Summary
Эта статья описывает новый метод для перорального заражения мышей с использованием
Abstract
Л. моноцитогенес являются факультативными внутриклеточными бактериальными патогенами, которые вызывают пищевых инфекций у людей. Очень мало известно о желудочно-кишечного фаза листериоза из-за отсутствия небольшого модель животного, которое близко имитирует заболевания человека. Эта статья описывает новую модель мыши для устной передачи L. моноцитогенес. С помощью этой модели мышей, получавших L. моноцитогенес загрязненные хлеб есть дискретная фаза желудочно-кишечную инфекцию, а затем различной степенью системного распространения в восприимчивых (BALB / С / К / J) или устойчивостью (C57BL / 6) линий мышей. На поздних стадиях инфекции, распространения в желчном пузыре и мозга наблюдается. Пищевых модель листериоза является высокой воспроизводимостью, не требует специальных навыков и может быть использован с широким спектром бактериальных изолятов и лабораторные штаммы мыши. Как таковая, она является идеальной моделью для изучения как вирулентность стратегий, используемых L. моноцитогенес
Introduction
Листерий являются факультативными внутриклеточными бактериальными патогенами, которые вызывают пищевых инфекций у людей. Бактерии устойчивы к многим из процессов, используемых для защиты наших продуктов питания, таких как сушка, соление, или 1,2 холодильного и инфекции, как правило, связаны с обработана, "готовых к употреблению" продуктов, которые не нагреваются до потребления . В нескольких предыдущих вспышек, источником L. моноцитогенес-загрязненных продуктов питания был определен, и ограниченной группы лиц, подвергшихся воздействию была под пристальным контролем 3-6. В тех примерах, клинической картины заболевания у практически здоровых лиц варьировались от мягкого, самоограничения гастроэнтерита более тяжелые кишечные и системные инфекции, которые требуют госпитализации. L. моноцитогенес инфекций у лиц с ослабленным иммунитетом, в том числе и новорожденных и пожилых людей, которые были связаны с высокой смертностью (25-30%), даже при лечении антибиотиками
Наиболее широко используемой моделью листериоза внутривенно (IV) инокуляции мышей. IV модель является высокая воспроизводимость, и была чрезвычайно полезны для изучения как наивные и памяти Т-клеточного ответа при заражении 9,10. Недостатком модели IV является то, что он полностью обходит кишечной фазы инфекции. После пищевых передачи слизистой кишечника обеспечивает барьер, который предположительно замедляет и ограничивает количество бактерий, которые могут постоянно распространять в периферические ткани. В отличие от всей посевной могут быть найдены в селезенке и печени в течение нескольких минут внутривенного введения, и это большое болюс организмы могут подавлять врожденной иммунной гefenses в этих тканях. Оральные инфекции мышей через желудочный зонд менее широко используется, потому что большие дозы (10 9 -10 11 КОЕ), как правило, необходимых для достижения колонизации кишечника 10. Кроме того, внутрижелудочного (Ig) инокуляцию кормления игла не генерирует воспроизводимое период желудочно-кишечной инфекции до системное распространение. Некоторые лаборатории сообщили, что L. моноцитогенес достичь селезенки и печени в течение 4-12 ч после инфекции (HPI), тогда как другие не показали системного распространения до 48 HPI 11-15. Эта лаборатория-на-Lab изменения могут быть следствием инвазивный характер IG прививки, которые могут привести к незначительной травме слизистой пищевода, а также содействовать прямым вторжением кровоток бактерий.
Недавно мы разработали новую модель мыши оральный L. моноцитогенес инфекция, которая точно имитирует все этапы болезни человека 16. Заражение происходит, когда мыши глотать частей продолжениеаминировать питания, процесс, который не является травматическим, и не требует специальных навыков лабораторными исследователями. Для дискретного периода времени (36-48 часов), Л. моноцитогенес воспроизводимо только колонизировать желудочно-кишечном тракте, тем самым позволяя исследование механизмов, используемых патогенных листерий к транслокации через слизистой кишечника и распространять в периферические ткани. Важно отметить, что эта модель может быть использована для изучения различий в хост врожденной устойчивостью к инфекции. В предыдущем исследовании мы показали, что BALB / С / К / J мышей были очень восприимчивы к пищевого листериоза, с экспоненциальным репликации L. моноцитогенес, происходящих в кишечнике, селезенке, печени и желчного пузыря 16. В отличие от мышей C57BL / 6, были устойчивы к пищевой инфекции, только с переходным колонизации L. моноцитогенес возникающих в каждой из этих тканей. Дополнительной особенностью пищевых модель, которая точно имитирует болезнь человека в том, что природные распространениев мозг произошло во время более поздних стадиях инфекции (5-7 точек на дюйм).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка селективных средах агар (BHI / L + G) ингибировать кишечной микрофлоры
- Взвесить 26 г мозга сердечный экстракт агар (Difco), 7,5 г LiCl и 5,0 г глицина и место в 1-литровой колбе. Добавить 500 мл деионизированной воды.
- Тепло на магнитную мешалку, пока агар закипит, помешивая непрерывно. Возьмите колбу с огня, пускать пузыри урегулировать короткое время, а затем довести до кипения назад снова.
- . Автоклаве в течение 30 мин при 121 ° С в 16-19 фунтов на квадратный дюйм на жидком цикла Примечание: оставить мешалкой в колбе.
- Равновесие средствах массовой информации до 55 ° С на водяной бане или дать остыть при комнатной температуре. Не допускайте, чтобы решение, чтобы прохладнее, чем 55 ° C или кристаллы образуют в агара. Кристаллы не ингибируют L. моноцитогенес роста или повлиять на селективные свойства средств массовой информации. Тем не менее, кристаллы будут внешне похожи на небольшие колонии и будет трудно рассчитывать бактериальных КОЕ.
- Аккуратно перемешайтеагар в течение 1 мин с использованием магнитной мешалки. Избегайте образования пузырьков воздуха. Залить агар в чашки Петри (~ 25 мл / пластина).
Примечание: Эта среда не поддерживает рост всех L. моноцитогенес штаммов. Например, L. моноцитогенес EGDE хорошо растет на этом агар, с колониями видны в 36-48 часов, но 10403s не растут на этой информации.
2. Приготовление инокулята
- Вырезать нарезанный белый хлеб (Kroger) на мелкие (2-3 мм) в форме кубиков с использованием стерильных ножниц Ora стерильным скальпелем. Не используйте корок. Хранить отдельные части в микроцентрифужных пробирках при температуре от -20 ° C до дня инфекции.
- Используя стерильный скальпель, нарезать небольшими (0,5-1 см) куски соленого масла (Kroger) и поместите каждое в стерильную пробирку микроцентрифужные. Каждая трубка будет содержать достаточно масла, чтобы подготовить 50 - 60 штук хлеба. Хранить при температуре от -20 ° C до необходимости.
- Расти L. моноцитогенес в бульоне BHI встряхивании при 30 &град; С, пока культура не достигнет OD 600 ~ 0,8-1,0. Подготовьте 500 мкл аликвоты в микроцентрифужных пробирках, заботясь, чтобы вихрь образца часто так все трубы содержат одинаковое количество бактерий. Хранить при температуре -80 ° C.
- Для титрования бактериальной аликвоты, оттепель пробирку на льду, а затем добавить 500 мкл до 9,5 мл BHI бульона. Выдержите в течение 1,5 часа стоя при 30 ° С. Пластина серийных разведений на агаре BHI. Ожидать титра ~ 1-5 × 10 8 КОЕ / мл. Примечание: Если однородный аликвоты подготовлено, можно ожидать каждую из пробирок с получением титра при этом получают аналогичным способом с дисперсией от 2 до 4 раз.
- Для заражения мышей, подготовить аликвотой L. моноцитогенес как описано в пункте 2.4. Примерно 20 мин до L. моноцитогенес культуре готов, растопить хлеба частей при комнатной температуре. Расплава аликвоту масло при температуре 55 ° С и предварительно теплой небольшом объеме PBS при 55 ° С. Подготовьте хлеба куски так, что есть по крайней мере один на мышьбыть зараженным и по крайней мере один лишний кусок для определения титра фактической посевной.
- На основе заданных титр бактериальной аликвоты, рассчитать общий объем L. моноцитогенес культуры, необходимое для подготовки инокулята для необходимого количества хлеба куски. Гранул бактерий путем центрифугирования при 14000 х г в течение 10 мин Аспирируйте все бульона BHI, и ресуспендируют бактерии в небольшом количестве подогретого PBS (2 мкл / кусок хлеба).
- Vortex растопленное сливочное масло, добавить в бактерий (с использованием общего объема, равного 3 мкл / кусок хлеба) и тщательно перемешать. Примечание: Не пытайтесь подготовить более 10-15 штук хлеба за один раз или масло затвердеть.
- Рабочие быстро, пипетка 5 мкл бактериальной суспензии на одну часть хлеба в микроцентрифужных трубки. Решение должно быть полностью поглощается кусок хлеба.
- Для определения фактического титр инокулята, добавляют 1 мл стерильной PBS с одним из хлеба PiecES. Вортексе в течение 1 мин. Подготовьте серийные разведения и пластины как BHI и BHI / L + G агара.
- Альтернативные процедуры высоком титре (> 10 9 КОЕ) посевного. Если бактериальный осадок является слишком большим, это может быть трудно приостановить в таком небольшом объеме, а полученный материал очень вязкими, как паста, и некоторые из инокулята может прилипнуть к сторонам трубки микроцентрифужных. В этом случае, лучше для инокуляции хлеб в стерильной культуре блюдо 60 мм, и предложить все блюдо (без крышки) к мыши (см. ниже). Любое превышение посевной, которая не поглощается хлеб может быть съедено непосредственно с помощью мыши. В общем, это занимает больше времени для мышей, чтобы съесть все хлеба и лизать блюда очищаете, чем стандартный протокол, описанный ниже, так что это только предпочтительный метод при работе с очень высоким титром посевной.
3. Заражение мышей
- Купить женский BALB / С / К / J (Лот № 0010026) и C57BL/6/J (со# 000644) из лаборатории Джексона (Bar Harbor, ME) и использовать в 6-9 недельного возраста.
- Быстро мыши один день (24 часа) до инфицирования, удалив питание и размещение мышей на поднятый (1 дюйм) провод пол (№ 3 меш; Allentown), чтобы предотвратить копрофагией. Оставьте только достаточно постельных принадлежностей в клетке, чтобы поглотить мочу, но не достаточно, чтобы поднять пролить калом. Предоставить неограниченный доступ к воде.
- Infect мышей в начале темной цикл, работающий в ламинарном потоке оснащен красного света. Передача одной мыши в пустой (без постельных принадлежностей) клетки. Использование стерильным пинцетом, передавать загрязненных кусок хлеба на дно пустой клетке. Как правило, мышь будет забрать кусок хлеба и потребляют его полностью в течение 2-10 мин. Если мышь не ест хлеба сразу, вернуть клетку, чтобы ломать и оставить мышь в покое на 20-30 мин. Большинство животных будут есть хлеб в течение этого времени, однако, мышей можно не трогать, не имея доступа к аее пищи и воды до 2 часов.
- После заражения, вернуться мыши в исходное клетке и наполняйте мыши чау. Продолжить для размещения мыши на поднятых провод пол в течение всего срока эксперимента.
4. Мониторинг уровень бактерий в кале Сарай
- Этикетка и предварительно взвешивать микроцентрифужных пробирках, которые будут использоваться для сбора кала.
- Рабочие быстро после извлечения клетки мышей, каждая мышь поместить в пластиковый стакан 500 мл. Обычно мышей выгонит 1-4 гранулы стула в течение 5 мин.
- Использование стерильного пинцета передать кала соответствующей маркировкой труб.
- Взвесить каждую пробирку и вычислить вес кала путем вычитания веса пустой трубы. Типичный вес для фекальные шарики в диапазоне от 10-30 мг.
- Добавить PBS в каждую пробирку (200 мг μl/30 кала) и использовать стерильные зубочистку, чтобы пюре фекальные шарики.
- Вихревые каждую пробирку в течение 30 сек, а затем подготовить серийных разведений и пластину на BHI / л+ G агара. Подсчитайте количество колоний и рассчитать КОЕ / мг калом.
5. Обработка зараженных тканей кишечника
- Усыпить мышей, асептических урожай желудка и кишечника от каждой мыши как единая ткань и собрать в пустую 100 мм чашки Петри.
- Отделите тонкого кишечника, слепой кишки и ободочной кишки и место в отдельном 60 мм чашки хранят на льду. Тонком кишечнике может быть далее разделена по длине на три равные части аппроксимирующего двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и подвздошную кишку, чтобы облегчить удаление просвета содержимого. Ткань трети затем могут быть обработаны либо вместе (в КОЕ на весь тонкий кишечник) или по отдельности. Влажные салфетки с ~ 0,5 мл стерильной PBS держать гибким и предотвратить разрывы во время обработки.
- Заполните шприц 10 мл с 8 мл стерильной PBS и приложите 25 г иглы. Использование стерильного пинцета выдавить содержимое в просвете отходов стакан (или 50 мл стерильной трубки, если сбор бактерий просвета кишечника). ПФРч 4 мл PBS через один конец ткани, используйте щипцы, чтобы выдавить содержимое, а затем переверните ткань и повторите на другом конце.
- Для количественной оценки количества Listeria в просвете содержимое, центрифугируют объединенных приливы течение 20 минут при 12000 х г, приостанавливать осадок в 0,5 - 1,0 мл стерильной воды.
- Для количественной оценки общего числа клеточно-ассоциированных количество Listeria, открыть каждый промытые ткани за счет сокращения продольно стерильным скальпелем, а затем сделать несколько боковыми разрезами разрезать ткань на более мелкие фрагменты. Примечание: этот шаг необходим для того, чтобы ткани кишечника не будет циклически гомогенизатора лезвия. Передача кишечного части в 15 мл центрифужную пробирку, содержащую 2 мл стерильной воды.
- Стерилизация тканевом гомогенизаторе (Fisher PowerGen 1000) путем размещения зонда в 70% этаноле при 60% мощности в течение 30 сек. Подождите этанола высохнуть на воздухе, или процесс в стерильной воде в течение 10 сек. Гомогенизируют каждого Tiы п в течение 1 мин. Повторить лечение стерильной водой между каждым образцом, а также использовать 70%-ного этанола между образцом групп.
- Подготовка серийных разведений каждого образца в стерильной воде и пластину на BHI / л агара + G.
6. Обработка зараженных брыжеечных лимфатических узлов
- Урожай лимфатических узлов асептических, место в стерильном 60 мм блюдо на льду, а также использование стерильного пинцета, чтобы удалить все прилегающего жира. Ожидать, чтобы найти 3-6 узлов на мышь.
- Подготовьте экранов сетки за счет сокращения 1,5-2 дюйма квадратные куски из нержавеющей стали # 80 сетки. Сделайте небольшой надрез в каждом углу, и сложить четыре стороны, создавая гребнях. Падение в 95% этанола, а затем пламя для стерилизации, и место в 60 мм чашки Петри содержащие 0,75 мл стерильной воды. После каждого использования, экраны могут быть переработаны путем замачивания в 70% этаноле в течение 20 мин, протереть щеткой, чтобы удалить срезах тканей, кипячение в течение 20-30 мин в 2N NaOH, а затем промывки большим количеством воды.
- Используйте поршеньиз стерильной 3 мл шприц пюре узлов через сито. Будьте уверены, чтобы надавить на экране, чтобы дно тарелки так что имеет контакт с водой в чашке.
- Проход 0,75 мл стерильной воды через сито и затем пипетку вверх и вниз несколько раз, чтобы промыть экрана. Передача клеточной суспензии в микроцентрифужных трубки.
- Вихревые каждого образца энергично в течение 30 секунд, чтобы лизировать клетки. Подготовьте серийные разведения и пластины с обеих BHI / л агара + G.
7. Обработка зараженных селезенки, печени и желчные пузыри
- Возьмите селезенки стерильным пинцетом и освободить сделав два разреза, по одному на каждом конце. Место в 15 мл пробирку, содержащую 2,5 мл стерильной воды. (Примечание: трубы с круглым днища могут быть проще в использовании гомогенизатора с.)
- Найдите желчного пузыря (маленький желтый заполненный жидкостью мешок, прикрепленный к печени) и СНиП тщательно стерильными ножницами отделяется от печени без разрывов. Transfэр в микроцентрифужных пробирку, содержащую 1 мл стерильной воды.
- Асептически удалить печень, удалив все доли, и трансфер в 15 мл центрифужные пробирки, содержащие 2,5 мл стерильной воды.
- Однородный селезенки и печени, как описано выше в течение 30 сек на 60% мощности. Forgall пузыри, используйте стерильные ножницы, чтобы разорвать в микроцентрифужных трубки, а затем вихрь энергично в течение 30 сек.
- Подготовьте серийные разведения и пластины каждого образца по обе BHI или BHI / L + G агара.
8. Обработка зараженных Мозги
- Работа на задней стороне мыши, порезать кожу и ткань выше шеи, и через оба уха на 45 °. Использование стерильного пинцета снять с П-образный лоскут кожи, потянув по направлению к носу и разоблачить черепа и лицевых костей.
- Зафиксировать черепа, удерживая костного гребня между глазами с пинцетом и ножницами, чтобы сделать мелкий пересекает боковые края черепа. Бытьосторожным, чтобы отрезать только кости, а не ткани мозга. Затем вырезать костный выступ между глазами. Используйте пинцет, чтобы удерживать верхнюю часть черепа и тянуть в обратном направлении (к шее), чтобы разоблачить мозга.
- Аккуратно поднимите мозга от ее полость помощью стерильного пинцета и поместить в центрифугу 15 мл пробирку, содержащую 1,5 мл стерильной воды.
- Гомогенизируют в течение 20 сек на 60% мощности, как описано выше. Подготовьте серийные разведения и пластины с обеих BHI или BHI / L + G агара.
9. Справочная Процедура: фракционирование тканей кишечника
9.1 Выделение бактерий в слизи Фракция
- Для каждой ткани кишечника, готовить 3 пробирки, содержащие 3 мл 6 мм N-ацетилцистеина (NAC, Sigma # A-9165).
- Поместите покраснел и продольно разрезать ткань в первую трубку в течение 1-2 минут, энергично закрученного каждые 20-30 сек. С помощью стерильного пинцета, подобрать ткань и слегка сжать против стороне трубки, чтобы удалить избыток жидкого мылаID.
- Повторите шаг 9.1.2 два раза больше, используя оставшиеся трубы NAC. Снимите кишечная ткань и отложите в сторону для дальнейшей обработки.
- Бассейн NAC моет (всего 9 мл), и центрифуги в течение 20 мин при 12000 х г.
- Ресуспендируют осадок в стерильной воде вихрь в течение 30 сек, готовят серийные разведения и пластину на BHI / л + G.
9.2 Выделение бактерий в эпителиальной клетки (ЕС) Фракция
- Cut каждой ткани на мелкие кусочки стерильными ножницами и помещают в 50 мл пробирку, содержащую 5 мл среды RPMI (Invitrogen # 21870) с добавлением 5% FBS (RP-5), 5 мМ ЭДТА и 1 мМ DTT. Инкубируют встряхивании при 37 ° С в течение 20 мин.
- Передача кишечного частей в свежую пробирку, содержащую 5 мл RP5/EDTA/DTT и инкубировать встряхивании при 37 ° С в течение 20 мин. Сохранить средств массовой информации из первой пробирки и отложите в сторону при 37 ° С. Повторите эту процедуру еще раз в течение в общей сложности три 20 мин инкубации в RP5/EDTA/DTT. Если перейти к собственной пластинки ISOLation шагом, перевести оставшуюся кишечной части в пустом 50 мл трубки.
- Смешайте три RP5/EDTA/DTT смывки (общий объем 15 мл) и центрифугируют при низкой скорости (1200 мкг) для осаждения клеток.
- Для количественной оценки внеклеточной бактерии, собирают супернатант и центрифугировали 20 мин при 12000 х г. Ресуспендируют гранул в 0,5 - 1,0 мл стерильной воды и пластиной серийные разведения на BHI / L + G агара.
- Чтобы перечислить внутриклеточных бактерий, ресуспендируйте EC осадок в 5 мл РП-5, содержащий 25 мкг / мл гентамицина. Инкубируйте клеточной суспензии в течение 30 мин при 37 ° С плюс 7% CO 2 уничтожить оставшиеся внеклеточный L. моноцитогенес. Промыть клетки дважды в ЗФР, приостанавливать в 0,5 мл стерильной воды, и вихрь в течение 30 сек, чтобы лизировать клетки. Подготовьте серийные разведения в воде и пластину на BHI / L + G.
Примечание: клетки, собранные на этом этапе будет также содержать клетки от Patches основной пейеровых. При желании, видимый пейеровыхИсправления могут быть удалены из тканей кишечника перед промывкой и резки в продольном направлении.
9.3 Выделение бактерий в собственную пластинку (LP) Фракция
- Промыть избыток ДТТ / ЭДТА из желудочно-кишечного части добавлением 25 мл стерильного PBS к трубе. Энергично встряхните, перевод на новую пробирку и повторить дважды.
- Передача кишечного части в 50 мл пробирку, содержащую 4 мл пищеварение раствор, состоящий из RP-5 с добавлением 1 мг / мл коллагеназы типа IV и 40 мкг / мл ДНКазы I. Инкубировать встряхивании при 37 ° С в течение 40 мин.
- Передача непереваренные кусочки в чистую пробирку, содержащую 4 мл раствора и пищеварения повторить один или два раза, пока кусочки тканей не полностью переваривается. Сохранение каждого пищеварение решений, которые содержат освобожденные клетки LP, при 37 ° С.
- Центрифуга объединенных решений пищеварение на низкой скорости (1200 мкг) для осаждения клеток. Процесс супернатант и осадок клеток отдельно, как DescrIBED выше перечислить внеклеточных и внутриклеточных бактерий соответственно.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Л. моноцитогенес колонии будет виден на BHI / L + G пластин через 36-48 часа инкубации при 37 ° С. Колонии имеют гладкую, куполообразные кремово-белый внешний вид (рис. 1А). Рост будет запрещен для большинства кишечной микрофлоры, но это часто можно увидеть некоторые колонии, которые не являются L. моноцитогенес, особенно когда обшивки тонкой кишки или толстой кишки непосредственно без значительного разбавления (фиг.1В). Подозреваемого колоний может быть подтверждено путем посева на CHROMagar TM Listeria пластин. L. моноцитогенес появляются как синие колонии, окруженные белым ореолом на этих пластинах (рис. 1в). Предел обнаружения для L. моноцитогенес в каждой ткани зависит от объема воды, используемой для гомогенизации ткани. Объем пробы приведены в таблице 1 представляют собой минимальный объем, необходимый для эффективной обработки каждой ткани. Гомогенаты селезенке, гвсе мочевого пузыря, мозга, или фракционированные кишечной ткани можно хранить при температуре 4 ° С в течение 1-2 дней и повторно покрыты, если необходимо. Колон, тонкого кишечника или печени гомогенаты может заблокировать некоторые L. моноцитогенес роста, если образец не разбавляется достаточно (рис. 1D), и эти гомогенатах не дают сходные рассчитывает КОЕ если повторное покрытие после хранения при 4 ° С.
Ранее мы показали, что BALB / С / К / J (BALB) мыши были значительно более восприимчивы к пищевого листериоза, чем C57BL / 6 (B6) 16 мышей. Инокулят 10 7 КОЕ достаточно установить кишечные инфекции у мышей BALB, но по крайней мере, 10 8 КОЕ необходимо колонизировать желудочно-кишечном тракте мышей В6 (рис. 2). Как показано на фиг.2, бактериальной нагрузки в мочевом пузыре кишечника, селезенки, печени и желчного будет пропорциональна вызов доза для мышей. Предварительные исследования показывают, что 5 х 10 9 КОЕ являетсяприблизительный LD 50 для мышей BALB / С / К / J мышей с использованием этой модели 16.
Рисунок 1. Представитель роста колоний на селективной пластины агара.) L. моноцитогенес колоний после 48 ч роста на BHI / L + G агара. B) BHI / L + G агар ингибирует рост большинства кишечной микрофлоры, но некоторые не Listeria колоний (стрелка) может наблюдаться при низких разведений. Агар пластины, показанной здесь содержит 100 мкл 10 -1 разведения на половине пластинки, и 50 мкл каждого из 10 -2 и 10 -3 разведений толстой кишки гомогената. С) Л. моноцитогенес колонии могут быть подтверждены рост на агаре CHROM Listeria пластин. L. моноцитогенес появляются синие с белым ореолом вокруг колонии. D) Это не редкость, чтобы сEE ингибирование L. моноцитогенес роста, в результате в колониях различных размеров, в самом низком разведении либо кишечная гомогенатах печени или пластин на BHI / л агара + G.
Рисунок 2. Дозовой зависимости от пищевых инфекции у мышей BALB / с / К / J и мыши C57BL / 6. Самок BALB / с / К / J (BALB) и C57BL / 6 (В6) мышей инфицировали 10 9 (п = 7), 10 8 (п = 8), 10 +7 (п = 6) и 10 6 (п = 4) Lm INLA м, а число КОЕ в каждой ткани было определено пять точек на дюйм. Средние значения + / - SD показаны. Объединенные данные из двух различных экспериментах были проанализированы. Пунктирные линии предела обнаружения в каждом органе.
| Ткань | Объем образца (мл) | Предел обнаружения (КОЕ) |
| Тонкая кишка | 2.0 | 50 |
| Слепая кишка | 2.0 | 50 |
| Двоеточие | 2.0 | 50 |
| Брыжеечных лимфатических узлов | 1,5 | 15 |
| Селезенка | 2,5 | 50 |
| Печень | 2,5 | 50 |
| Желчный пузырь | 0,5 | 10 |
| Мозг | 1,5 | 15 |
Таблица 1. Предел обнаружения для L. моноцитогенес в гомогенатах тканей. Средний полный объем образца, состоящий из стерильной воды плюс гомогенизированные ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Инбредных мышей не равномерно восприимчивы к кормлению в любое время дня, и их готовность едят загрязненные хлеб будет зависеть как от типа деформации и возраста мышах 17. По нашему опыту, 6-9 недельных мышей В6 восприимчивы к кормлению в любое время дня, но мышам BALB не будет последовательно съесть кусок хлеба, если он не во время их темном цикле. Световом цикле из комнаты используется для размещения животных могут быть изменены так, темной фазы совпадает с обычный рабочий день для лабораторного персонала. Тем не менее, мыши следует по крайней мере двух недель, чтобы привыкнуть к измененным циклом свет до заражения. Во время инфекции, только красные лампы должен быть использован в любом помещении или в ламинарном боксе.
При разработке этой модели, хлеб был выбран в качестве источника пищи для передачи L. моноцитогенес в значительной степени, что хлеб является абсорбентом. Таким образом, было легко насытить мелкие кусочки йэлектронной бактериального инокулята и гарантировать, что каждая мышь попадает в той же дозе. Тем не менее, эта модель может быть легко адаптирован для использования других источников пищи. В самом деле, это единственная модель мыши, который может быть использован для прямого проверить влияние состава пищи или условий хранения на бактериальную инфекционную. L. моноцитогенес можно легко адаптировать к росту в высокой концентрации соли, низкий рН или низких температурах 1,2,18, но это не известно, если эти условия роста изменить способность бактерий к созданию кишечной инфекции.
Приблизительно 10 мин необходимо собрать все инфицированные органов у одной мыши. Желчного пузыря легко разрывается, так что лучше, чтобы удалить его в первую очередь. Брыжеечные лимфатические узлы легче всего определить, когда кишечник не был нарушен, поэтому они должны быть удалены следующим. Кишечник может быть собран как единый ткани путем разрезания чуть ниже желудка и непосредственно над приложением, а затем разделяется на двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, ileuм, слепой кишки и ободочной кишки непосредственно перед промывкой и гомогенизации. Селезенки и печени обычно удаляют следующим, и мозга собирали после извлечения органов из брюшной полости, так как это необходимо повернуть курсор для доступа к черепу. При работе с несколькими мышами, все ткани должны храниться на льду, пока не обработаны. Для большинства тканей, один агаром была использована для определения общего числа присутствующих КОЕ в ткани. Пластина была разделена на три части, и 50-100 мкл пробы из трех отдельных разведения гомогената ткани помещали на каждый третий.
Методы, описанные здесь, будут идентифицировать общее количество L. моноцитогенес в каждой ткани мыши, а не только внутриклеточных организмов. Уникальный стиль внутриклеточной жизни Л. моноцитогенес считается ключевым фактором вирулентности инфекции во время 18,19. Тем не менее, Л. моноцитогенес являются факультативными, не обязывает, внутриклеточных патогенов, и термоэлектронной никаких категорических опубликованных отчетов, чтобы указать процент Listeria, которые фактически проживают в пределах клетки в живом организме. Большинство предыдущих исследований с использованием устной L. моноцитогенес инфекции опирались на гентамицин лечения кишечных тканей для ингибирования роста кишечной микрофлоры. Предварительная обработка с гентамицином имеет потенциал, чтобы устранить внеклеточный L. моноцитогенес, позволяющий восстановление только внутриклеточные бактерии, хотя не ясно, в какой степени гентамицин способен проникать целом кишечной ткани в пробирке. Дополнительный протокол, описанный здесь позволяет определять как внеклеточный и внутриклеточных бактерий в слое слизи, эпителия, и отсек собственной пластинки зараженных кишечной ткани. В этой процедуре, гентамицин используется для лечения одноклеточных суспензий, гарантируя, что все восстановленные бактерий внутри клеток в ткани.
Три промывок NAC обычно повторноперемещается большинство слизи из кишечной ткани, и объединенные промывки не содержит эукариотических клетках (жизнеспособными или мертвых), как это определено путем окрашивания трипановым синим. Дополнительные моет не дали видимых слизи, как это определено Diff-Quik окрашивание препаратов цитоспин слайда. Клеточность ЕС и LP фракций также может быть подтверждено с помощью Diff-Quik или Гимза окрашивания. Фракция EC должна состоять из в основном эпителиальные клетки, которые могут быть легко отличить от нескольких интраэпителиальной лимфоцитов, присутствующих в кишечном эпителии. LP фракции более разнообразным, содержащий смесь мононуклеарных клеток, который изменяет состав после заражения, когда воспалительный инфильтрат моноцитов ткани.
Пищевых модель листериоза может быть использован с широким спектром Л. моноцитогенес изолятов, включая мышь адаптированных INLA м, экспрессирующих штамм 15, описанных здесь, дикий EGDE типа и мутанта с делецией Дериvatives этих штаммов 16. В предыдущем исследовании мы показали, что уровень колонизации кишечника не отличался существенно среди этих штаммов, однако, изоляты, которые не выразили высокую лиганда сродством к мышиного Е-кадгерина действительно был небольшой дефект в распространении в брыжеечные лимфатические узлы и селезенки 16. Кроме того, любой штамм мыши могут быть использованы для инфекции, что делает эту привлекательную модель системы для изучения как бактериальный патогенез и хост ответ на инфекцию. Наконец, хотя мы еще не проверили это напрямую, мы полагаем, что основные процедуры, используемые здесь, должны быть широко применимо к другим пищевых бактериальных патогенов, таких как Salmonella, Yersinia, coli, Campylobacter и Citrobacter видов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов. Все эксперименты, описанные здесь, были выполнены в соответствии с Управлением по лаборатории животных (OLAW) с одобрения ICAUC в Университете штата Кентукки.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке грантов от Национального института здоровья (AI079442 и AI091918) присуждена SEFD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Agar | Difco | BD-241830 | |
| Lithium chloride | Sigma | L9650 | |
| Glycine | Omnipur | 4840 | |
| EDTA | Gibco | 15575-038 | |
| DTT | Sigma | D5545 | |
| Collagenase, type IV | Worthington | LS004089 | |
| DNAse I | Worthington | LS002007 | |
| Diff-Quik | Dade-Behring | B4132-1A | |
| PowerGen 1000 homogenizer | Fisher | 14-261-06 | |
| stainless steel type 304 mesh #80 | Small Parts, Inc. | CX-0080-C | |
| Cytospin | Statspin | M801-22 |
References
- Becker, L. A., Evans, S. N., Hutkins, R. W., Benson, A. K. Role of sigmaB in adaptation of Listeria monocytogenes to growth at low temperature. Journal of Bacteriology. 182, 7083-7087 (2000).
- Neunlist, M. R., et al. Effect of salting and cold-smoking on the culturability, viability, and virulence of Listeria monocytogenes strain Scott A. Journal of Food Protection. 68, 85-91 (2005).
- Aureli, P., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes. N. Engl. J. Med. 342, 1236-1241 (2000).
- Dalton, C. B., et al. An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk. N. Engl. J. Med. 336, 100-105 (1997).
- Frye, D. M., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with delicatessen meat contaminated with Listeria monocytogenes. Clin. Infect. Dis. 35, 943-949 (2002).
- Salamina, G., et al. A foodborne outbreak of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes. Epidemiol. Infect. 117, 429-436 (1996).
- Mead, P. S., et al. Food-related illness and death in the United States. Emerging Infectious Diseases. 5, 607-625 (1999).
- Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: Clinical and experimental update. The Journal of Infectious Disease. 185, S18-S24 (2002).
- Condotta, S. A., Richer, M. J., Badovinac, V. P., Harty, J. T. Probing CD8 T cell responses with Listeria monocytogenes infection. Advances in Immunology. 113, 51-80 (2012).
- Disson, O., et al. Modeling human listeriosis in natural and genetically engineered animals. Nat Protoc. 4, 799-810 (2009).
- Czuprynski, C. J., Faith, N. G., Steinberg, H. A/J mice are susceptible and C57BL/6 mice are resistant to Listeria monocytogenes infection by intragastric inoculation. Infect. Immun. 71, 682-689 (2003).
- Gajendran, N., et al. Regional IFNgamma expression is insufficient for efficacious control of food-borne bacterial pathogens at the gut epithelial barrier. Int. Immunol. 19, 1075-1081 (2007).
- Lecuit, M., et al. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infect. Immun. 66, 747-755 (1998).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
- Ghanem, B. ou, N, E., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathogens. , Submitted for publication (2012).
- Kowal, M., Buda-Lewandowska, D., Plytycz, B., Styrna, J. Day/night food consumption in mice is strain and age-dependent. Folia Biol. (Krakow). 50, 1-3 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature reviews. Microbiology. 7, 623-628 (2009).
- Camejo, A., et al. The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle. Virulence. 2, 379-394 (2011).
