Mondelinge transmissie van Published: May 6, 2013 doi: 10.3791/50381

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Elsa N. Bou Ghanem¹, Tanya Myers-Morales¹, Grant S. Jones¹, Sarah E.F. D'Orazio¹

¹Department of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of Kentucky

Summary

Dit document beschrijft een nieuwe werkwijze voor orale infectie van muizen met

Abstract

L. monocytogenes zijn facultatief intracellulaire bacteriële pathogenen die voedsel overgedragen infecties veroorzaken bij de mens. Zeer weinig is bekend over de gastrointestinale fase van listeriose door het ontbreken van een klein diermodel dat nabootst menselijke ziekte. Dit document beschrijft een nieuw muismodel voor de mondelinge overdracht van L. monocytogenes. Met behulp van dit model, muizen gevoed L. monocytogenes verontreinigd brood een discrete fase van gastrointestinale infectie, gevolgd door een verschillende mate van systemische verspreiding in vatbare (BALB / c / By / J) of resistent (C57BL / 6) muizenstammen. Tijdens de latere stadia van de infectie, wordt verspreiding van de galblaas en de hersenen waargenomen. Het voedseltoxi model van listeriose zeer reproduceerbaar, niet gespecialiseerde vaardigheden vereist en kan worden gebruikt met een grote verscheidenheid van bacteriële isolaten en laboratorium muizenstammen. Als zodanig is het ideale model om zowel virulentie strategieën gebruikt door L. bestuderen monocytogenes

Introduction

Listeria monocytogenes zijn facultatief intracellulaire bacteriële pathogenen die voedsel overgedragen infecties veroorzaken bij de mens. De bacteriën zijn resistent tegen veel van de processen is aan voedsel, zoals drogen beschermen, zouten of koeling ^1,2 en infecties worden meestal verbonden verwerkt "ready-to-eat" voedingsmiddelen niet vóór verwarmd consumptie . In verscheidene eerdere uitbraken, de bron van L. monocytogenes-besmet voedsel werd geïdentificeerd, en de beperkte groep van blootgestelde personen werd op de voet gevolgd ^3-6. In die voorbeelden, klinische ziekte bij overigens gezonde personen varieerde van een mild, self-limiting buikgriep tot meer ernstige intestinale en systemische infecties waarvoor ziekenhuisopname noodzakelijk was. L. monocytogenes infecties bij immuun gecompromitteerde individuen, zowel pasgeborenen en ouderen, zijn geassocieerd met een hoge mortaliteit (25-30%), zelfs bij behandeling met antibiotica L. monocytogenes of de gastheer factoren die bepalen gevoeligheid voor infectie na orale transmissie, hoofdzakelijk door het ontbreken van een klein diermodel dat recapituleert deze uiteenlopende infecties resultaten.

De meest gebruikte model van listeriose intraveneus (iv) inoculatie van muizen. De iv-model is zeer reproduceerbaar, en is zeer nuttig geweest voor het bestuderen van zowel naïeve en memory T-cel responsen tijdens infectie ^9,10. Het nadeel van de iv model is dat het volledig omzeilt de intestinale fase van de infectie. Na overdracht door voedsel, het darmslijmvlies zorgt voor een barrière die vermoedelijk vertraagt ​​en beperkt het aantal bacteriën die voortdurend kunnen verspreiden naar de perifere weefsels. In tegenstelling, kan de hele inoculum te vinden in de milt en lever binnen enkele minuten van intraveneuze toediening, en deze grote bolus van organismen kan aangeboren immuunsysteem d overweldigenefenses in deze weefsels. Orale infectie van muizen met een sonde wordt minder vaak gebruikt, omdat grote doses (10 ⁹ -10 ¹¹ CFU) meestal moeten darmflora bereiken ^10. Ook heeft intragastrische (ig) inoculatie met een voeding naald niet het genereren van een reproduceerbare periode van gastro-intestinale infecties voorafgaand aan systemische verspreiding. Sommige laboratoria hebben gemeld dat L. monocytogenes bereiken de milt en lever binnen 4-12 uur na infectie (hpi), terwijl anderen toonden geen systemische verspreiding tot 48 hpi ^11-15. Dit lab tot lab-variatie kan een gevolg zijn van de invasieve aard van inoculatie ig zijn, die kunnen resulteren in minder trauma aan het slijmvlies van de slokdarm en stimuleren van directe bloedbaan invasie van bacteriën.

We hebben onlangs een nieuw muismodel van orale L. ontwikkeld monocytogenes infectie die nabootst alle fasen van menselijke ziekten ^16. Infectie treedt op wanneer de muizen innemen stukken contgeamineerd voedsel, een proces dat niet-traumatische, en geen speciale vaardigheden vereist door het laboratorium onderzoekers. Voor een discrete tijd (36-48 uur), L. monocytogenes reproduceerbaar koloniseren alleen het maagdarmkanaal, waardoor onderzoek naar de mechanismen die door pathogene Listeria te verplaatsen in de darm mucosa en verspreiden perifere weefsels. Belangrijk is, kan het model worden gebruikt om verschillen in gastheer aangeboren weerstand tegen infecties te bestuderen. In een eerdere studie hebben we aangetoond dat BALB / c / By / J muizen zeer gevoelig voor voedsel overgedragen listeriose, met exponentiële replicatie van L. monocytogenes zich in de darm, milt, lever en galblaas ^16. Daarentegen, C57BL / 6 muizen tegen voedsel gedragen besmetting, met slechts tijdelijke kolonisatie van L. monocytogenes zich in elk van deze weefsels. Een extra functie van het voedsel overgebrachte model dat nauw bootst menselijke ziekte is dat natuurlijke verspreidingde hersenen tijdens de latere stadia van de infectie (5-7 dpi) opgetreden.

Protocol

1. Voorbereiding van Selective Agar Media (BHI / L + G) om darmmicrobiota Inhibit

1. Weeg 26 g Brain Heart Infusion Agar (Difco), 7,5 g LiCl en 5,0 g glycine en plaats in een 1 liter kolf. Voeg 500 ml gedeïoniseerd water.
2. Verwarm op een magnetische roerder totdat de agar kookt, onder voortdurend roeren. Neem de kolf van het vuur, laat de bubbels te wikkelen kort, en breng weer aan de kook dan.
3. . Autoclaaf gedurende 30 minuten bij 121 ° C onder 16-19 psi op een vloeistof cyclus Let op: laat het roerstaafje in de kolf.
4. Evenwicht van de media tot 55 C in een waterbad ° of laat afkoelen op kamertemperatuur. Sta niet toe dat de oplossing voor koeler dan 55 ° C te krijgen of kristallen in de agar te vormen. De kristallen hebben L. niet remmen groei of monocytogenes invloed op de selectieve eigenschappen van de media. Echter, de kristallen lijken op kleine kolonies en zal het moeilijk om bacteriële CFU tellen.
5. Meng voorzichtig deagar gedurende 1 min met een magneetroerder. De vorming van luchtbellen te voorkomen. Giet de agar in petrischalen (~ 25 ml / plaat).
   Opmerking: Dit medium biedt geen ondersteuning voor de groei van alle L. monocytogenes stammen. Bijvoorbeeld, L. monocytogenes egde groeit goed op deze agar, met kolonies zichtbaar binnen 36-48 uur, maar 10403s groeit niet op deze media.

2. Bereiding van het inoculum

1. Snijd gesneden wit brood (Kroger) in kleine (2-3 mm) blokjes met steriele schaar ora steriele scalpel. Gebruik niet de korsten. Bewaar individuele stukken in microcentrifugebuizen bij -20 ° C tot de dag van de infectie.
2. Met een steriel scalpel, snijd kleine (0,5-1 cm) brokken van gezouten boter (Kroger) en plaats elk in een steriele microcentrifugebuis. 60 stukjes brood - elke buis zal genoeg boter te bereiden 50 bevatten. Bewaar bij -20 ° C totdat het nodig is.
3. Groeien L. monocytogenes in BHI bouillon schudden bij 30 ° C totdat de cultuur bereikt een OD ₆₀₀ van ~ 0.8-1.0. Bereid 500 ul fracties in microcentrifugebuizen, zorg ervoor vortex het monster vaak zo alle buisjes bevatten hetzelfde aantal bacteriën. Bewaren bij -80 ° C.
4. Om de bacteriële monsters titreren, ontdooien een buis op ijs, voeg dan 500 ul tot 9,5 ml BHI bouillon. Incubeer gedurende 1,5 uur staan ​​bij 30 ° C. Plaat seriële verdunningen op BHI agar. Verwacht een titer van 1,5 x 10 ~ ⁸ CFU / ml. Opmerking: Als homogene fracties bereid, kan verwachten elk van de buizen om deze titer verkregen wanneer bereid op een soortgelijke wijze met een variatie van 2 tot 4-voudig.
5. Aan muizen infecteren, bereiden een hoeveelheid van L. monocytogenes zoals beschreven in stap 2.4. Ongeveer 20 min voor de L. monocytogenes cultuur is klaar, ontdooien de stukken brood bij RT. Smelt een hoeveelheid boter bij 55 ° C en voorverwarmen een klein volume PBS bij 55 ° C. Bereid genoeg brood stukken, zodat er minstens een per muisbesmet zijn en ten minste een extra werk voor het bepalen van de titer van de werkelijke inoculum.
6. Gebaseerd op de vooraf bepaalde titer van het bacteriële monster, berekent het totale volume van L. monocytogenes cultuur nodig inocula te bereiden voor het gewenste aantal stukken brood. Pellet de bacteriën door centrifugeren bij 14.000 xg gedurende 10 min Verstuif alle BHI bouillon en resuspendeer de bacteriën in een klein volume van voorverwarmde PBS (2 pl / stuk brood).
7. Vortex de gesmolten boter, voeg toe aan bacteriën (met een totaal volume gelijk aan 3 pi / brood stuk) en meng. Opmerking: Probeer niet meer dan 10-15 stukjes brood te bereiden op een bepaald moment of de boter zal stollen.
8. Snel werkende, pipet 5 ul van de bacteriële suspensie op een enkel stuk brood in een microcentrifugebuis. De oplossing moet volledig worden geabsorbeerd door het brood stuk.
9. Om de feitelijke titer van het inoculum te bepalen, voeg 1 ml steriel PBS tot een van de brood stues. Vortex krachtig gedurende 1 minuut. Bereid seriële verdunningen en plaat zowel BHI en BHI / L + G-agar.
10. Alternatieve procedure voor hoge titer (> 10 ⁹ CFU) inocula. Als de bacteriële pellet te groot is, kan het moeilijk worden geschorst zo'n klein volume, en het resulterende materiaal is zeer viskeus, zoals een pasta, en enkele van de inoculum kan kleven aan de wanden van de microcentrifugebuis. In dit geval, is het beter om het brood inoculeren in een steriele 60 mm kweekschaal, en de volledige schaal (zonder deksel) bieden de muis (zie hierna). Overtollig inoculum dat niet wordt geabsorbeerd door het brood kan dan direct door de muis worden gegeten. In het algemeen langer de muizen om alle brood eten en likken schotel schoner dan de hieronder beschreven standaardprotocol neemt, dus dit is alleen de voorkeur bij de behandeling van hoge titer inocula.

3. Infectie van Muizen

1. Aankoop vrouwelijke BALB / c / Door / J (voorraad # 0010026) en C57BL/6/J (voorraad# 000644) van The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) en gebruik bij 6-9 weken oud zijn.
2. Snel de muizen op een dag (24 uur) voorafgaand aan de infectie door het verwijderen van het eten en het plaatsen van de muizen op verhoogde (1 inch) draad vloeren (# 3 mesh; Allentown) om coprofagie te voorkomen. Verlaat slechts genoeg beddengoed in de kooi om urine te absorberen, maar niet genoeg om te werpen uitwerpselen verheffen. Sta onbeperkte toegang tot water.
3. Infect de muizen bij het begin van de donkere cyclus staat in een laminaire stroming kap uitgerust met een rode lamp. Overdracht van een enkele muis op een lege (geen beddengoed) kooi. Met behulp van een steriele tang, overdracht van de verontreinigde stuk brood naar de bodem van de lege kooi. Doorgaans zal de muis halen het brood stuk en verbruiken volledig binnen 2-10 minuten. Als de muis niet eet het brood meteen, terug de kooi te rekken en laat de muis ongestoord gedurende 20-30 minuten. De meeste dieren zullen het brood eten binnen deze tijd, maar de muizen kunnen worden ongemoeid gelaten, zonder toegang tot othaar eten of water voor maximaal 2 uur.
4. Na infectie, de terugkeer van de muis naar de oorspronkelijke kooi en vervult de muis chow. Blijven de muizen op verhoogde draad vloeren huisvesten voor de duur van het experiment.

4. Monitoring van het niveau van bacteriën Shed in Uitwerpselen

1. Etiketten en pre-wegen microcentrifuge buizen worden gebruikt voor het verzamelen van ontlasting.
2. Snel werken na het ophalen van een kooi van muizen, plaatst elke muis in een ml plastic beker 500. Typisch de muizen zal verdrijven 1-4 ontlasting pellets binnen 5 minuten.
3. Gebruik een steriele tang om ontlasting overbrengen naar behoren is geëtiketteerd buizen.
4. Weeg elke buis en bereken het gewicht van de ontlasting door het gewicht van de lege buis. Kenmerkende gewichten voor fecale pellets variëren 10-30 mg.
5. Voeg PBS aan elke buis (200 μl/30 mg feces) en gebruik een steriele tandenstoker om mash de fecale pellets.
6. Vortex elke buis gedurende 30 seconden, dan bereiden seriële verdunningen en plaat op BHI / L+ G agar. Tel het aantal kolonies en bereken CFU / mg feces.

5. Verwerking van Infected darmweefsel

1. Euthanaseren de muizen, aseptisch de oogst van de maag en darmen van elke muis als een enkele weefsel en verzamelen in lege 100 mm petrischalen.
2. Scheid de dunne darm, blindedarm en dikke darm en plaats in een aparte 60 mm gerechten op ijs bewaard. De dunne darmen kan verder worden gedeeld door lengte in drie gelijke stukken benadert het duodenum, jejunum en ileum verwijdering van de luminale inhoud te vergemakkelijken. Het weefsel tweederde kan vervolgens aan elkaar worden verwerkt (voor CFU per gehele dunne darm) of afzonderlijk. Natte weefsels met ~ 0,5 ml steriele PBS te soepel te houden en scheuren te voorkomen tijdens de behandeling.
3. Vul een 10 ml spuit met 8 ml steriel PBS en bevestig een 25 g naald. Gebruik een steriel pincet te persen uit de luminale inhoud in een afval beker (of een steriele 50 ml buis als het verzamelen van de luminale bacteriën). Grieph 4 ml PBS door het ene uiteinde van het weefsel, gebruik de tang te persen uit de inhoud, en klap het weefsel om en herhaal aan de andere kant.
4. Om het aantal Listeria in de luminale inhoud kwantificeren, centrifuge de gepoolde spoelt gedurende 20 min bij 12.000 xg, schorten de pellet in 0,5-1,0 ml steriel water.
5. Om het totale aantal cel-geassocieerde hoeveelheid Listeria kwantificeren, opent elke gewassen weefsel door te snijden in lengterichting met steriele scalpel, en maak dan een aantal laterale bezuinigingen op het weefsel snijden in kleinere fragmenten. Opmerking: deze stap is essentieel om ervoor te zorgen dat het darmweefsel niet wikkelen rond de homogenisator mes. Breng de intestinale stukken aan een 15 ml centrifugebuis die 2 ml steriel water.
6. Steriliseren weefselhomogenisator (Fisher PowerGen 1000) door het plaatsen van de sonde in 70% ethanol bij 60% vermogen gedurende 30 sec. Wacht tot ethanol aan de lucht drogen, of het proces in steriel water gedurende 10 sec. Homogeniseren elke tissue gedurende 1 min. Herhaal de behandeling met steriel water tussen elk monster, en het gebruik van 70% ethanol tussen monster groepen.
7. Bereid seriële verdunningen van elk monster in steriel water en plaat op BHI / L + G-agar.

6. Verwerking van Infected lymfklieren

1. Oogst lymfeklieren aseptisch, plaats in een steriele 60 mm schotel op het ijs, en het gebruik van steriele tang om alle aangesloten vet te verwijderen. Verwachten tot 3-6 knopen per muis vinden.
2. Bereid gaas schermen door het snijden van 1,5-2 inch vierkante stukjes van roestvrij staal # 80 mesh. Maak een kleine snede in elke hoek, en vouw langs de vier zijden, het creëren van een verhoogd bed. Dip in 95% ethanol en vervolgens vlam te steriliseren, en plaats in een 60 mm petrischaal met 0,75 ml steriel water. Na elk gebruik, kunnen de schermen worden gerecycled door het weken in 70% ethanol gedurende 20 min, schrobben met een borstel verwijderen ingebedde weefsels, koken gedurende 20-30 min in 2 N NaOH, en vervolgens uitgebreid spoelen met water.
3. Gebruik de zuigeruit een steriele 3 ml spuit om mash de knooppunten door de mazen scherm. Zorg ervoor dat u naar beneden te duwen op het scherm om de bodem van de schaal, zodat het in contact komt met het water in de schotel.
4. Pass 0,75 ml steriel water door het scherm en vervolgens pipet op en neer meerdere keren naar het scherm te spoelen. Overdragen celsuspensie om een ​​microcentrifugebuis.
5. Vortex elk monster krachtig gedurende 30 seconden om de cellen te lyseren. Bereid seriële verdunningen en de plaat aan beide BHI / L + G-agar.

7. Verwerking van Infected Milten, Levers, & Gall Bladders

1. Pak milt met steriele pincet en bevrijden door het maken van twee sneden, een aan elk uiteinde. Plaats in een 15 ml buis met 2,5 ml steriel water. (Opmerking: buizen met ronde bodems kan het gemakkelijker zijn te gebruiken met de homogenisator.)
2. Zoek de galblaas (een kleine gele vloeistof gevulde zak die aan de lever) en knip voorzichtig met een steriele schaar los te maken van de lever zonder barsten. Transfer een microcentrifugebuis met 1 ml steriel water.
3. Aseptisch verwijderen van de lever, en zorg ervoor dat alle lobben te verwijderen en over te dragen aan een 15 ml centrifugebuis met 2,5 ml steriel water.
4. Homogeniseer levers en milten zoals hierboven beschreven voor 30 seconden op 60% vermogen. Forgall blazen, steriele schaar om scheuren in de microcentrifugebuis, en vervolgens vortex krachtig gedurende 30 sec.
5. Bereid seriële verdunningen en plaat elk monster aan beide BHI of BHI / L + G-agar.

8. Verwerking van Infected Brains

1. Werken uit de achterkant van de muis, snijd de huid en het weefsel boven de nek, en over beide oren in een hoek van 45 °. Gebruik een steriele pincet te pellen uit de U-vormige flap van de huid door te trekken naar de neus en bloot de schedel en het gezicht botten.
2. Immobiliseren van de schedel door het houden van de benige richel tussen de ogen met een tang, en gebruik een schaar om ondiepe sneden over de laterale randen van de schedel te maken. Zijnvoorzichtig zijn om alleen de botten en niet het hersenweefsel te snijden. Daarna, snijd de benige richel tussen de ogen. Gebruik een tang om de top van de schedel te houden en trek naar achteren (naar de nek) naar de hersenen bloot.
3. Til de hersenen uit zijn holte met een steriele pincet en plaats in een 15 ml centrifugebuis met 1,5 ml steriel water.
4. Meng gedurende 20 seconden op 60% vermogen zoals hierboven beschreven. Bereid seriële verdunningen en de plaat aan beide BHI of BHI / L + G-agar.

9. Aanvullende Procedure: Fractionering van darmweefsel

9.1 Isolatie van bacteriën in het slijm Fraction

1. Voor elke darmweefsel bereiden 3 buizen met 3 ml 6 mM N-acetylcysteine ​​(NAC, Sigma # A-9165).
2. Plaats de gespoelde en overlangs gesneden weefsel in de eerste buis voor 1-2 min, krachtig kolkende elke 20-30 sec. Met behulp van een steriel pincet, pak de weefsel en knijp tegen de zijkant van de buis om het overtollige vloeibare zee te verwijderenid.
3. Herhaal stap 9.1.2 tweemaal met de resterende NAC buizen. Verwijder het darmweefsel en gereserveerd voor verdere verwerking.
4. Verzamel de NAC wast (totaal 9 ml) en centrifugeer gedurende 20 min bij 12.000 x g.
5. Resuspendeer de pellet in steriel water, vortex gedurende 30 seconden, bereiden seriële verdunningen en plaat op BHI / L + G.

9.2 Isolatie van bacteriën in de epitheelcellen (EG) Fraction

1. Snijd elk weefsel in kleine stukjes met een steriele schaar en plaats in een 50 ml buis met 5 ml RPMI (Invitrogen # 21870) aangevuld met 5% FBS (RP-5), 5 mM EDTA en 1 mM DTT. Incubeer onder schudden bij 37 ° C gedurende 20 minuten.
2. Breng de intestinale stukken naar een nieuwe buis met 5 ml RP5/EDTA/DTT en incubeer onder schudden bij 37 ° C gedurende 20 minuten. Sla de media uit de eerste buis en zet opzij bij 37 ° C. Herhaal dit proces opnieuw gedurende een totaal van 20 min drie incubaties RP5/EDTA/DTT. Indien wordt overgegaan tot de lamina propria isoning stap, draagt ​​de resterende darm stukjes in lege 50 ml buis.
3. Combineer de drie wassingen RP5/EDTA/DTT (totaal 15 ml) en gecentrifugeerd bij lage snelheid (1200 x g) om de cellen te pelleteren.
4. Om extracellulaire bacteriën kwantificeren, verzamel de supernatant en centrifugeer gedurende 20 min bij 12.000 x g. Resuspendeer de pellet in 0,5-1,0 ml steriel water en plaat seriële verdunningen op BHI / L + G-agar.
5. Intracellulaire bacteriën noemen, resuspendeer de pellet EC in 5 ml RP-5 bevattende 25 ug / ml gentamicine. Incubeer de enkele celsuspensie gedurende 30 minuten bij 37 ° C plus 7% _CO2 tot dood overgebleven extracellulaire L. monocytogenes. Was tweemaal de cellen in PBS, schorsen 0,5 ml steriel water en vortex gedurende 30 seconden om de cellen te lyseren. Bereid seriële verdunningen in water en plaat op BHI / L + G.
   Opmerking: De in dit stadium verzamelde cellen ook cellen van Patches onderliggende Peyer's bevatten. Desgewenst kan het zichtbare Peyer'sPatches kunnen uit het darmweefsel worden verwijderd voorafgaand aan het spoelen en snijden lengterichting.

9.3 Isolatie van bacteriën in de lamina propria (LP) Fraction

1. Spoel de overtollige DTT / EDTA van de intestinale stukken door het toevoegen van 25 ml steriele PBS aan de buis. Schud krachtig, te zetten in een nieuwe buis en herhaal twee keer.
2. Breng de intestinale stukken aan een 50 ml buis met 4 ml digestie oplossing bestaande uit RP-5 aangevuld met 1 mg / ml collagenase type IV en 40 ug / ml DNAse I. Incubeer onder schudden bij 37 ° C gedurende 40 minuten.
3. Breng de onverteerde stukjes in een nieuwe buis met 4 ml spijsvertering oplossing en herhaal een of twee keer totdat het weefsel stukken volledig zijn verteerd. Sla elk van de spijsvertering oplossingen die bevrijd LP cellen bevatten, bij 37 ° C.
4. Centrifugeer de samengevoegde digestie oplossingen bij lage snelheid (1200 x g) om de cellen te pelleteren. Verwerk de bovenstaande vloeistof en cel pellet afzonderlijk als descrhierboven ibed op te noemen extracellulaire en intracellulaire bacteriën, respectievelijk.

Representative Results

L. monocytogenes kolonies zichtbaar op BHI / L + G platen na 36-48 uur incubatie bij 37 ° C. De kolonies hebben een gladde, koepelvormige romig wit uiterlijk (figuur 1A). De groei wordt geremd voor de meerderheid van de darmflora, maar het is gebruikelijk om enkele kolonies die geen L. bekijken monocytogenes, vooral wanneer plating dunne darm of dikke direct zonder significante verdunning (Figuur 1B). Verdachte kolonies kan worden bevestigd door plating op CHROMagar ^TM Listeria platen. L. monocytogenes verschijnen als blauwe kolonies omgeven door een witte halo op deze platen (figuur 1C). De detectielimiet voor L. monocytogenes in elk weefsel is afhankelijk van de hoeveelheid water om het weefsel te homogeniseren. De monstervolumes in tabel 1 geven de minimale hoeveelheid die nodig is om elk weefsel effectief verwerken. Homogenaten van milt, gAlle blaas, hersenen of darmweefsel gefractioneerd kunnen bij 4 ° C gedurende 1-2 dagen worden bewaard en opnieuw uitgeplaat indien nodig. Dikke darm, dunne darm of leverhomogenaten kunnen sommige L. remmen groei monocytogenes tenzij voldoende verdund monster (figuur 1D) en deze homogenaten geen vergelijkbare CFU tellingen eventu-plated opbrengst na opslag bij 4 ° C.

We toonden eerder aan dat BALB / c / Door / J (BALB) muizen waren significant gevoeliger voor voedsel overgedragen listeriose dan C57BL / 6 (B6) muizen ^16. Een inoculum van 10 ⁷ CFU volstaat darminfectie vestigen in BALB muizen, maar tenminste 10 ⁸ CFU nodig om het maagdarmkanaal van B6 muizen (figuur 2) koloniseren. Zoals getoond in figuur 2, zal het aantal bacteriën in de darmen, milt, lever en galblaas evenredig aan de dosering om een aan de muizen. Voorlopige studies suggereren dat 5 x 10 ⁹ CFU isde benaderende LD ₅₀ voor BALB / c / Door / J muizen met dit model ^16.

Figuur 1. Representatieve kolonie groei op selectieve agar platen. A) L. monocytogenes kolonies na 48 uur groei op BHI / L + G-agar. B) BHI / L + G agar remt de groei van de meeste darmflora, maar sommige niet-Listeria kolonies (pijl) kan worden waargenomen bij lage verdunningen. De agarplaat hier bevat 100 ul van een 10 ^-1 verdunning op de helft van de plaat, en 50 pi van elk van de 10 ^-2 en ^-3 10 verdunningen van een dubbele homogenaat. C) L. monocytogenes kolonies kan worden bevestigd door de groei op CHROM agar Listeria platen. L. monocytogenes verschijnen blauw met een witte stralenkrans rondom de kolonie. D) Het is niet ongewoon om te see een remming van L. monocytogenes groei, die in kolonies van verschillende grootte, in de laagste verdunning van hetzij darm of lever homogenaten platen op BHI / L + G agar.

Figuur 2. Dosis-respons van door voedsel overgedragen infecties in BALB / c / Door / J en C57BL / 6 muizen. Vrouw BALB / c / Door / J (BALB) en C57BL / 6 (B6) muizen werden geïnfecteerd met 10 ⁹ (n = 7), 10 ⁸ (n = 8), 10 ⁷ (n = 6) en 10 ⁶ (n = 4) Lm ing ^m en het aantal CFU in elk weefsel werd bepaald 5 dpi. Gemiddelde waarden + / - SD getoond. Gegevens uit twee verschillende experimenten geanalyseerd. Stippellijnen geven de detectiegrens in elk orgaan.

Weefsel	Volume monster (ml) een	Detectielimiet (CFU)
Dunne darm	2.0	50
Blindedarm	2.0	50
Dikke darm	2.0	50
Mesenteriale lymfeklieren	1.5	15
Milt	2.5	50
Lever	2.5	50
Galblaas	0.5	10
Hersenen	1.5	15

Tabel 1. Detectielimiet voor L. monocytogenes in weefselhomogenaten. ^een gemiddelde totale steekproef volume bestaande uit steriel water plus het gehomogeniseerd weefsel.

Discussion

Inteeltmuizen zijn niet uniform ontvankelijk voor het voeden op alle momenten van de dag, en hun bereidheid om de verontreinigde brood eet zal afhangen van zowel het type stam en de leeftijd van de muizen ^17. In onze ervaring, 6-9 weken oude B6 muizen zijn ontvankelijk voor het voeden op elk moment van de dag, maar BALB muizen zal niet consequent eten het brood stuk, tenzij het wordt aangeboden tijdens hun donker-cyclus. Het licht cyclus van de ruimte gebruikt om de dieren te huisvesten kunnen worden veranderd zodat de donkere fase valt samen met de normale werkdag voor laboratoriumpersoneel. Echter, de muizen die ten minste twee weken voorafgaand aan infectie acclimatiseren gewijzigde lichtcyclus. Gedurende de infectie alleen rode lampen gebruikt worden in zowel de kamer zelf of in de laminaire stroming kap.

Bij het ​​ontwikkelen van dit model, werd brood gekozen als voedselbron te L. zenden monocytogenes grotendeels omdat brood is absorberend. Zo was het gemakkelijk om kleine stukjes te verzadigen met the bacterieel inoculum en ervoor te zorgen dat elke muis ingenomen dezelfde dosis. Echter kan dit model gemakkelijk worden aangepast aan andere voedselbronnen gebruikt. Inderdaad is dit de enige muis model dat kan worden gebruikt om het effect van voedsel samenstelling of opslag op bacteriële infectiviteit direct testen. L. monocytogenes kan gemakkelijk aan groei hoog zoutgehalte, lage pH of koude temperaturen ^1,2,18, maar het is niet bekend of deze groeiomstandigheden veranderen het vermogen van de bacteriën om darminfectie stellen.

Ongeveer 10 minuten is nodig om alle geïnfecteerde organen van een enkele muis oogsten. De galblaas is gemakkelijk gescheurd, dus het is best om deze eerst te verwijderen. De mesenteriale lymfeklieren zijn het gemakkelijkst te herkennen wanneer de darmen zijn niet gestoord, dus ze moeten vervolgens worden verwijderd. De darmen kunnen als een enkel weefsel worden geoogst door te snijden net onder de maag en net boven de appendix, en vervolgens gescheiden in duodenum, jejunum, ileum, blindedarm, colon en net vóór spoelen en homogeniseren. De milt en lever worden meestal verwijderd volgende, en de hersenen wordt geoogst na het ophalen organen van de buikholte, dat nodig is om de muis draaien om de schedel. Bij het werken met meerdere muizen, moeten alle weefsels worden bewaard op ijs tot verwerkt. Voor de meeste weefsels werd een agar plaat gebruikt om het totale aantal CFU in het weefsel aanwezig te bepalen. De plaat werd in drieën verdeeld, en 50-100 gl monster van drie verschillende verdunningen van het weefsel homogenaat werd uitgeplaat op elk derde.

De hier beschreven werkwijzen wordt het totale aantal L. identificeren monocytogenes in elke muis weefsel niet alleen de intracellulaire organismen. De unieke intracellulaire levensstijl van L. monocytogenes wordt verondersteld om een belangrijke virulentie factor tijdens infectie ^18,19 zijn. Echter, L. monocytogenes zijn facultatief, niet obligaat, intracellulaire pathogenen, en there geen definitieve gepubliceerde rapporten het percentage van Listeria die daadwerkelijk binnen cellen verblijven in vivo geven. De meeste eerdere studies met orale L. monocytogenes infectie aangevoerde gentamicine behandeling van darm weefsel om de groei van darmflora remmen. Voorbehandeling met gentamicine het potentieel extracellulaire L. elimineren monocytogenes, kunnen worden hersteld alleen de intracellulaire bacteriën, hoewel het niet duidelijk in hoeverre gentamicine kan geheel intestinale weefsels doordringen in vitro. De hier beschreven aanvullende protocol maakt voor de bepaling van zowel de extracellulaire en intracellulaire bacteriën in de slijmlaag, het epitheel en de lamina propria compartiment van geïnfecteerde darmweefsel. In deze procedure wordt gentamicine gebruikt om eencellige suspensies behandelen, zodat alle teruggewonnen bacteriën in cellen in het weefsel waren.

Driemaal wassen met NAC typisch reverplaatst de meeste slijm uit darmweefsel, en de samengevoegde wasvloeistoffen geen eukaryotische cellen (levensvatbaar of dood), zoals bepaald door trypan blauw kleuring bevatten. Extra wasbeurten gaf niet toe zichtbaar slijm zoals bepaald door Diff-Quik kleuring van cytospin dia voorbereidingen. De celeigenschappen van het EG-en LP-fracties kunnen ook worden bevestigd met behulp van Diff-Quik of Giemsa kleuring. De EC fractie moet uit hoofdzakelijk epitheelcellen, die gemakkelijk kan worden onderscheiden van het aantal intra-epitheliale lymfocyten aanwezig in het darmepitheel. De LP fractie meer divers, met een mengsel van mononucleaire cellen die samenstelling verandert na infectie bij inflammatoire monocyten infiltreren het weefsel.

Het voedseltoxi model van listeriose kan worden gebruikt met een grote verscheidenheid van L. monocytogenes isolaten, met inbegrip van de muis-aangepaste sture ^m-expressie stam ¹⁵ hier beschreven, wild type EDGE, en deletie mutant derivatives van deze stammen ^16. In een eerdere studie hebben we aangetoond dat het niveau van de darmflora niet significant verschillen tussen deze stammen echter isolaten die geen hoge affiniteit ligand tot expressie brachten voor murine E-cadherine hebben een geringe afwijking in de verspreiding van de mesenterische lymfeklieren en milt ^16. Evenzo kan elke muizenstam worden gebruikt voor infectie, waardoor dit een aantrekkelijk modelsysteem zowel bacteriële pathogenese en gastheer reacties op infectie te bestuderen. Tot slot, hoewel we nog niet dit direct getest, stellen wij voor dat de basis procedures die hier gebruikt wijd van toepassing op ander voedsel gedragen bacteriële pathogenen zoals Salmonella, Yersinia, Escherichia, Campylobacter en Citrobacter soort moet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brain Heart Infusion Agar	Difco	BD-241830
Lithium chloride	Sigma	L9650
Glycine	Omnipur	4840
EDTA	Gibco	15575-038
DTT	Sigma	D5545
Collagenase, type IV	Worthington	LS004089
DNAse I	Worthington	LS002007
Diff-Quik	Dade-Behring	B4132-1A
PowerGen 1000 homogenizer	Fisher	14-261-06
stainless steel type 304 mesh #80	Small Parts, Inc.	CX-0080-C
Cytospin	Statspin	M801-22