16. I modsætning hertil var C57BL / 6 mus resistente over for fødevarer smitte med kun forbigående kolonisering af L. monocytogenes forekommer i hver af disse væv. Et yderligere træk af fødevarebårne model, der nøje efterligner human sygdom er, at naturlige udbredelsetil hjernen skete under de senere stadier af infektionen (5-7 dpi).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Udarbejdelse af Selektive Agar Media (BHI / L + G) for at hæmme Intestinal mikrobiota

  1. Afvejes 26 g Brain Heart Infusion Agar (Difco), 7,5 g LiCl og 5,0 g glycin og sted i en 1 liter kolbe. Tilsæt 500 ml deioniseret vand.
  2. Heat på en magnetomrører, indtil agar koger under stadig omrøring. Tag kolben af ​​varmen, lad boblerne bosætte kort, og derefter bringe tilbage til en byld igen.
  3. . Autoklave i 30 min ved 121 ° C under 16-19 psi på en flydende cyklus Bemærk: Lad omrørerstang i kolben.
  4. Ækvilibrer mediet til 55 ° C i et vandbad eller lad afkøle ved stuetemperatur. Lad ikke den løsning for at få køligere end 55 ° C eller krystaller vil danne i agaren. Krystallerne ikke hæmmer L. monocytogenes vækst eller påvirke de selektive egenskaber af medierne. Dog vil krystallerne være ens i udseende til små kolonier, og vil gøre det vanskeligt at tælle bakteriel CFU.
  5. Bland forsigtigtagar i 1 min under anvendelse af en magnetisk omrører. Undgå dannelse af luftbobler. Hæld agar i petriskåle (~ 25 ml / plade).
    Note: Dette medie understøtter ikke væksten af alle L. monocytogenes-stammer. For eksempel L. monocytogenes egde vokser godt på denne agar, med kolonier synlige inden 36-48 timer, men 10403s vokser ikke på dette medie.

2.. Fremstilling af inokulum

  1. Skære skiver hvidt brød (Kroger) i små (2-3 mm) cubes anvendelse af sterilt saks ora steril skalpel. Brug ikke skorper. Opbevarer de enkelte stykker i mikrocentrifugerør ved -20 ° C indtil dagen for infektion.
  2. Ved hjælp af en steril skalpel skære små (0,5-1 cm) bidder af saltet smør (Kroger), og placer hver i et sterilt mikrocentrifugerør. Hvert rør vil indeholde nok smør til at forberede 50 - 60 brød stykker. Opbevar ved -20 ° C indtil brug.
  3. Grow L. monocytogenes i BHI bouillon rystning ved 30 &deg, C, indtil kulturen når en OD600 på ~ 0,8-1,0. Forbered 500 pi alikvoter i mikrocentrifugerør, idet man vortex prøven ofte så alle rørene indeholder det samme antal af bakterier. Opbevares ved -80 ° C.
  4. At titrere de bakterielle portioner, tø et rør på is, tilsæt derefter 500 pi til 9,5 ml BHI bouillon. Inkuber i 1,5 timer stående ved 30 ° C. Plate seriefortyndinger på BHI agar. Forvente en titer på ~ 1-5 x 10 8 CFU / ml Bemærk:. Hvis homogene portioner fremstilles, kan forvente hver af rørene til opnåelse denne titer når fremstillet på en lignende måde med en varians på 2 til 4 gange.
  5. At inficere mus, forberede en portion af L. monocytogenes som beskrevet i trin 2.4. Omkring 20 min før L. monocytogenes kultur er klar, tø brødet stykker på RT. Smelt en portion af smør ved 55 ° C og præ-varm en lille volumen PBS ved 55 ° C. Forbered nok brød stykker, således at der er mindst én pr musat blive inficeret, og mindst ét ​​ekstra stykke til bestemmelse af titeren af ​​den faktiske inokulum.
  6. Baseret på den forudbestemte titer bakterielle portion, det samlede volumen af L. beregne monocytogenes kultur er nødvendig for at forberede podestoffer til det krævede antal brød stykker. Pellet bakterierne ved centrifugering ved 14.000 xg i 10 min Aspirér al BHI bouillon og resuspender bakterierne i et lille volumen forvarmet PBS (2 gl / brød stykke).
  7. Vortex det smeltede smør, tilføje til bakterier (ved hjælp af en samlet mængde svarende til 3 gl / brød brik), og bland grundigt Note:. Forsøg ikke at udarbejde mere end 10-15 brød stykker på én gang eller smørret vil størkne.
  8. Arbejder hurtigt, pipette 5 pi af bakteriesuspension på en enkelt brød brik i et mikrocentrifugerør. Opløsningen skal være helt absorberet af brødet stykke.
  9. At bestemme den faktiske titer af inoculum tilsættes 1 ml sterilt PBS til en af ​​brødet pieces. Vortex kraftigt i 1 min. Forbered seriefortyndinger og plade både BHI og BHI / L + G agar.
  10. Alternativ procedure for høj titer (> 10 9 CFU) podestoffer. Hvis bakteriepelleten er for stor, kan det være vanskeligt at suspendere i sådan en lille volumen, og det resulterende materiale er meget tyktflydende, ligesom en pasta, og nogle af inoculum kan klæbe til siderne i mikrocentrifugerør. I dette tilfælde er det bedre at pode brødet i en steril 60 mm kultur skålen, og at tilbyde hele skålen (uden låg) til mus (se nedenfor). Eventuelle overskydende inokulum, der ikke absorberes af brødet kan derefter spises direkte af musen. Generelt tager det længere tid for mus at spise hele brød og slikke skålen ren end standard protokollen beskrevet nedenfor, så dette er kun den foretrukne metode, når der beskæftiger sig med meget høj titer podestoffer.

3.. Infektion af mus

  1. Køb BALB / c / By / J (Stock # 0.010.026) og C57BL/6/J (lager# 000.644) fra The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) og brug ved 6-9 ugers alderen.
  2. Hurtigt musene en dag (24 timer) forud for infektion ved at fjerne mad og placere musene på en hævet (1 inch) wire gulve (# 3 maske Allentown) for at forhindre coprophagy. Efterlad kun nok strøelse i buret for at absorbere urin, men ikke nok til at ophøje kaste afføring. Tillad ubegrænset adgang til vand.
  3. Inficere mus ved begyndelsen af ​​den mørke cyklus, der arbejder i et stinkskab med sideværts luftstrømning udstyret med en rød pære. Overfør en enkelt mus til en tom (ingen strøelse) bur. Ved hjælp af en steril pincet, det forurenede brød brik overføre til bunden af ​​den tomme bur. Typisk vil musen afhente brød brik og forbruge det helt inden 2-10 min. Hvis musen ikke spise brød med det samme, returnerer buret til rack og overlade musen uforstyrret i 20-30 min. De fleste af dyrene vil spise brød inden for denne tidsramme, dog kan de mus stå uforstyrret, uden adgang til othendes mad eller vand i op til 2 timer.
  4. Efter infektion, returnere musen til sin oprindelige bur og genopbygge musefoder. Fortsæt med at huse de mus på hævet wire gulv til eksperimentets varighed.

4.. Overvåger graden af ​​Bakterier Shed i Afføring

  1. Label og præ-veje mikrocentrifugerør skal anvendes til opsamling af afføring.
  2. Arbejde hurtigt efter at hente et bur af mus, placerer hver mus i en 500 ml plastbæger. Typisk musene vil udvise 1-4 skammel pellets inden for 5 min.
  3. Brug en steril pincet til at overføre afføring til passende mærkede rør.
  4. Afvejes hvert rør og beregne vægten af ​​afføring ved fratrækning af vægten af ​​de tomme rør. Typiske vægte for fækalier spænder fra 10 til 30 mg.
  5. Tilføj PBS til hvert glas (200 μl/30 mg afføring), og brug en steril tandstik til at mash fecal pellets.
  6. Vortex hvert rør i 30 sek, så forbered seriefortyndinger og plade på BHI / L+ G agar. Tæl antallet af kolonier og beregne CFU / mg afføring.

5.. Behandling af inficerede tarmvæv

  1. Aflive musene aseptisk høste maven og tarmene fra hver mus som et enkelt væv og samle i tomme 100 mm petriskåle.
  2. Adskil tyndtarmen, coecum og colon og sted i separate 60 mm skåle lagret på is. Tyndtarmen kan yderligere opdeles efter længde i tre lige store stykker tilnærmelse duodenum, jejunum og ileum at lette fjernelsen af ​​de luminale indhold. De væv tredjedele kan derefter behandlet enten sammen (CFU pr hele tyndtarmen) eller separat. Vådt væv med ~ 0,5 ml sterilt PBS til at holde bøjelig og forhindre tårer under håndteringen.
  3. Fyld en 10 ml sprøjte med 8 ml sterilt PBS og vedlægge en 25 g nål. Brug sterile pincet til at presse ud af de luminale indholdet i et spild bægerglas (eller et sterilt 50 ml rør, hvis indsamle de luminale bakterier). FlusT 4 ml PBS gennem den ene ende af vævet, skal du bruge pincet til at presse indholdet ud, og derefter vende vævet over og gentag på den anden ende.
  4. At kvantificere antallet af Listeria i de luminale indhold, centrifugeres puljede skyller i 20 minutter ved 12.000 xg, suspendere pellet i 0,5 til 1,0 ml sterilt vand.
  5. For at kvantificere det samlede antal celle-associeret beløb Listeria, åbne hver vasket væv ved at skære langs med steril skalpel klinge, og derefter foretage flere laterale snit til at skære vævet i mindre fragmenter Note:. Dette trin er afgørende for at sikre, at tarmens væv ikke ombrydes omkring homogenisatoren bladet. Overfør intestinale brikker til et 15 ml centrifugerør indeholdende 2 ml sterilt vand.
  6. Sterilisere et væv homogenisator (Fisher PowerGen 1000) ved at placere sonden i 70% ethanol ved 60% effekt i 30 sek. Vent til ethanol til lufttørre, eller proces i sterilt vand i 10 sek. Homogeniser hver tissue i 1 min. Gentag behandling med sterilt vand mellem hver prøve, og bruge 70% ethanol mellem prøvegrupperne.
  7. Forbered seriefortyndinger af hver prøve i sterilt vand og plade på BHI / L + G-agar.

6.. Behandling af inficerede mesenteriallymfeknuder

  1. Harvest lymfeknuder aseptisk sted i et sterilt 60 mm skål på is, og brug steril pincet til at fjerne alle vedhæftede fedt. Forvent at finde 3-6 noder pr mus.
  2. Forbered trådnet skærme ved at skære 1,5-2 kvadratiske stykker af rustfrit stål nr. 80 mesh. Lav et lille snit i hvert hjørne, og fæld de fire sider, hvilket skaber et højbed. Dyp i 95% ethanol og derefter flamme at sterilisere, og anbringes i en 60 mm petriskål indeholdende 0,75 ml sterilt vand. Efter hver brug, kan skærmene genbruges ved iblødsætning i 70% ethanol i 20 min, skrubbe med en børste til at fjerne indlejrede væv, kogning i 20-30 min i 2 N NaOH og derefter skylle grundigt med vand.
  3. Bruge stempletfra en steril 3 ml sprøjte til mash knudepunkter gennem mesh sigte. Vær sikker på at presse ned på skærmen til bunden af ​​skålen, så det kommer i kontakt med vandet i skålen.
  4. Pass 0,75 ml sterilt vand gennem skærmen og derefter pipetteres op og ned flere gange for at skylle skærmen. Overførsel cellesuspension til et mikrocentrifugerør.
  5. Vortex hver prøve kraftigt i 30 sekunder for at lysere cellerne. Forbered seriefortyndinger og plade på begge BHI / L + G agar.

7.. Behandling af inficerede milt, lever, og galdeblære

  1. Tag fat milt med sterile pincetter og befri ved at gøre to snit, en i hver ende. Sted i en 15 ml rør indeholdende 2,5 ml sterilt vand. (Bemærk: rør med runde bunde kan være lettere at bruge med homogenisatoren.)
  2. Find galdeblære (en lille gul væskefyldt sæk knyttet til leveren), og snip forsigtigt med steril saks at løsne sig fra leveren uden sprængladning. Transfis til et mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml sterilt vand.
  3. Aseptisk fjerne leveren, og sørg for at fjerne alle lapper, og overføres til en 15 ml centrifugerør, der indeholder 2,5 ml sterilt vand.
  4. Homogenisere milt og lever som beskrevet ovenfor for 30 sek på 60% effekt. Forgall blærer, brug steril saks til at rive fra hinanden i mikrocentrifugerør og derefter vortex kraftigt i 30 sek.
  5. Forbered seriefortyndinger og plade hver prøve på enten BHI eller BHI / L + G agar.

8.. Behandling af inficerede Brains

  1. Arbejde fra bagsiden af ​​musen, skære huden og vævet over halsen, og på tværs af begge ører ved en 45 ° vinkel. Brug en steril pincet at skalle den U-formede hudlap ved at trække mod næsen og eksponere kraniet og ansigtet knogler.
  2. Immobilisere kraniet ved at holde benet højderyggen mellem øjnene med en pincet, og bruge saks til at gøre lavvandede snit på tværs af de laterale kanter af kraniet. Væreomhyggelig med at skære kun knoglen og ikke hjernevævet. Dernæst skære knoklet højderyg mellem øjnene. Brug en pincet til at holde toppen af ​​kraniet, og træk bagud (mod halsen) for at blotlægge hjernen.
  3. Løft forsigtigt hjernen fra dens hulrum ved hjælp af en steril pincet og anbring dem i et 15 ml centrifugerør indeholdende 1,5 ml sterilt vand.
  4. Homogeniseres i 20 sekunder på 60% effekt som beskrevet ovenfor. Forbered seriefortyndinger og plade på begge BHI eller BHI / L + G agar.

9.. Supplerende Fremgangsmåde: Fraktionering af tarmvæv

9.1 Isolation af bakterier i slim Fraktion

  1. For hver tarm væv, forberede 3 rør indeholdende 3 ml 6 mM N-acetylcystein (NAC, Sigma # A-9165).
  2. Placer blussende og i længderetningen skæres væv i det første rør i 1-2 min, energisk hvirvlende hver 20-30 sek. Ved hjælp af steril pincet, afhente vævet og forsigtigt klemme mod siden af ​​røret for at fjerne overskydende liquid.
  3. Gentag trin 9.1.2 to gange mere ved hjælp af de resterende NAC rør. Fjern tarmvævet og der er afsat til videre forarbejdning.
  4. Pool NAC vasker (alt 9 ml), og centrifugeres i 20 minutter ved 12.000 x g..
  5. Pellet resuspenderes i sterilt vand, vortex i 30 sek, forberede seriefortyndinger og plade på BHI / L + G.

9.2 Isolation af bakterier i epitelcelle (EF) Fraktion

  1. Skær hvert væv i små stykker med steril saks og anbringes i en 50 ml-rør indeholdende 5 ml RPMI (Invitrogen # 21870) suppleret med 5% FBS (RP-5), 5 mM EDTA og 1 mM DTT. Inkuber under omrystning ved 37 ° C i 20 min.
  2. Overfør intestinale brikker til et frisk rør indeholdende 5 ml RP5/EDTA/DTT og inkuberes under omrystning ved 37 ° C i 20 min. Gem medier fra det første rør og der er afsat ved 37 ° C. Gentag denne proces en gang mere for i alt tre 20 min inkuberinger i RP5/EDTA/DTT. Hvis du fortsætter til lamina propria isoning trin overføre de resterende tarm brikker i det tomme 50 ml rør.
  3. Kombiner de tre RP5/EDTA/DTT vaskninger (totalvolumen på 15 ml) og centrifugeres ved lav hastighed (1.200 x g) for at pelletere cellerne.
  4. At kvantificere ekstracellulære bakterier, indsamle supernatanten og centrifugeres i 20 minutter ved 12.000 x g.. Pellet resuspenderes i 0,5 til 1,0 ml sterilt vand og plade seriefortyndinger på BHI / L + G agar.
  5. At opregne intracellulære bakterier, resuspender EF pellet i 5 ml RP-5 indeholdende 25 ug / ml gentamicin. Inkuber enkelt cellesuspension i 30 minutter ved 37 ° C plus 7% CO2 at dræbe eventuelle resterende ekstracellulære L. monocytogenes. Vask cellerne to gange i PBS, suspendere i 0,5 ml sterilt vand, og vortex i 30 sekunder for at lysere cellerne. Forbered seriefortyndinger i vand og plade på BHI / L + G.
    Bemærk: Cellerne indsamlet på dette stadium vil også indeholde celler fra den underliggende Peyerske plaques. Hvis det ønskes, den synlige Peyer'skePlasteret kan fjernes fra tarmvæv før skylning og skæring i længderetningen.

9.3 Isolering af bakterier i lamina propria (LP) Fraktion

  1. Skyl overskydende DTT / EDTA fra tarmens stykker ved tilsætning af 25 ml sterilt PBS til røret. Ryst kraftigt, overføre til et frisk rør og gentag to gange.
  2. Overfør intestinale brikker til et 50 ml rør indeholdende 4 ml fordøjelse opløsning bestående af RP-5 suppleret med 1 mg / ml type IV collagenase og 40 ug / ml DNAse I. Inkuber under omrystning ved 37 ° C i 40 min.
  3. Overfør ufordøjede brikker til et frisk rør indeholdende 4 ml fordøjelse opløsning og gentag en gang eller to gange, indtil vævsstykker helt fordøjet. Gem hver af de fordøjelsesmetoder løsninger, som indeholder befriede LP celler ved 37 ° C.
  4. Centrifuger poolede fordøjelsen løsninger ved lav hastighed (1.200 xg) for at sammenpresse cellerne. Behandl supernatanten og cellebundfaldet separat som descrIBED ovenfor at optælle ekstracellulære og intracellulære bakterier hhv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

L. monocytogenes kolonier vil være synlig på BHI / L + G-plader efter 36-48 timers inkubation ved 37 ° C. Kolonierne har en glat, kuppelformet cremet hvidt udseende (figur 1A). Væksten vil blive inhiberet for størstedelen af tarmens mikrobiota, men det er almindeligt at se nogle kolonier, der ikke L. monocytogenes, især når plating tyndtarmen eller tyktarmen direkte uden signifikant fortynding (figur 1B). Suspekte kolonier kan bekræftes ved plettering på ChromAgar TM Listeria plader. L. monocytogenes vises som blå kolonier omgivet af en hvid glorie på disse plader (figur 1C). Detektionsgrænsen for L. monocytogenes i hvert væv er afhængig af mængden af vand, der anvendes til at homogenisere vævet. De prøvevolumener vist i tabel 1 repræsenterer den minimale mængde nødvendig for effektivt at behandle hvert væv. Homogenater af milt, galle blære, hjerne, eller fraktioneret tarmvæv kan opbevares ved 4 ° C i 1-2 dage og re-belagt evt. Colon, tyndtarmen eller lever homogenater kan hæmme nogle L. monocytogenes vækst medmindre prøven fortyndes tilstrækkeligt (figur 1D), og disse homogenater ikke give lignende kimtal hvis re-belagte efter opbevaring ved 4 ° C.

Vi har tidligere vist, at BALB / c / Af / J (BALB) mus var væsentligt mere modtagelige for fødevarebårne listeriose end C57BL / 6 (B6)-mus 16. Et inokulum på 10 7 CFU er tilstrækkeligt til at fastslå tarminfektion i BALB mus, men mindst 10 8 CFU er nødvendig for at kolonisere mave-tarmkanalen af B6 mus (figur 2). Som vist i figur 2, vil den bakterielle belastning i tarmene, milt, lever og galdeblære være proportional med den udfordring dosis givet til musene. Foreløbige undersøgelser tyder på, at 5 x 10 9 CFU erden omtrentlige LD 50 for BALB / c / By / J mus ved hjælp af denne model 16..

Figur 1
Figur 1. Repræsentativ koloni vækst på selektive agarplader. A) L. monocytogenes kolonier efter 48 timers vækst på BHI / L + G-agar. B) BHI / L + G-agar hæmmer væksten af de fleste tarm mikrobiota, men nogle ikke-Listeria kolonier (pil) kan observeres ved lave fortyndinger. Agarpladen vist her indeholder 100 pi af en 10 -1 fortynding på halvdel af pladen, og 50 pi hver af de 10 -2 og -3 10 fortyndinger af et kolon homogenat. C) L. monocytogenes kolonier kan bekræftes ved vækst på Chrom agar Listeria plader. L. monocytogenes forekommer blåt med en hvid glorie omkring kolonien. D) Det er ikke ualmindeligt at see en hæmning af L. monocytogenes vækst, hvilket resulterer i kolonier af varierende størrelser, i den laveste fortynding af enten tarm eller lever homogenater plader på BHI / L + G-agar.

Figur 2
Figur 2. Dosisrespons fødevarebårne infektion i BALB / c / Af / J og C57BL / 6 mus. BALB / c / Af / J (BALB) og C57BL / 6 (B6)-mus blev inficeret med 10 9 (n = 7), 10 8 (n = 8), 10 7 (n = 6) og 10 6 (n = 4) Lm inla m, og antallet af CFU i hvert væv blev bestemt 5 dpi. Middelværdier + / - SD vises. Poolede data fra to forskellige eksperimenter blev analyseret. Stiplede linjer angiver detektionsgrænsen i hvert organ.

Væv Prøvevolumen (ml) en Detektionsgrænse (CFU)
Tyndtarmen 2,0 50
Cecum 2,0 50
Colon 2,0 50
Mesenteriallymfeknuder 1.5 15
Spleen 2.5 50
Lever 2.5 50
Galdeblære 0.5 10
Brain 1.5 15

Tabel 1. Detektionsgrænse for L. monocytogenes i vævshomogenater. et gennemsnit samlede stikprøve volumen bestående af sterilt vand plus den homogeniserede væv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Indavlede mus er ikke ensartet modtagelig for fodring på alle tidspunkter af dagen, og deres vilje til at spise det forurenede brød, vil afhænge både af stammen type og alder af de mus 17. Det er vores erfaring, er 6-9 uger gamle B6 mus modtagelig for fodring på ethvert tidspunkt af dagen, men BALB mus vil ikke konsekvent spise brød brik, medmindre det bliver tilbudt i løbet af deres mørke cyklus. Lyset cyklus af rummet brugt til at huse dyrene kan ændres, så den mørke fase falder sammen med den normale arbejdsdag for laboratorie personale. Imidlertid bør musene gives mindst to uger til at akklimatisere sig til den ændrede lys cyklus før infektion. Under infektion, skal der kun røde lamper bruges i enten selve rummet eller i den laminar flow hætte.

Ved udviklingen af denne model blev brød valgt som fødekilde til at transmittere L. monocytogenes hovedsagelig fordi brød er absorberende. Således var det let at mætte små stykker med the bakteriel inokulum og sikre, at hver mus indtaget den samme dosis. Imidlertid kunne denne model let tilpasses til at bruge andre fødekilder. Dette er nemlig den eneste mus model, der kan bruges til direkte teste virkningen af fødevarer sammensætning eller opbevaringsbetingelser på bakteriel infektivitet. L. monocytogenes kan nemt tilpasse til vækst i høj salt, lav pH-værdi, eller kolde temperaturer 1,2,18, men det vides ikke, om disse vækstbetingelser ændrer bakteriernes evne til at etablere tarminfektion.

Ca. 10 minutter er nødvendig for at høste alle de inficerede organer fra en enkelt mus. Galdeblære er let bristede, så det er bedst at fjerne det først. De mesenteriallymfeknuder er lettest at få øje på, når tarmene er ikke blevet forstyrret, så de skal fjernes næste. Tarmene kan høstes som et enkelt væv ved at skære lige under maven og lige over tillægget, og derefter adskilt i duodenum, jejunum, ileum, coecum og colon lige før skylning og homogenisering. Milt og lever fjernes typisk næste, og hjernen høstes efter hentning organer fra bughulen, da det er nødvendigt at dreje musen for at få adgang kraniet. Når man arbejder med flere mus, bør alle væv opbevares på is indtil de forarbejdes. For de fleste væv, blev en agarplade anvendt til at bestemme det samlede antal af CFU stede i vævet. Pladen blev opdelt i tredjedele, og en 50-100 gl prøve af tre separate fortyndinger af vævshomogenatet blev udpladet på hver tredje.

De metoder, der er beskrevet her, vil identificere det samlede antal L. monocytogenes i hver mus væv, ikke kun de intracellulære organismer. Den unikke intracellulære livsstil L. monocytogenes menes at være en afgørende virulens faktor under infektion 18,19. Men L. monocytogenes er fakultative, ikke obligate, intracellulære patogener, og there er ingen definitive offentliggjorte rapporter at angive den procentdel af Listeria, der rent faktisk bor i celler in vivo. De fleste tidligere undersøgelser med oral L. monocytogenes infektion påberåbt gentamicin behandling af gut væv til at hæmme væksten af tarm mikrobiota. Forbehandling med gentamicin har potentiale til at fjerne ekstracellulære L. monocytogenes, tillader inddrivelse af kun de intracellulære bakterier, selv om det ikke er klart, i hvilket omfang gentamicin er i stand til at trænge hele tarmvæv in vitro. Den supplerende protokollen beskrevet her tillader bestemmelse af både ekstracellulære og intracellulære bakterier i slimlaget, epitelet, og lamina propria rum af inficerede tarmvæv. I denne procedure, er gentamicin anvendes til behandling af enkelte cellesuspensioner, sikre, at alle gendannede bakterier var i celler i vævet.

Tre vaske med NAC typisk reflyttet størstedelen af ​​slim fra tarmvæv, og de samlede vaske indeholdt ingen eukaryote celler (levedygtige eller døde) som bestemt ved trypanblåt-farvning. Yderligere vaske gav ikke synlig slim som bestemt ved Diff-Quik-farvning af cytospin præparede. Den cellularity af EF-og LP-fraktioner kan også bekræftes ved hjælp Diff-Quik eller Giemsa farvning. EF fraktion bør bestå af primært epitelceller, som let kan skelnes fra de få intraepitel lymfocytter til stede i tarmepitelet. LP fraktion er mere forskelligartet, indeholder en blanding af mononukleære celler, som ændrer sammensætningen efter infektion, når inflammatoriske monocytter infiltrere væv.

Den fødevarebårne model for listeriose kan anvendes med en bred vifte af L. monocytogenes isolater, herunder muse-tilpasset inla m-udtrykkende stamme 15, som beskrevet her, vildtype EGDE, og deletionsmutant deriderivater af disse stammer 16. I en tidligere undersøgelse viste vi, at niveauet af intestinal kolonisering ikke varierede betydeligt blandt disse stammer imidlertid isolater, der ikke udtrykker en høj affinitetsligand for murin E-cadherin havde en lettere fejl ved videregivelse til de mesenteriske lymfeknuder og milt 16.. Ligeledes kan enhver musestamme anvendes til infektion, hvilket gør dette til en attraktiv modelsystem til at studere både bakteriel patogenese og vært reaktioner på infektion. Endelig, selv om vi endnu ikke har testet dette direkte, foreslår vi, at de grundlæggende procedurer, der anvendes her bør være bredt anvendelig til andre fødevarer bæres bakterielle patogener, såsom Salmonella, Yersinia, Escherichia, Campylobacter og Citrobacter arter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser. Alle forsøg beskrives her blev udført i overensstemmelse med Kontoret for Laboratory Animal Welfare (OLAW) med godkendelse af ICAUC ved University of Kentucky.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (AI079442 og AI091918) tildeles SEFD

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Brain Heart Infusion Agar Difco BD-241830
Lithium chloride Sigma L9650
Glycine Omnipur 4840
EDTA Gibco 15575-038
DTT Sigma D5545
Collagenase, type IV Worthington LS004089
DNAse I Worthington LS002007
Diff-Quik Dade-Behring B4132-1A
PowerGen 1000 homogenizer Fisher 14-261-06
stainless steel type 304 mesh #80 Small Parts, Inc. CX-0080-C
Cytospin Statspin M801-22

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Becker, L. A., Evans, S. N., Hutkins, R. W., Benson, A. K. Role of sigmaB in adaptation of Listeria monocytogenes to growth at low temperature. Journal of Bacteriology. 182, 7083-7087 (2000).
  2. Neunlist, M. R., et al. Effect of salting and cold-smoking on the culturability, viability, and virulence of Listeria monocytogenes strain Scott A. Journal of Food Protection. 68, 85-91 (2005).
  3. Aureli, P., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes. N. Engl. J. Med. 342, 1236-1241 (2000).
  4. Dalton, C. B., et al. An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk. N. Engl. J. Med. 336, 100-105 (1997).
  5. Frye, D. M., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with delicatessen meat contaminated with Listeria monocytogenes. Clin. Infect. Dis. 35, 943-949 (2002).
  6. Salamina, G., et al. A foodborne outbreak of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes. Epidemiol. Infect. 117, 429-436 (1996).
  7. Mead, P. S., et al. Food-related illness and death in the United States. Emerging Infectious Diseases. 5, 607-625 (1999).
  8. Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: Clinical and experimental update. The Journal of Infectious Disease. 185, S18-S24 (2002).
  9. Condotta, S. A., Richer, M. J., Badovinac, V. P., Harty, J. T. Probing CD8 T cell responses with Listeria monocytogenes infection. Advances in Immunology. 113, 51-80 (2012).
  10. Disson, O., et al. Modeling human listeriosis in natural and genetically engineered animals. Nat Protoc. 4, 799-810 (2009).
  11. Czuprynski, C. J., Faith, N. G., Steinberg, H. A/J mice are susceptible and C57BL/6 mice are resistant to Listeria monocytogenes infection by intragastric inoculation. Infect. Immun. 71, 682-689 (2003).
  12. Gajendran, N., et al. Regional IFNgamma expression is insufficient for efficacious control of food-borne bacterial pathogens at the gut epithelial barrier. Int. Immunol. 19, 1075-1081 (2007).
  13. Lecuit, M., et al. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
  14. Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infect. Immun. 66, 747-755 (1998).
  15. Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
  16. Ghanem, B. ou, N, E., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathogens. , Submitted for publication (2012).
  17. Kowal, M., Buda-Lewandowska, D., Plytycz, B., Styrna, J. Day/night food consumption in mice is strain and age-dependent. Folia Biol. (Krakow). 50, 1-3 (2002).
  18. Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature reviews. Microbiology. 7, 623-628 (2009).
  19. Camejo, A., et al. The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle. Virulence. 2, 379-394 (2011).

Tags

Infektion mikrobiologi immunologi infektionssygdomme genetik medicin Biomedical Engineering anatomi fysiologi patologi kirurgi Listeria dyremodeller bakterier tarme fødevarebårne patogener, Bakterielle patogener podningen isolation cellekultur mus dyremodel
Oral transmission af<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; I Mus via indtagelse af forurenet mad
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bou Ghanem, E. N., Myers-Morales,… More

Bou Ghanem, E. N., Myers-Morales, T., Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. Oral Transmission of Listeria monocytogenes in Mice via Ingestion of Contaminated Food. J. Vis. Exp. (75), e50381, doi:10.3791/50381 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter