Summary
이 논문은 사용하는 마우스의 경구 감염에 대한 새로운 방법을 설명
Abstract
L. monocytogenes에 인간의 음식을 매개로 감염을 일으킬 통성 세포 내 세균성 병원균이다. 거의 밀접하게 인간의 질병을 모방 작은 동물 모델의 부족으로 인해 리스테리아 증의 위장 단계에 대한 알려져있다. 이 문서는 L.의 구두 전송을위한 새로운 마우스 모델을 설명 모노 사이토 제네스. 쥐 먹이 L.,이 모델을 사용하여 monocytogenes에 오염 된 빵 감염 (BALB / C / J으로 /) 또는 저항 (C57BL / 6) 마우스 종자의 전신 확산의 정도를 변화 뒤에 위장 감염의 이산 위상을 보유하고 있습니다. 감염의 나중 단계 동안, 담즙 방광과 뇌에 보급이 관찰된다. 리스테리아 증의 식품 매개 모델은 높은 재현성 전문 기술을 필요로하지 않으며, 세균 분리 및 실험실 마우스 종자의 다양한에서 사용할 수 있습니다. 따라서, 그것은 L.에 의해 사용되는 두 독성 전략을 연구하는 이상적인 모델입니다 monocytogenes에
Introduction
리스테리아는 인간의 음식을 매개로 감염을 일으킬 통성 세포 내 세균성 병원균이다. 박테리아는 염장 등 건조 우리의 식품 공급을 보호하는 데 사용되는 프로세스의 많은 저항, 또는 냉동 1,2 감염은 일반적으로 소비하기 전에 가열하지 않는 가공 "바로 먹을 수있는"음식에 연결되어 . L. 여러 이전 발생에서, 소스 monocytogenes에 오염 된 식품이 확인되었으며, 노출 된 개인의 제한된 그룹이 밀접하게 3-6 측정 하였다. 이러한 예에서, 그렇지 않으면 건강한 개인에있는 임상 질환은 가벼운 자기 제한 위장관에서 더 심한 장과 전신 감염이 필요한 입원. L.로 변화 신생아와 노인을 포함하여 면역 손상 개인에 monocytogenes의 감염 심지어 항생제 치료와 함께, 높은 사망률 (25-30%)과 관련되어있다
리스테리아 증의 가장 널리 사용되는 모델 쥐의 정맥 주사 (IV) 예방 접종이다. IV 모델은 높은 재현성, 그리고 감염 9,10 동안 순진와 메모리 T 세포 반응을 연구에 매우 유용했습니다. IV 모델의 단점은 완전히 감염의 창자 단계를 무시한다는 것입니다. 음식을 매개로 전송 한 후, 창자 점막은 아마도 느려지고 지속적으로 말초 조직에 배포 할 수 있습니다 박테리아의 수를 제한하는 장벽을 제공합니다. 대조적으로, 전체 접종은 정맥 투여 분 이내에 비장과 간에서 찾을 수 있습니다, 그리고 생물이 큰 알약은 타고난 면역 D를 압도 할 수 있습니다이러한 조직에서 efenses. 많은 양 (10 9 -10 11 CFU)는 일반적으로 장내 정착이 10을 달성하기 위해 필요하기 때문에 위관 쥐의 구강 감염은 일반적으로는 그다지 사용됩니다. 또한, 먹이 바늘 위내 (IG) 접종 전신 확산에 앞서 위장 감염의 재현 기간을 생성하지 않습니다. 일부 실험실은 L.보고있다 다른 사람이 48 HPI 11-15까지 더 체계적 확산을 보여 주었다 동안 monocytogenes는이 4-12 시간 후 감염 (HPI)에서 비장과 간을 도달합니다. 이 실험실 간 변동은 식도의 안감에 약간의 외상을 초래할 수있는 IG 접종의 침략 자연의 결과, 그리고 박테리아의 직접 혈류의 침략을 촉진 할 수 있습니다.
우리는 최근 경구 L.의 새로운 마우스 모델을 개발 밀접하게 인간의 질병 16의 모든 단계를 모방 monocytogenes의 감염. 마우스가 연속 조각을 섭취 할 때 감염이 발생식품, 비 외상성 인 과정을, 민화 및 실험실 연구자에 의해 전문 기술을 필요로하지 않습니다. 시간의 이산 시간 (36-48 시간)의 경우, L. 모노 사이토 제네스는 재현성 따라서 창자 점막을 통해시키다 및 주변 조직에 배포하는 리스테리아 병원균에 의해 사용되는 메커니즘의 조사를 허용, 오직 위장관 식민지. 중요한 모델이 감염 호스트 타고난 저항의 차이를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 이전의 연구에서, 우리는 BALB / C / J 마우스에 의해 /는 L.의 지수 복제, 식품 매개 리스테리아 증에 매우 민감한 것으로 나타났다 창자, 비장, 간 및 담즙 방광 16에서 발생 monocytogenes에. 대조적으로, C57BL / 6 마우스 L. 만 과도 식민지로, 식품 매개 감염에 저항 하였다 monocytogenes는이 조직의 각각에서 발생. 밀접하게 인간의 질병을 모방 식품 매개 모델의 추가 기능은 자연의 보급이다뇌 감염의 나중 단계 (5-7 dpi로) 동안 발생합니다.
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Protocol
1. 선택적 한천 매체의 준비 (BHI / L + G)은 장내 미생물을 억제하는
- 26g 뇌 심장 주입 한천 (Difco), 7.5 g하여 LiCl 5.0 g 글리신과 1 리터 플라스크에 자리를 무게. 탈 이온수 500 ML을 추가합니다.
- 자석 교반기에 열 한천 종기까지 계속 저어. 열 떨어져 플라스크를 가지고, 거품 간단히 해결하자 후 다시 종기로 가져옵니다.
- . 액체 사이클 16-19 PSI에 따라 121에서 30 분간 ° C를위한 오토 클레이브 참고 : 플라스크에 교반 막대를 둡니다.
- ° C의 물을 욕조에 55 미디어 평형 또는 RT로 냉각 할 수 있습니다. 솔루션 ° C 또는 결정이 한천의 형성 55보다 쿨러 얻을 수 없습니다. 결정은 L.을 억제하지 않습니다 monocytogenes의 성장 또는 미디어의 선택 속성에 영향을 미칩니다. 그러나 결정은 작은 식민지 모양이 유사하고 어려운 박테리아 CFU를 계산하게됩니다.
- 부드럽게 혼합자석 교반기를 사용하여 1 분 한천. 공기 거품의 형성을 피할 것. 페트리 접시 (~ 25 ML / 플레이트)에 한천을 부어.
참고 :이 매체는 모든 L.의 성장을 지원하지 않습니다 monocytogenes를 긴장. 예를 들어, L. 모노 사이토 제네스의 가장자리는은 36-48 시간 내에 표시 식민지로,이 배지에서 잘 성장하지만, 10403s이 매체에 성장하지 않습니다.
2. 접종의 준비
- 작은에 얇게 썬된 빵 (크로 거)을 잘라 (2 ~ 3 ㎜) 멸균 가위 ORA 멸균 메스 블레이드를 사용하여 큐브. 껍질을 사용하지 마십시오. 감염의 날까지 -20 ° C에서의 microcentrifuge 튜브에 각각의 조각을 저장합니다.
- 멸균 메스를 사용하여, 소금 버터 (Kroger에서) 작은 (0.5 cm) 덩어리를 잘라 살균 microcentrifuge 관에 각각 배치합니다. 60 빵 조각 - 각 관은 50을 준비하기에 충분한 버터를 포함합니다. -20 ° C에서 보관 필요할 때까지.
- L. 성장 BHI 국물의 monocytogenes는 & 30에 떨고DEG, 문화가 ~ 0.8-1.0의 OD 600에 도달 할 때까지 C. 샘플 자주 그래서 튜브의 박테리아의 동일한 숫자를 포함 소용돌이에 관심을 가지고,의 microcentrifuge 튜브에 500 μL의 aliquots을 준비합니다. -80에서 보관 ° C.
- , 세균 분주을 역가 얼음에 튜브를 해동 후 500 ㎕의 9.5 ML BHI 국물에 추가하십시오. 30에서 1.5 시간 서에 대한 품어 ° C. BHI 한천 플레이트에 시리얼 희석. . 균일 씩을 준비되어 있으면, 2 ~ 4 배의 분산과 유사한 방식으로 준비하면 튜브의 각이 역가를 얻을 것으로 예상 할 수있다 : ~ 1-5 × 10 8 CFU / ㎖ 주 역가를 기대합니다.
- 쥐를 감염, L.의 나누어지는을 준비 모노 사이토 제네스는 2.4 단계에서 설명했다. L. 전에 약 20 분 monocytogenes의 문화가 준비, RT에 빵 조각을 해동. 55 버터 나누어지는을 녹여 ° C와 55 ° C.에 PBS의 사전 따뜻한 작은 양 적어도 하나의 당 마우스가 충분히 그렇게 빵 조각을 준비한다감염과 실제 접종의 역가를 결정하기위한 적어도 하나의 여분의 조각 수 있습니다.
- 세균 나누어지는의 소정의 역가에 따라, L.의 총 부피를 계산 monocytogenes의 문화 빵 조각의 필요한 번호 접종을 준비하는 데 필요한. 10 분 동안 14,000 XG에서 원심 분리하여 펠렛 박테리아는 모든 BHI 국물을 기음과 미리 예열 PBS (2 μL / 빵 조각)의 작은 양의 박테리아를 resuspend을.
- 소용돌이 녹은 버터, 박테리아 (3 μL / 빵 조각에 해당하는 전체 볼륨을 사용)을 추가하고 잘 혼합 참고 :. 한 시간이나 버터를 공고히 할 것이다 개 이상의 10-15 빵 조각을 준비하지 마십시오.
- 신속 microcentrifuge 관에서 하나의 빵 조각 위에 세균 현탁액의 피펫 5 μl를 작동합니다. 이 솔루션은 완전히 빵 조각에 의해 흡수되어야한다.
- 접종의 실제 역가를 결정하기 위해, 빵 piec를 중 하나에 1 ML 멸균 PBS를 추가에스. 1 분간 격렬하게 소용돌이. 직렬 희석 및 플레이트 BHI 및 BHI / L 양 + G 한천을 준비합니다.
- 높은 역가 (> 10 9 CFU) 접종에 대한 대체 절차. 박테리아 펠릿이 너무 큰 경우에는 작은 양에 중단하기 어려울 수 있으며, 그 결과 물질은 풀처럼 점성이 있으며, 접종 중 일부는 microcentrifuge 관의 측면에 붙어 있습니다. 이 경우에는 멸균 60mm 배양 접시에 빵을 접종하고, (아래) 마우스 전체 요리 (뚜껑 없음)을 제공하는 것이 좋습니다. 빵에 흡수되지 않은 여분의 접종은 다음 마우스로 직접 먹을 수 있습니다. 매우 높은 역가 접종을 처리 할 때 일반적으로, 그것은 빵의 모든 음식과 아래에 설명 된 표준 프로토콜보다 깨끗한 접시를 핥아하는 마우스를위한 오래 걸립니다 때문에, 이것은 단지 방법입니다.
3. 쥐의 감염
- 여성 BALB / C / J (재고 # 0010026) 및 C57BL/6/J으로 / (주식 매입# 000644) 잭슨 연구소 (바 하버, ME)에서 나이 6-9 주에 사용합니다.
- 빠른 음식을 제거하고 제기 (1 인치) 와이어 바닥 (3 위 메시, 앨런 타운)에 마우스를 배치하여 감염 이전에 마우스 ONE DAY (24 시간) coprophagy 방지합니다. 만 충분히 소변을 흡수하는 케이지 침구,하지만 창고 대변을 상승하는 것만으로는 충분하지 둡니다. 물에 무제한 액세스 할 수 있습니다.
- 붉은 빛 전구 장착 된 층류 후드에서 작업, 어두운주기의 발병 쥐를 감염. 빈 (무 침구) 케이지에 하나의 마우스를 전송합니다. 멸균 포셉 사용하여 빈 새장 바닥에 오염 된 빵 조각을 전송합니다. 일반적으로, 마우스는 빵 조각을 데리러와 2-10 분 내에 완전히 그것을 소비한다. 마우스가 바로 빵을 먹지 않으면 20 ~ 30 분 동안 그대로 마우스를 랙 떠나 새장을 반환합니다. 동물의 대부분이 시간 내에 빵을 먹을 것이다, 그러나, 마우스는 구약에 액세스하지 않고, 그대로 남아있을 수 있습니다최대 2 시간에 대한 그녀의 음식 또는 물.
- 감염 후, 원래 케이지에 마우스를 반환하고 마우스 우를 보충. 실험 기간 동안 제기 와이어 바닥에 쥐를 집에 계속.
4. 박테리아의 수준을 모니터링 대변의 뿌리
- 라벨과 미리 무게의 microcentrifuge 튜브는 배설물의 수집에 사용할 수 있습니다.
- 마우스 케이지를 검색 한 후 빠르게 작업, 500 ML 플라스틱 비커에 각각 마우스를 놓습니다. 일반적으로 마우스는 5 분에서 1-4 대변 알약을 추방 할 것이다.
- 적절하게 레이블이 지정된 튜브에 대변을 전송하는 멸균 집게를 사용합니다.
- 각 튜브의 무게를 측정하고 빈 튜브의 무게를 빼서 대변의 무게를 계산합니다. 찌끼 펠릿에 대한 일반적인 무게는 10 ~ 30 밀리그램의 범위.
- 각 튜브 (200 μl/30 MG 대변)에 PBS를 추가하고 매시 배설물 펠렛에 멸균 이쑤시개를 사용합니다.
- 30 초 동안 소용돌이 관에는, 관마다 다음 BHI / L의 직렬 희석 및 플레이트를 준비+ G 한천. 콜로니의 수를 계산하고 CFU / MG 대변을 계산합니다.
5. 감염 창자 조직의 처리
- 쥐를 안락사, 무균 하나의 조직으로 각 마우스에서 위장을 수확 빈 100mm 배양 접시에 수집합니다.
- 소장, 맹장, 얼음에 저장되어 별도의 60mm 요리에 콜론과 장소를 구분합니다. 작은 창자는 더욱 십이지장, 공장 및 내강 내용의 제거를 용이하게하기 위해 회장에 가깝게 개의 동일한 조각으로 길이로 나눌 수 있습니다. 조직 3는 다음 중 하나를 함께 처리 (전체 소장 당 CFU) 또는 분리 할 수 있습니다. ~ 0.5 ML 멸균 PBS에 젖은 조직은 유연을 유지하고 처리하는 동안 눈물을 방지합니다.
- 8 ML 멸균 PBS로 10 ML의 주사기를 입력하고 25g 바늘을 연결합니다. 폐기물 비커 (또는 멸균 50 ML 튜브 내강 박테리아를 수집하는 경우)에 내강 내용을 짜 살균 집게를 사용합니다. Flus조직의 한쪽 끝을 통해 H 4 ML PBS는 내용을 짜내 집게를 사용하고 다른 쪽 끝에서 조직을 뒤집어 반복합니다.
- 내강 내용에 리스테리아의 수를 정량화하기 위해, 0.5 펠렛을 일시 중지 12,000 XG에서 20 분 풀 플러시 원심 분리기 - 1.0 ML 멸균 물을.
- 리스테리아 세포 관련 금액의 총 수를 정량화하기 위해 작은 조각으로 조직을 슬라이스 여러 측면 컷을 한 후 멸균 메스 칼날 길이 방향으로 절단하여 각 세척 티슈를 열고 주 :.이 단계를 확인하는 것이 필수적입니다 장 조직 균질 블레이드 주위에 래핑하지 않습니다. 2 ㎖ 멸균 물을 포함하는 15 ML의 원심 분리기 튜브 장의 조각을 전송합니다.
- 30 초 동안 60 %의 전력에서 70 % 에탄올에 프로브를 삽입하여 조직을 균질화 (피셔 발전기 구매 1000) 소독. 10 초 동안 멸균 물에서 공기 건조에 에탄올, 또는 프로세스를 기다립니다. 각 TI를 균질화1 분 ssue. 각 샘플 사이의 멸균 치료를 반복 샘플 그룹 사이에 70 % 에탄올을 사용합니다.
- 멸균 물과 BHI / L + G 한천 플레이트에 각 시료의 연속 희석을 준비합니다.
6. 감염된 장간막 림프절의 처리
- 수확 림프 무균 노드, 얼음 멸균 60mm 접시에 장소 및 연결된 모든 지방을 제거하는 살균 집게를 사용합니다. 마우스 당 3-6 노드를 찾을 것으로 기대합니다.
- 스테인레스 스틸 # 80 메쉬의 1.5 인치의 정사각형 조각을 절단하여 와이어 메쉬 화면을 준비합니다. 각 모서리에 작은 상처를 만들고, 제기 침대를 만드는 네면을 아래로 접습니다. 825 ML 멸균 물을 포함하는 60mm 페트리 접시에 95 % 에탄올 후 소독 화염, 장소에 담근다. 각 사용 후, 화면은 20 분 동안 70 % 에탄올에 몸을 담글 포함 된 조직을 제거하는 브러시로 닦고, 2N NaOH를 20 ~ 30 분간 비등하고 물을 광범위하게 세척하여 재활용 할 수 있습니다.
- 플런저를 사용메쉬 스크린을 통해 멸균 3 ML의 주사기에서 매시에 노드. 이 접시에 물과 접촉하게 그래서 접시의 바닥에 화면을 아래로 밀어해야합니다.
- 화면을 통해 825 ML 멸균 물을 통과하고 다음 화면을 씻어 여러 번 위아래로 피펫. microcentrifuge 관에 세포 현탁액을 전송합니다.
- 소용돌이는 각 샘플은 적극적으로 30 초 동안 세포를 용해합니다. 하나 BHI / L + G 한천에 시리얼 희석, 접시를 준비합니다.
7. 감염된 비장, 간과, 및 담즙 방광의 처리
- 멸균 집게로 비장을 잡고 두 컷, 각 끝을함으로써 해방 시키자. 2.5 ML 멸균 물을 포함하는 15 ML 튜브에 넣습니다. (참고 : 둥근 바닥을 가진 튜브 균질화와 함께 사용하기 쉬운 수 있습니다.)
- 담즙 방광 (간장에 부착 된 작은 노란색 유체 가득한 골목) 및 파열하지 않고 간에서 분리하는 멸균 가위로 조심스럽게 싹둑를 찾습니다. TRANSF1 ML 멸균 물을 포함하는 microcentrifuge 관에 어.
- 무균, 간을 모두 제거 엽 (叶)을 확실하게 제거 및 멸균 2.5 ML을 포함하는 15 ML의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 로 60 %의 전원을 30 초 동안 위에서 설명한 비장과 간을 균질화. Forgall 방광은 30 초 동안 격렬하게 소용돌이 후 microcentrifuge 관에서 떨어져 찢어 멸균 가위를 사용합니다.
- 직렬 희석 및 BHI 또는 BHI / L 두 접시 각 샘플 + G 한천을 준비합니다.
8. 감염된 뇌의 처리
- 마우스의 뒷면에서 작업, 45 ° 각도로 목 위의 피부와 조직을 잘라, 두 귀를 통해. 코쪽으로 잡아 당겨 피부의 U 자형 플랩 벗겨에 멸균 집게를 사용하여 두개골과 얼굴 뼈를 노출합니다.
- 집게와 눈 사이 뼈 능선을 잡고 두개골을 고정화하고, 두개골의 측면 가장자리에 걸쳐 얕은 상처를 만들기 위해 가위를 사용합니다. 있다단지 뼈가 아닌 뇌 조직을 잘라 조심. 다음으로, 눈 사이 뼈 능선을 잘라. 뇌를 노출 (목 쪽) 두개골의 상단을 잡고 뒤로 당겨 집게를 사용합니다.
- 천천히 1.5 ML 멸균 물을 포함하는 15 ML의 원심 관에 멸균 포셉과 장소를 사용하여 구멍에서 머리를 들어 올립니다.
- 위에서 설명한대로 60 %의 전원을 20 초 동안 균질화. BHI 또는 BHI / L + G 한천 하나의 직렬 희석 및 판을 준비합니다.
9. 보충 절차 : 창자 조직의 분별
점액 분수에있는 박테리아의 9.1 절연
- 각 장 조직의 경우, 6 개 mm N-아세틸 시스테인 (; 시그마 # A-9165 NAC) 3 ㎖를 포함하는 3 튜브를 준비합니다.
- 플러시를 배치하고 세로 방향으로 적극적으로 모든 20 ~ 30 초 소용돌이, 1-2 분 동안 첫 번째 튜브에 조직을 잘라. 멸균 집게를 사용하여 조직을 선택하고 부드럽게 초과 액체 비누를 제거하기 위해 튜브의 한쪽에 짜ID입니다.
- 나머지 NAC 튜브를 사용하여 두 번 더 단계 9.1.2를 반복합니다. 장 조직을 제거하고 추가 처리를 위해 따로 설정할 수 있습니다.
- 수영장 NAC (9 ML 총) 씻어, 12,000 X g에서 20 분 원심 분리기.
- 30 초 동안 멸균, 소용돌이 펠렛을 resuspend을, BHI / L + G.에 연속 희석, 접시를 준비
상피 세포 (EC) 분수에있는 박테리아의 9.2 절연
- 5 % FBS (RP-5), 5 mM의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 1 MM의 DTT로 보충 RPMI 5 mL를 (Invitrogen 사 # 21870)를 포함하는 50 ML 튜브에 멸균 가위와 장소 작은 조각으로 각 조직을 잘라. ° C 20 분 동안 37 ℃에서 흔들어 품어.
- 5 ML의 RP5/EDTA/DTT을 포함하는 새로운 튜브에 장 조각을 전송하고 37 흔들어 ° C를 20 분 동안 품어. 첫 번째 튜브에서 미디어를 저장하고 37 곁에 ° C.를 RP5/EDTA/DTT 세 20 분에서 incubate 총 한번 더이 과정을 반복합니다. 얇은 판의 propria ISO로 진행하는 경우lation 단계는 빈 50 ML 튜브에 남아있는 장내 조각을 전송합니다.
- 세 RP5/EDTA/DTT 세척 (15 ML의 총 부피) 및 펠렛 세포에 저속 (1,200 XG)에서 원심 분리기를 결합합니다.
- 세포 박테리아를 정량화하기 위해 12,000 X g에서 20 분간 뜨는 원심 분리기를 수집합니다. 0.5 펠렛을 resuspend을 - BHI / L에서 1.0 ML 멸균 물 플레이트 시리얼 희석 + G 한천입니다.
- 세포 내 박테리아를 열거하려면, 25 ㎍ / ㎖의 겐타 마이신을 포함하는 RP-5 5ml에 EC 펠렛을 resuspend을. 37 30 분 동안 단일 세포 현탁액을 품어 ° C 플러스 7 % 죽일 수있는 CO 2 남아있는 세포 L. 모노 사이토 제네스. 세포를 용해하기 위해 30 초 동안 0.5 ML 멸균 물과 소용돌이에 일시 중지, PBS로 두 번 세포를 씻으십시오. BHI / L + G.에 물과 플레이트에 시리얼 희석을 준비
참고 :이 단계에서 수집 된 세포는 기본 Peyer의 패치의 세포도 포함됩니다. 원하는 경우, 눈에 보이는 Peyer이다패치는 세척 및 길이 방향으로 절단하기 전에 장 조직에서 제거 할 수 있습니다.
얇은 판의 propria (LP) 분수에있는 박테리아의 9.3 절연
- 튜브에 25 ML 멸균 PBS를 추가하여 장 조각에서 초과 DTT / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 씻어. 힘차게 흔들어 새로운 튜브로 전송하고 두 번 반복합니다.
- 40 분 동안 37 ° C에서 동요 1 MG / ML 유형 IV 콜라, 40 ㎍ / ㎖ DNase의 I. 부화로 보충 RP-5로 구성된 소화 용액 4 mL를 포함하는 50 ML 튜브에 장 조각을 전송합니다.
- 4 ML 소화 솔루션을 포함하는 새로운 튜브에 소화되지 않은 조각을 전송하고 조직 조각이 완전히 소화 될 때까지 한 번 또는 두 번 반복합니다. 37 해방 LP 세포를 포함하는 소화 솔루션의 각 ° C.에 저장
- 펠렛 세포에 저속 (1,200 XG)에서 합동 소화 솔루션을 원심 분리기. DESCR로 뜨는 세포 펠렛 별도로 처리각각 세포 및 세포 내 박테리아를 열거 위의 IBED.
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Representative Results
L. monocytogenes에 식민지는 37 ℃에서 36-48 시간 배양 한 후 BHI / L + G 플레이트에서 볼 수 식민지 부드러운 돔 모양의 크림색 외관 (그림 1A)가 있습니다. 성장은 장내 미생물의 대부분을 억제하지만, L.없는 일부 식민지를 참조하는 것이 일반적입니다 수 monocytogenes에 직접 중요한 희석 (그림 1B)없이 소장이나 대장 도금 특히. 의심 식민지 ChromAgar TM 리스테리아 판에 도금하여 확인할 수 있습니다. L.는 파란색 식민지가이 판에 흰색 후광 (그림 1C)로 둘러싸인 monocytogenes가 나타납니다. L.에 대한 검출 한계 각 조직의 monocytogenes는 조직을 균질화하는 데 사용되는 물의 양에 따라 달라집니다. 표 1에 표시된 샘플 볼륨을 효과적으로 각각의 조직을 처리하는 데 필요한 최소한의 양을 나타냅니다. 비장의 균질, G모든 방광, 뇌, 또는 분별 장 조직은 1-2 일 동안 4 ° C에 보관하고 필요한 경우 재 도금 될 수있다. 대장, 소장, 간 균질 어떤 L.를 억제 할 수 monocytogenes의 성장은 샘플 않으면 (그림 1D) 충분히 희석하고,이 균질 4 ° C.에 저장 한 후 유사한 CFU 카운트 재 도금 경우를 양보하지 않는다
우리는 이전 BALB / C / J (BALB) 쥐에 의하여 /는 C57BL / 6 (B6) 쥐 16보다 식품 매개 리스테리아 증에 훨씬 더 민감 것으로 나타났다. 10 7 CFU의 접종은 BALB 생쥐의 장내 감염을 확립하기에 충분하지만, 최소한 10 8 CFU은 B6 생쥐 (그림 2)의 위장관을 식민지화하는 데 필요합니다. 그림 2에서 보는 바와 같이, 내장, 비장, 간 및 담즙 방광에있는 세균 부하는 생쥐에게 주어진 도전 선량에 비례합니다. 예비 연구는 5 × 10 9 CFU는 것이 좋습니다BALB / C 모델 16를 사용하여 / J 생쥐으로 /에 대한 대략적인 LD 50.
그림 1. 선택적 한천 플레이트에 대표적인 식민지의 성장.) L. monocytogenes에 식민지 BHI / L에서 48 시간 성장 + G 한천 후. B) BHI / L + G 한천은 대부분 장내 미생물의 성장을 억제하지만, 일부 비 리스테리아 식민지 (화살표)가 낮은 희석 관찰 할 수 있습니다. 여기에 표시된 한천 플레이트) 100 플레이트의 절반에 10 -1 희석 μL, 50 대장 균질의 10 -2, 10 -3 희석 각 μL. C를 포함 L. monocytogenes의 식민지가 CHROM 한천 리스테리아 플레이트에 성장 확인할 수 있습니다. L.는 monocytogenes에이 식민지를 둘러싼 흰색 후광 파란 나타납니다. D)는 s의 드문 일이 아니다전자 L.의 억제 BHI / L + G 한천의 장 또는 간 균질화 플레이트 하나의 가장 낮은 희석 다양한 크기의 식민지의 결과 monocytogenes의 성장.
그림 2. BALB / C / J와 C57BL / 6 마우스에 의해 /. 여성 BALB / C / J (BALB)와 C57BL / 6 (B6) 생쥐으로 /에서 식품 매개 감염의 용량 반응은, 10 9 (n은 = 7)에 감염되었다 10 8 (n은 = 8), 10 7 (n = 6) 10 6 (n = 4) Lm을 InlA m와 각 조직에서 CFU 수가 5 dpi로 결정 하였다. SD 표시됩니다 - + /이 값을 의미합니다. 두 가지 실험에서 풀링 된 데이터를 분석 하였다. 점선은 각 기관의 검출 한계를 나타냅니다.
| 조직 | 샘플 볼륨 (ML) | 검출 한계 (CFU) |
| 소장 | 2.0 | 50 |
| 맹장 | 2.0 | 50 |
| 결장 | 2.0 | 50 |
| 장간막 림프절 | 1.5 | 15 |
| 비장 | 2.5 | 50 |
| 간 | 2.5 | 50 |
| 담즙 방광 | 0.5 | 10 |
| 뇌 | 1.5 | 15 |
표 1. L에 대한 검색으로 제한 할 수 있습니다. 조직 균질 monocytogenes를. 멸균 플러스 균질 조직으로 구성된 평균 총 시료량.
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Discussion
근친 마우스는 하루의 모든 시간에 먹이를 균일하게 수용하지 않습니다, 그리고 오염 된 빵을 먹는 의지는 두 균주의 종류와 생쥐 17 세의 나이에 따라 달라집니다. 우리의 경험에서 6-9 주 이전 B6 생쥐는 하루 중 어느 시간에 먹이를 수용하지만, 그것은 자신의 어두운주기 동안 제공되지 않는 한 BALB 마우스는 일관되게 빵 조각을 먹을 수 없습니다. 어두운 단계가 실험실 직원에 대한 일반 작업을 하루 일치하도록 동물을 수용하는 데 사용되는 공간의 빛을주기 변경 될 수 있습니다. 그러나 마우스는 이전의 감염에 변경된 빛을주기에 적응하기 위해 적어도 2 주 주어져야한다. 감염 동안에 만 빨간색 램프는 어느 방 자체 또는 층류 후드에 사용되어야한다.
이 모델을 개발, 빵 L.를 전송하는 음식 소스로 선택되었다 빵 흡수성 때문에 크게 monocytogenes를. 따라서, 일에 작은 조각을 포화 쉽게전자 세균 접종하고 각 마우스가 동일한 복용량을 섭취 있는지 확인합니다. 그러나,이 모델은 쉽게 다른 음식 소스를 사용하여 적용 할 수 있습니다. 실제로이 직접 세균 감염에 식품 성분이나 저장 조건의 영향을 테스트하는 데 사용할 수있는 유일한 마우스 모델입니다. L.는 monocytogenes는 쉽게 높은 소금, 낮은 pH 또는 낮은 온도 1,2,18의 성장에 적응할 수 있지만 이러한 성장 조건 장내 감염을 설정하는 박테리아의 기능을 변경할 경우는 알려져 있지 않다.
약 10 분을 하나의 마우스에서 감염된 장기를 모두 수확하는 데 필요합니다. 담즙 방광은 쉽게 파열, 그래서 먼저 제거하는 것이 가장 좋습니다. 장간막 림프절 창자 방해가되지 않은 경우 발견하기 쉬운, 그래서 그들은 다음 제거해야합니다. 내장은 바로 위 아래에 그냥 부록 위에 절단하여 하나의 조직으로 수확하고 ILEU, 공장, 십이지장으로 분리 될 수있다M, 맹장, 결장은 사전 세척 및 균질화한다. 비장과 간은 일반적으로 다음 제거하고, 뇌가 두개골에 액세스하려면 마우스를 뒤집은하기 위해 필요한, 복강의 장기를 검색 한 후 수확하고 있습니다. 처리 될 때까지 여러 마우스로 작업 할 때, 모든 조직은 얼음에 보관해야합니다. 대부분의 조직의 경우, 하나의 한천 배지는 조직에서 CFU 존재의 총 수를 결정하는 데 사용되었다. 플레이트는 분의로 분할되고, 조직 균질의 세 가지 별도의 희석 50-100 μL 샘플은 각 제에 도금되었다.
여기에 설명 된 방법은 L.의 총 개수를 확인합니다 각 마우스 조직에서 monocytogenes를, 세포 생물뿐만 아니라. L.의 독특한 세포 라이프 스타일 모노 사이토 제네스는 감염 18,19 중에 키 독성 결정이 될 것으로 생각됩니다. 그러나 L. 모노 사이토 제네스는 통성, 의무 아니라 세포 내 병원균, 그리고 거기있다E는 실제로 생체 내에서 세포 내 존재하는 리스테리아의 비율을 나타내는 명확한 게시 된 보고서 없습니다. 구두 L.를 사용하는 대부분의 이전 연구 monocytogenes의 감염은 장내 미생물의 성장을 억제하기 위해 창자 조직의 겐타 마이신 치료에 의존. 겐타 마이신과 사전 치료는 세포 L.를 제거 할 수있는 잠재력을 가지고 monocytogenes에, 그것은 어느 정도의 겐타 마이신은 체외에서 전체 장 조직을 침투 할 수있는 무엇을 명확하지 않지만, 오직 세포 내 박테리아를 복구 할 수. 여기에 설명 보충 프로토콜은 점액 층의 상피 세포, 감염된 장 조직의 고유 층 격실에있는 세포와 세포 내 박테리아를 모두 측정 할 수 있습니다. 이 절차에서는 겐타 마이신은 모든 복구 박테리아가 조직 내에서 세포의 내부에 있다고 보장, 단일 세포 현탁액을 치료하는 데 사용됩니다.
NAC 세 세척은 일반적으로 재장 조직에서 점액의 대부분을 이동하고, 풀링 세척은 판 블루 염색에 의해 결정하는 진핵 세포 (가능한 또는 사망)가 포함되어 있지 않습니다. cytospin 슬라이드 준비의 비교 - QUIK 염색의 결정에 따라 추가 세척이 보이는 점액을 양보하지 않았다. EC 및 LP 분수의 세포질은 비교 - QUIK 또는 Giemsa 염색을 사용하여 확인할 수 있습니다. EC 분율은 쉽게 장내 상피 세포에 존재하는 몇 가지 상피내 림프구 구별 할 수 있습니다 주로 상피 세포로 구성해야합니다. LP 분율은 염증 단핵구는 조직을 침투 할 때 감염 후 구성을 변경하는 단핵 세포의 혼합물을 포함, 더 다양합니다.
리스테리아 증의 음식을 매개로 모델 L.의 다양한 함께 사용할 수 있습니다 등의 monocytogenes 균주, 마우스 적응 InlA M-발현 균주 15는 여기에서 야생형 EGDE 및 삭제 돌연변이 DERI 설명이러한 균주 16 vatives. 이전의 연구에서 우리는 장 식민지의 수준이 균주 사이에 크게 변화하지 않은 것으로 나타났다, 그러나, 쥐 E-cadherin의에 대해 높은 친 화성 리간드를 표현하지 않은 균주는 장간막 림프절 보급에 약간의 결함을했고 비장 16. 마찬가지로, 어떤 마우스 변형이 세균 병인 및 호스트 감염에 반응 모두를 연구하는 매력적인 모델 시스템 만들기 감염에 사용할 수 있습니다. 우리는 아직 직접 테스트하지 않았지만 마지막으로, 우리는 여기에 사용되는 기본 절차와 같은 살모넬라 균, 예 르시 니아, 대장균, 캄 필로 박터와 Citrobacter 종과 같은 다른 음식을 부담 세균성 병원체에 광범위하게 적용해야한다고 제안한다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다. 여기에 설명 된 모든 실험은 켄터키 대학의 ICAUC의 승인을 실험 동물 복지 (OLAW)의 사무실을 준수 하였다.
Acknowledgments
이 작품은 SEFD에게 수여 국립 보건원 (AI079442 및 AI091918)에서 교부금에 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Agar | Difco | BD-241830 | |
| Lithium chloride | Sigma | L9650 | |
| Glycine | Omnipur | 4840 | |
| EDTA | Gibco | 15575-038 | |
| DTT | Sigma | D5545 | |
| Collagenase, type IV | Worthington | LS004089 | |
| DNAse I | Worthington | LS002007 | |
| Diff-Quik | Dade-Behring | B4132-1A | |
| PowerGen 1000 homogenizer | Fisher | 14-261-06 | |
| stainless steel type 304 mesh #80 | Small Parts, Inc. | CX-0080-C | |
| Cytospin | Statspin | M801-22 |
References
- Becker, L. A., Evans, S. N., Hutkins, R. W., Benson, A. K. Role of sigmaB in adaptation of Listeria monocytogenes to growth at low temperature. Journal of Bacteriology. 182, 7083-7087 (2000).
- Neunlist, M. R., et al. Effect of salting and cold-smoking on the culturability, viability, and virulence of Listeria monocytogenes strain Scott A. Journal of Food Protection. 68, 85-91 (2005).
- Aureli, P., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes. N. Engl. J. Med. 342, 1236-1241 (2000).
- Dalton, C. B., et al. An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk. N. Engl. J. Med. 336, 100-105 (1997).
- Frye, D. M., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with delicatessen meat contaminated with Listeria monocytogenes. Clin. Infect. Dis. 35, 943-949 (2002).
- Salamina, G., et al. A foodborne outbreak of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes. Epidemiol. Infect. 117, 429-436 (1996).
- Mead, P. S., et al. Food-related illness and death in the United States. Emerging Infectious Diseases. 5, 607-625 (1999).
- Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: Clinical and experimental update. The Journal of Infectious Disease. 185, S18-S24 (2002).
- Condotta, S. A., Richer, M. J., Badovinac, V. P., Harty, J. T. Probing CD8 T cell responses with Listeria monocytogenes infection. Advances in Immunology. 113, 51-80 (2012).
- Disson, O., et al. Modeling human listeriosis in natural and genetically engineered animals. Nat Protoc. 4, 799-810 (2009).
- Czuprynski, C. J., Faith, N. G., Steinberg, H. A/J mice are susceptible and C57BL/6 mice are resistant to Listeria monocytogenes infection by intragastric inoculation. Infect. Immun. 71, 682-689 (2003).
- Gajendran, N., et al. Regional IFNgamma expression is insufficient for efficacious control of food-borne bacterial pathogens at the gut epithelial barrier. Int. Immunol. 19, 1075-1081 (2007).
- Lecuit, M., et al. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infect. Immun. 66, 747-755 (1998).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
- Ghanem, B. ou, N, E., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathogens. , Submitted for publication (2012).
- Kowal, M., Buda-Lewandowska, D., Plytycz, B., Styrna, J. Day/night food consumption in mice is strain and age-dependent. Folia Biol. (Krakow). 50, 1-3 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature reviews. Microbiology. 7, 623-628 (2009).
- Camejo, A., et al. The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle. Virulence. 2, 379-394 (2011).
