Summary
Bu kağıt kullanılarak farenin oral enfeksiyonu için yeni bir yöntemi anlatmaktadır
Abstract
L. monocytogenes insanlarda gıda kaynaklı enfeksiyonlara neden fakültatif hücre içi bakteriyel patojenler bulunmaktadır. Çok az yakın insan hastalığı taklit eden küçük bir hayvan modelinin eksikliği nedeniyle listeriosis gastrointestinal faz hakkında bilinmektedir. Bu çalışma, L. sözlü iletim için yeni bir fare modeli açıklar monocytogenes. Fareler beslenen L., bu modeli kullanarak monositogenlerinin kirlenmiş ekmek duyarlı (BALB / c / j /) veya dirençli (C57BL / 6) fare suşlarının sistemik yayılmasını değişen derecelerde takip gastrointestinal enfeksiyon gibi ayrı bir faz vardır. Enfeksiyon daha sonraki aşamalarında, safra kesesi ve beyne yayılması görülmektedir. Listeriosis gıda kaynaklı modeli, son derece tekrarlanabilir özel beceri gerektirmez, ve bakteriyel izolatlar ve laboratuvar fare suşlarının geniş bir yelpazede kullanılabilir. Bu nedenle, L. tarafından kullanılan iki virülans stratejileri incelemek için ideal bir model monocytogenes
Introduction
Listeria monocytogenes, insanlarda gıda kaynaklı enfeksiyonlara neden fakültatif hücre içi bakteriyel patojenler bulunmaktadır. Bakteri tuzlama, kurutma gibi olarak gıda tedarik, korumak için kullanılan süreçlerin çok dayanıklı, ya da soğutma 1,2 ve enfeksiyonlar genellikle tüketim önce ısıtılır değildir işlenmiş, "hazır yemek" gıdalar ile bağlantılıdır . L. birkaç önceki salgınları, kaynak monocytogenes-kontamine yiyecek tespit edilmiştir, ve maruz kalan bireylerin kısıtlı grup yakından 3-6 izlenmiştir. Bu örneklerde, aksi takdirde sağlıklı kişilerde klinik hastalık hafif, kendini sınırlayan gastroenterit daha ağır bağırsak ve sistemik enfeksiyonlar gerektiren hastanede. L. çeşitli yenidoğan ve yaşlılar dahil olmak üzere bağışıklık sistemi zayıflamış kişiler, içinde monocytogenes enfeksiyonları bile antibiyotik tedavisi ile, bir yüksek ölüm oranı (% 25-30) ile ilişkilendirilmiştir
Listeryoz En yaygın olarak kullanılan model farenin intravenöz (iv) bir aşı. Iv modeli son derece tekrarlanabilir, ve enfeksiyon 9,10 sırasında naif ve bellek hem de T hücre yanıtları eğitim için son derece yararlı olmuştur. Iv modelinin dezavantajı tamamen enfeksiyon bağırsak faz atlar olmasıdır. Gıda kaynaklı iletim sonra, bağırsak mukoza muhtemelen yavaşlatır ve sürekli çevre dokulara yaymak olabilir bakteri sayısını sınırlayan bir engel oluşturur. Buna karşılık, tüm inokulum iv uygulamadan sonra birkaç dakika içinde dalak, karaciğer ve bulunabilir ve organizmaların bu büyük bolus olarak doğuştan gelen bağışıklık d bastıran olabilirbu dokularda efenses. Yüksek dozlarda (10 9 -10 11 CFU) genellikle bağırsak kolonizasyonu 10 elde etmek için gerekli, çünkü sonda ile farelerin ağız enfeksiyonu daha az yaygın olarak kullanılır. Ayrıca, bir besleme iğnesi ile birlikte intragastrik (Ig) aşılama sistemik yayılmasını önce sindirim sistemi enfeksiyonu tekrarlanabilir bir süre üretmez. Bazı laboratuvarlar bu L. bildirdin diğerleri 48 hpi 11-15 kadar sistemik yayılma gösterdi monocytogenes, 4-12 saat sonrası enfeksiyon (hpi) içinde dalak ve karaciğer ulaşır. Bu laboratuvar-to-laboratuar varyasyon yemek borusu astar minör travmaya neden olabilir hangi, ig inokülasyon invaziv bir sonucu olması ve bakteri doğrudan kan işgali teşvik edebilir.
Biz son zamanlarda sözlü L. yeni bir fare modeli geliştirdi yakın insan hastalığı 16 her aşamasında taklit monocytogenes enfeksiyonu. Fareler devam parçaları yemek zaman enfeksiyon ortaya çıkarGıda, travmatik olmayan bir süreç, aminated ve laboratuvar araştırmacılar tarafından özel beceri gerektirmez. Zaman ayrı bir süre (36-48 saat) için, L. monositogenlerinin tekrarlanabilir böylece bağırsak mukozasındaki transloke ve çevre dokulara yayılması için Listeria patojen tarafından kullanılan mekanizmalarının incelenmesi sağlayan, sadece mide-bağırsak sisteminde koloni. Önemli olarak, model enfeksiyona ana doğal dirençte farklılıklarını incelemek için kullanılabilir. Bir önceki çalışmada, BALB / c / J fareler By / L. üstel çoğaltma ile, gıda kaynaklı listeriozis son derece duyarlı olduğunu gösterdi bağırsak, dalak, karaciğer ve safra kesesi 16 meydana monocytogenes. Bunun aksine, C57BL / 6 fareler L. yalnızca geçici kolonizasyonunu, gıda kaynaklı enfeksiyona karşı dirençli monocytogenes, bu dokuların her meydana gelen. Yakın insan hastalığı taklit gıda kaynaklı modelinin bir diğer özelliği doğal yayılması olduğunubeyin enfeksiyonu sonraki aşamalarında (5-7 dpi) sırasında meydana için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Selective Agar Medya hazırlanması (BHI / L + G) Bağırsak Microbiota Engelleme için
- 26 g Brain Heart Infusion agar (Difco), 7.5 g LiCI ve 5,0 g glisin ve 1 litrelik bir şişe içinde yer tartılır. Iyonu giderilmiş suyun 500 ml ilave edilir.
- Bir manyetik karıştırıcı üzerinde ısı agar kaynayıncaya kadar, sürekli bir şekilde karıştırarak. Isı şişesi alın, baloncuklar yerleşmek izin, ve sonra tekrar bir raddeye geri getirmek.
- . Bir sıvı döngüsünde 16-19 psi altında 121 ° C'de 30 dakika süreyle otoklavlanmaktadır Not: şişeye karıştırma çubuğu bırakın.
- ° C su banyosunda 55 medya dengelenmesi veya oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Çözüm ° C veya kristalleri agar oluşturacak 55 daha serin olsun izin vermeyin. Kristaller, L. inhibe etmeyen monocytogenes büyüme veya medyanın seçici özelliklerini etkiler. Ancak, kristaller küçük koloniler görünüm olarak benzer olacaktır ve zor bakteriyel CFU saymak yapacaktır.
- Yavaşça karıştırınmanyetik bir karıştırıcı kullanılarak 1 dk için agar. Hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek. Petri kapları (~ 25 ml / plaka) içine agar dökün.
Not: Bu medya tüm L. büyümesini desteklemiyor monocytogenes suşları. Örneğin, L. monocytogenes EGDE 36-48 saat içinde görünür koloniler ile, bu agarda iyi yetişir, ama 10403S bu medya olmak değil.
2. İnokulum hazırlanması
- Küçük içine dilimlenmiş beyaz ekmek (Kroger) Kesme (2-3 mm) steril makas ora steril neşter bıçak kullanarak küpleri. Kabuklar kullanmayın. Enfeksiyonun güne kadar -20 ° C'de mikrosantrifüj tüpleri içinde tek tek parçalar saklayın.
- Steril bir neşter kullanılarak, tuzlu tereyağı (Kroger) küçük (0.5-1 cm) parçalar kesilir ve steril bir mikrosantrifüj tüp içinde her yer. 60 ekmek parçaları - Her tüp 50 hazırlamak için yeterli tereyağı içerir. -20 ° C'de saklayın kadar gerekli.
- L. büyütün BHI suyu monocytogenes ve 30 sallayarakderece; kültür ~ 0.8-1.0 bir OD 600 ulaşana kadar C. Numune, sık kullanılan tüpler her bakteri aynı sayıda girdap bakımı, mikrosantrifüj tüpleri içinde 500 ul hacimde hazırlayın. -80 ° C de saklayınız
- , Bakteriyel alikotları titresi buz üzerinde bir tüp çözülme, sonra 500 ul, 9.5 mi, BHI et suyu ile ekleyin. 30 1.5 saat ayakta için inkübe ° C BHI agar plaka seri seyreltme. . Homojen alikotları hazırlanır, 2-4 kat bir varyans ile benzer bir şekilde hazırlandığında, tüplerin her biri bu titresi verecek şekilde elde edebilirler: ~ 1-5 x 10 8 CFU / ml Not bir titreye bekliyoruz.
- Farenin bulaştırmak için, L. ve bir kısım hazırlamak monocytogenes, adım 2.4 'te açıklandığı. L. önce yaklaşık 20 dakika monocytogenes kültür hazır, oda sıcaklığında ekmek parçaları çözülme. 55 tereyağı bir kısım eritin ° C ile 55 ° C 'de PBS içinde ön ısıtma küçük hacimli En az bir fare başına olacak şekilde yeterli ekmek parçaları hazırlamakenfekte edilen ve gerçek inokulum titresi belirlenmesi için en az bir adet ilave edilmesi.
- Bakteriyel kısım önceden belirlenmiş titresi göre, L. toplam hacmi hesaplamak monocytogenes kültür ekmek parçaları gerekli sayıda için aşı hazırlamak için gerekli. 10 dakika için 14,000 x g'de santrifüj ile pelet bakteri tüm BHI et suyu aspire edin ve önceden ısıtılmış PBS (2 ul / ekmek adet) küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon bakteri.
- Vortex eritilmiş tereyağı, bakteriler (3 ul / ekmek parçasına eşit bir toplam hacim kullanarak) eklemek ve iyice karıştırın Not:. Bir kez ya da tereyağı pekiştireceğiz birden fazla 10-15 ekmek parçaları hazırlamak için çalışmayın.
- , Hızlı bir şekilde mikrosantrifüj tüp içinde tek bir ekmek parçasının üzerine bakteriyel süspansiyon pipet 5 ul Çalışma. Çözelti tamamen ekmek parçası tarafından soğurulmaktadır.
- Inokulum asıl titresini belirlemek için, ekmek piec biri 1 ml steril PBS ekleyines. 1 dakika boyunca kuvvetli bir şekilde karıştırın. Seri seyreltme ve plaka BHI ve BHI / L hem + G agar hazırlayın.
- Yüksek titrede (> 10 9 CFU) aşı için alternatif prosedür. Bakteriyel pelet çok büyük ise, bu kadar küçük bir hacim içinde süspansiyon haline getirilmesi zor olabilir ve sonuçta ortaya çıkan madde, bir macun gibi, çok viskoz ve inokulum bir mikrosantrifüj tüpü yanlarına yapışabilir. Bu durumda, steril bir 60 mm kültür tabağına ekmek aşılamak için, ve (bkz. aşağıda), fare için tüm çanak (kapaksız) sunmak için daha iyidir. Ekmek tarafından absorbe olmayan herhangi bir aşırı aşı sonra fare doğrudan yenebilir. Çok yüksek titre aşı ile uğraşırken Genel olarak, ekmek tüm yemek ve aşağıda açıklanan standart protokol daha temiz çanak yalamak için fareler için daha uzun sürer, bu nedenle bu sadece tercih edilen yöntemdir.
3. Farelerin Enfeksiyon
- Dişi BALB / c / J (hisse senedi # 0.010.026) ve C57BL/6/J By / (hisse senedi satın# 000.644) Jackson Laboratuvarı (Bar Harbor, ME) gelen ve yaş 6-9 hafta kullanın.
- Hızlı gıda kaldırma ve yükseltilmiş (1 inç) kablo döşeme (# 3 gözenek; Allentown) üzerine farenin yerleştirerek enfeksiyon öncesi farenin bir gün (24 saat) coprophagy önlemek için. Sadece yeterli idrar absorbe kafeste yatak, ama döken dışkı yükseltmek için yeterli değil bırakın. Suya sınırsız erişim sağlar.
- Kırmızı bir ampul ile donatılmış bir laminer akış kaputu çalışan, karanlık döngüsünün başlangıcında fareler bulaştırmak. Boş (hiç yatak) kafesine tek bir fare aktarın. Steril bir forseps kullanarak, boş kafesinin altına kirli ekmek parçası aktarın. Tipik olarak, fare ekmek parçası almak ve 2-10 dakika içinde tamamen tüketmek. Fare hemen ekmek yemez ise, 20-30 dakika süreyle rahatsız fare raf ve ayrılmak kafes dönmek. Hayvanların büyük çoğunluğu bu süre içinde ekmek yiyeceğiz, ancak fareler ot erişimi olmayan, rahatsız bırakılabiliren fazla 2 saat için onu yiyecek ya da su.
- Enfeksiyondan sonra, orijinal kafes için fareyi dönmek ve fare yemi doldurmak. Deney süresi boyunca yükseltilmiş tel zemin üzerinde farenin ev devam edin.
4. Bakterilerin Seviyesi İzleme Dışkı içinde Shed
- Etiket ve ön ağırlık mikrosantrifüj tüpleri dışkıların toplanması için kullanılır.
- Farenin bir kafeste aldıktan sonra hızlı bir şekilde çalışan, 500 ml'lik plastik kabı içinde, her bir fare yerleştirin. Genellikle fareler 5 dakika içinde 1-4 dışkı pelet sınırdışı edecek.
- Şekilde etiketlenmiş tüplere dışkı aktarmak için steril bir forseps kullanın.
- Her bir tüp tartılır ve boş tüpün ağırlık çıkarılarak dışkı ağırlığını hesaplamak. Pislikleri için tipik ağırlıkları 10-30 mg arasında değişiklik gösterebilir.
- Her bir tüp (200 μl/30 mg dışkı) PBS ekleyin ve püre fekal pelet için steril bir kürdan kullanın.
- 30 saniye vorteks her tüp, daha sonra BHI / L üzerinde seri seyreltme ve plaka hazırlamak+ G agar. Kolonilerin sayısını ve CFU / mg dışkı hesaplamak.
5. Enfekte Bağırsak Dokular işlenmesi
- Fareler Euthanize, aseptik tek bir doku olarak her fareden mide ve bağırsak hasat ve boş 100 mm Petri kapları koyunuz.
- Ince bağırsak, çekum ve buz saklanan ayrı 60 mm yemekleri kolon ve yer ayırın. Ince bağırsak daha duodenum, jejunum ve luminal içeriği çıkarılmasını kolaylaştırmak için ileum yaklaşan üç eşit parçaya uzunluğu ayrılabilir. Doku üçte sonra da birlikte işleme (bütün ince bağırsak başına CFU için) veya ayrı ayrı olabilir. ~ 0.5 ml steril PBS ile ıslak mendil esnek tutmak ve taşıma sırasında gözyaşları önlemek için.
- 8 ml steril PBS ile 10 ml şırınga doldurun ve 25 g iğne takın. Bir atık beher (veya steril 50 ml tüp luminal bakteriler toplama varsa) içine luminal içeriğini sıkmak için steril forseps kullanın. Griplerdoku bir ucunu ile saat 4 ml PBS, içeriğini sıkmak için forseps kullanın ve sonra diğer ucunda doku ters çevirin ve tekrarlayın.
- Luminal içeriği Listeria sayısı ölçmek için, 0.5 pelet askıya, 12.000 x g'de 20 dakika için toplanmış basması santrifüj - 1.0 ml steril su.
- Listeria hücre ile ilişkili miktarı toplam sayısı ölçmek için, daha küçük parçalara doku dilim için birkaç yan keser sonra steril neşter bıçağı ile boyuna keserek her yıkanmış doku açın ve Not:. Bu adımı sağlamak için gerekli olduğunu bağırsak dokusu homojenizatör bıçak etrafında kaydırma değil. 2 ml steril su ihtiva eden bir 15 ml santrifüj tüpüne bağırsak parçaları aktarın.
- 30 saniye için% 60 güçte% 70 etanol içinde prob yerleştirerek bir doku homojenleştirici (Fisher PowerGen 1000) sterilize edin. 10 sn için, steril su içinde hava kuru etanol, veya işlem bekleyin. Her ti homojenize1 dakika boyunca ssue. Her numune arasında steril su ile tedavi tekrarlayın, ve örnek gruplar arasında% 70 etanol kullanın.
- Steril su ve BHI / L + G agar plaka her numunenin seri dilüsyonları hazırlayın.
6. Enfekte Mezenterik Lenf düğümleri işlenmesi
- Hasat lenf aseptik düğümleri, buz üzerinde steril bir 60 mm çanak yer, ve bağlı tüm yağ çıkarmak için steril forseps kullanabilir. Fare başına 3-6 düğümleri bulmak için bekliyoruz.
- Paslanmaz çelik # 80 örgü 1.5-2 inç kare parçalar keserek tel örgü ekranları hazırlayın. Her köşesinde küçük bir kesim yapmak ve bir yükseltilmiş yatak oluşturarak, dört tarafı aşağı katlayın. 0.75 ml steril su içeren bir 60 mm Petri kabındaki% 95 etanol ve sonra sterilize etmek için ateş ve yerde batırın. Her kullanımdan sonra, ekranlar, 20 dakika süreyle% 70 etanol içinde ıslatma gömülü dokulara kaldırmak için bir fırça ile ovma, 2N NaOH ile 20-30 dakika boyunca kaynamaya, ve daha sonra su ile iyice yıkanarak geri dönüştürülebilir.
- Piston kullanınağ elek boyunca steril 3 ml şırınga mash düğümleri. Bu çanak su ile temas yapar böylece yemeğin altına ekranda aşağı itmek için emin olun.
- Ekran üzerinden 0.75 ml steril su geçmek ve ekrandaki durulama birkaç kez aşağı yukarı pipet ve. Bir mikrosantrifüj tüpüne hücre süspansiyonu aktarın.
- Vorteks her numune kuvvetli bir şekilde 30 saniye için hücreleri eritmek için. Ya BHI / L + G agar seri seyreltme ve plaka hazırlayın.
7. Enfekte Dalak, karaciğerleri, ve Gall Bladders işlenmesi
- Steril forseps ile dalak tutun ve iki kesim, her sonunda bir yaparak serbest. 2.5 ml steril su ihtiva eden 15 ml'lik bir tüp içinde yer. (Not: yuvarlak dipleri ile tüpler homojenizatör ile kullanmak daha kolay olabilir.)
- Safra kesesi (karaciğer bağlı küçük bir sarı sıvı dolu kese) ve patlama olmadan karaciğer ayırmak için steril makas ile dikkatlice kelepir bulun. Transf1 ml steril su ihtiva eden bir mikrosantrifüj tüpüne er.
- Aseptik, karaciğer kaldırmak tüm lobları kaldırmak için emin ve steril su 2.5 ml içeren 15 ml santrifüj tüpüne aktarın.
- Olarak% 60 güç 30 saniye yukarıda açıklanan dalak ve ciğeri homojenize. Forgall mesane, 30 saniye boyunca kuvvetlice vorteks sonra mikrosantrifüj tüp içinde paramparça steril makas kullanın ve.
- Seri seyreltme ve BHI veya BHI / L ya da üzerinde plaka her bir örnek + G agar hazırlayın.
8. Enfekte Brain işlenmesi
- Fare arka tarafında çalışan, bir 45 ° açıyla boyun üzerinde deri ve doku kesme ve her iki kulakta arasında. Burun doğru çekerek cilt U şeklindeki kapak kalkmasına steril bir forseps kullanın ve kafatası ve yüz kemikleri ortaya.
- Bir forseps ile göz arasında kemik sırt tutarak kafatası hareketsiz ve kafatasının yan kenarları boyunca sığ kesim yapmak için makas kullanın. Olmaksadece kemik değil, beyin dokusu kesmek için dikkatli. Daha sonra, gözler arasında kemik sırt kesti. Beyin ortaya çıkarmak için (boyun doğru) kafatasının üst tutun ve geriye doğru çekmek için bir forseps kullanın.
- Yavaşça 1.5 ml steril su ihtiva eden 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne steril ve forseps kullanarak boşluğundan beyin kaldırın.
- Yukarıda tarif edildiği gibi% 60 güç, 20 sn için homojenize edilmiştir. BHI veya BHI / L + G agar ya da üzerinde seri seyreltme ve plaka hazırlayın.
9. Ek Prosedür: Bağırsak Dokuların Fraksiyonu
Mukus Kesir Bakterilerin 9.1 izolasyonu
- Her bağırsak dokusu için, 6 mM N-asetilsistein (; Sigma # A-9165 NAC) 3 ml içeren 3 tüpler hazırlamak.
- Kızarmış yerleştirin ve uzunlamasına şiddetle her 20-30 sn dönen, 1-2 dakika için ilk tüp doku kesti. Steril forseps kullanarak, doku almak ve yavaşça aşırı Sıvı sabun kaldırmak için tüpün kenarına sıkmakkimliği.
- Kalan NAC tüpler kullanılarak iki kez daha adım 9.1.2 tekrarlayın. Bağırsak dokusu kaldırmak ve daha fazla işlem için bir kenara koyun.
- Havuz NAC (9 ml toplam) yıkar ve 12,000 x g de 20 dakika süre ile santrifüjlenir.
- 30 saniye için steril su, girdap içinde pelet tekrar süspansiyon, BHI / L + G üzerinde seri seyreltme ve plaka hazırlamak
Epitel Hücre (EC) Kesir Bakterilerin 9.2 izolasyonu
- % 5 FBS (RP-5), 5 mM EDTA, 1 mM DTT ile desteklenmiş 5 ml RPMI (Invitrogen # 21870) içeren bir 50 ml tüp içinde steril makas ve yer ile küçük parçalar halinde her bir doku kesin. ° C'de 20 dakika boyunca 37 çalkalama inkübe edin.
- 5 ml RP5/EDTA/DTT içeren yeni bir tüp bağırsak parçaları aktarın ve 37 çalkalama ° C'de 20 dakika için inkübe edilir. Ilk tüpten medya kaydedin ve 37 kenara ° C RP5/EDTA/DTT üç 20 dakika inkubasyon olmak üzere toplam bir kez daha bu işlemi tekrarlayın. Lamina propria iso geçmeden eğerlation adım, boş 50 ml tüp içine kalan bağırsak parçaları aktarın.
- Üç RP5/EDTA/DTT yıkar (15 ml toplam hacmi) ve pelet hücreleri düşük hız (1.200 xg) santrifüj birleştirin.
- Dışı bakteriler ölçmek için, 12,000 x g'de 20 dakika boyunca santrifüj ve süpernatan toplamak. 0.5 pelletini tekrar - BHI / L 1.0 ml steril su ve plaka seri seyreltme + G agar.
- Hücre içi bakteri numaralandırmak için, 25 ug / ml gentamisin içeren RP-5, 5 ml EM pelletini. 37, 30 dakika boyunca tek bir hücre süspansiyonu inkübe ° C artı% 7 öldürmek için CO2 kalan herhangi bir hücre dışı L. monocytogenes. Hücreleri eritmek için 30 saniye boyunca 0.5 ml steril su ve girdap içinde askıya, PBS içinde hücreler iki kez yıkayın. BHI / L + G su ve plaka seri dilüsyonları hazırlayın
Not: Bu aşamada toplanan hücreler temel Peyer en Yamalar hücreleri de içerir. Arzu edildiği takdirde, görünür PeyerYamalar kızarma ve uzunlamasına önce bağırsak dokularından kaldırılabilir.
Lamine Propria (LP) Kesir Bakterilerin 9.3 izolasyonu
- Tüpe 25 ml steril PBS eklenerek bağırsak parçaları arasındaki aşırı DTT / EDTA ile durulayın. Şiddetle çalkalanır, yeni bir tüpe aktarmak ve iki kez tekrarlayın.
- 40 dakika boyunca 37 ° C'de çalkalama 1 mg / ml tip IV kollajenaz ve 40 ug / ml DNAz I inkübe ile desteklenmiş RP-5 oluşan sindirim çözelti 4 ml içeren 50 ml'lik bir tüpe bağırsak parçaları aktarın.
- 4 ml sindirim çözeltisi içeren yeni bir tüp içine sindirilmemiş parçaları aktarın ve doku parçaları tamamen sindirilir kadar bir veya iki kez tekrarlayın. 37 serbest LP hücreler içeren sindirim çözümler, her biri ° C katılım
- Pelet hücreleri düşük hız (1.200 xg) toplanmış sindirim çözümleri santrifüj. Descri olarak supernatant ve hücre pelletini ayrı ayrı işlemesırasıyla hücre dışı ve hücre içi bakteri numaralandırmak için yukarıdaki IBED.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
L. monocytogenes kolonileri 37 ° C'de 36-48 saat inkübasyondan sonra BHI / L + G plakaları görünür olacak Koloniler düzgün, kubbe şeklinde kremsi beyaz bir görünüm (Şekil 1A) var. Büyüme intestinal mikrobiyota çoğunluğu için inhibe ama L. olmayan bazı koloniler görmek için ortak olan edilecektir monocytogenes, direkt olarak seyreltme (Şekil 1B) olmadan ince bağırsak ya da kolon kaplama özellikle. Şüpheli koloniler CHROMagar TM Listeria plakalar üzerinde kaplama ile teyit edilebilir. L. mavi koloniler bu plakalar üzerinde beyaz bir halo (Şekil 1C) ile çevrili olarak monocytogenes görünür. L. için tespit sınırı Her bir dokudaki monocytogenes doku homojenize etmek için kullanılan suyun miktarına bağlıdır. Tablo 1 'de gösterilen örnek etkili miktarlar her bir doku işlemek için gerekli olan, minimal hacimde temsil eder. Dalak homojenatlarında gBütün mesane, beyin, ya da paylarına ayrılmış ince bağırsak dokusudur 1-2 gün boyunca 4 ° C'de saklanır ve gerektiğinde yeniden kaplama olabilir. Kolon, ince bağırsak veya karaciğer homojenatlarında bazı L. engelleyebilir monocytogenes büyüme örnek sürece (Şekil 1D) yeterince seyreltilir ve bu homojenatlarında 4 ° C'de depolama sonra benzer CFU sayıları yeniden kaplama eğer verim yok
Biz daha önce BALB / c / J (BALB) fareler By / C57BL / 6 (B6) fareler 16 daha gıda kaynaklı listeriozis önemli ölçüde daha duyarlı olduğunu göstermiştir. 10 7 CFU bir inokulum, BALB farelerde bağırsak enfeksiyonu kurulması için yeterli olmakla birlikte, en az 10 8 CFU B6 fareleri (Şekil 2) ve gastrointestinal sistem kolonize etmek için gereklidir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, bağırsak, dalak, karaciğer ve safra kesesi bakteri yükü farelere verilmiştir meydan doz ile doğru orantılı olacaktır. Ön çalışmalar 5 x 10 9 CFU olduğunu göstermektedirBALB / c bu model 16 ile / J fareler ile / için yaklaşık LD 50.
Şekil 1. Seçici agar plaklarına Temsilcisi koloni büyüme. A) L. monocytogenes kolonileri BHI / L 48 saat büyüme + G agar sonra. B) BHI / L + G Agar en bağırsak Mikrobiyota büyümesini engeller, ancak bazı olmayan Listeria kolonileri (ok) düşük dilüsyonlarda gözlenebilir. Burada gösterilen agar plaka) 100 plaka yarısında bir 10 -1 seyreltme ul ve 50 iki nokta üst üste Homojenat 10 -2 ve 10 -3 dilüsyonlarının her ul. C içerir L. monocytogenes koloniler KROM Agar Listeria plakaları üzerinde büyüme ile teyit edilebilir. L. monocytogenes koloni çevreleyen beyaz bir halo ile mavi görünür. D) Bu s nadir değildiree L. inhibisyon BHI / L + G agarda bağırsak veya karaciğer homojenatlarında plakaları ya en düşük seyreltme değişen boyutlarda kolonileri ile sonuçlanan monocytogenes büyüme,,.
Şekil 2. BALB / c / J ve C57BL / 6 fareler tarafından /. Dişi BALB / c / J (BALB) ve C57BL / 6 (B6) farenin tarafından / gıda kaynaklı enfeksiyonun doz tepkisi, 9 10 (n = 7) ile enfekte edilmiştir 8 10 (n = 8), 7 10 (n = 6), 10 6 (s = 4) Lm InlA m ve her bir doku CFU sayısı 5 dpi belirlenmiştir. SD gösterilir - + / ortalama değerleri. Iki farklı deney elde edilen veriler analiz edildi. Kesikli çizgiler her organda tespit limiti gösterir.
| Doku | Numune hacmi (mi) bir | Tespit limiti (CFU) |
| Ince bağırsak | 2.0 | 50 |
| Körbağırsak | 2.0 | 50 |
| Kolon | 2.0 | 50 |
| Mezenterik lenf düğümleri | 1.5 | 15 |
| Dalak | 2.5 | 50 |
| Karaciğer | 2.5 | 50 |
| Safrakesesi | 0.5 | 10 |
| Beyin | 1.5 | 15 |
Tablo 1. L algılama sınırlayın. doku homojenatlarında monocytogenes. steril su artı homojenize doku oluşan bir ortalama toplam örnek hacmi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Doğuştan fareler günün her zaman beslenme için düzgün açık değildir ve kontamine ekmek yemek için istekli olduklarını hem gerginlik tipi ve farelerin 17 yaşına bağlıdır. Bizim tecrübelerimize göre, 6-9 haftalık B6 fareler günün herhangi bir zamanda besleme için açık olan, ama onların karanlık döngüsü sırasında sunulan sürece BALB fareler sürekli ekmek parçası yemek olmaz. Karanlık evre laboratuvar personeli için normal iş günü denk böylece hayvanların ev için kullanılan odanın ışık döngüsü değiştirilebilir. Bununla birlikte, farelerin enfeksiyon öncesi değişen ışık döngüsü alıştırıldı, en az iki hafta içinde verilmelidir. Enfeksiyon sırasında, sadece kırmızı lambalar ya da odanın içinde ya da laminer akış kaputu kullanılmalıdır.
Bu modeli geliştirme olarak, ekmek L. iletimi için bir besin kaynağı olarak seçildi ekmek emici büyük ölçüde çünkü monocytogenes. Bu nedenle, inci ile küçük parçalara doyurmak için kolay olduE bakteriyel inokulum ve her fare aynı doz yutulur emin olun. Ancak, bu model kolayca diğer gıda kaynaklarını kullanmak adapte olabilir. Gerçekten de, bu doğrudan bakteriyel enfeksiyon üzerine gıda bileşimi veya depolama koşullarının etkisini test etmek için kullanılabilecek tek fare modelidir. L. monocytogenes kolayca yüksek tuz, düşük pH veya soğuk 1,2,18 büyüme uyum sağlayabilen, ancak bu büyüme koşulları bağırsak enfeksiyonu kurmak için bakterilerin özelliğini değiştirmez eğer bilinmemektedir.
Yaklaşık 10 dakika süresince, tek bir fare enfekte organların her hasat için gereklidir. Safra kesesi kolayca rüptüre olduğu, bu yüzden ilk önce kaldırmak için en iyisidir. Mezenterik lenf düğümleri bağırsak rahatsız henüz zaman nokta kolay, bu nedenle sonraki çıkarılmalıdır. Sadece mide bağırsak altında ve sadece ekteki üzerinde kesilerek tek bir doku olarak, hasat edilmiş ve daha sonra ILEU, jejunum, duodenuma ayrılabilenm, çekum ve kolon hemen önce yıkama ve homojenizasyon için. Dalak ve karaciğer genellikle sonraki kaldırılır ve beyin kafatası erişmek için fare üzerinde açmak için gerekli olan, periton boşluğuna organ aldıktan sonra hasat edilir. Işleme kadar, birden fazla farenin ile çalışırken, bütün dokularda buz üzerinde saklanmalıdır. En dokular için, bir agar plaka dokuda mevcut CFU sayısını belirlemek için kullanılmıştır. Plakası üçe bölündü ve doku homojenatlarının üç ayrı seyreltme 50-100 ul örnek, her üçüncü kaplandı.
Burada açıklanan yöntemler L. toplam sayısını belirleyecektir Her fare dokuda monocytogenes, hücre içi organizmalar sadece. L. eşsiz hücre içi yaşam tarzı monocytogenes enfeksiyon 18,19 sırasında önemli bir virülans belirleyici olduğu düşünülmektedir. Fakat, L. monocytogenes fakültatif, zorunlu değil, hücre içi patojenler, ve orada olanE aslında in vivo hücre içinde ikamet Listeria yüzdesini belirtmek için kesin yayınlanan raporlardır. Oral L. kullanarak en önceki çalışmalarda monocytogenes enfeksiyonu bağırsak Mikrobiyota büyümesini inhibe bağırsak dokuların gentamisin tedavisi dayanıyordu. Gentamisin ile ön-işlem dışı L. ortadan kaldırmak için bir potansiyele sahiptir monocytogenes, bu ölçüde gentamisin in vitro bütün bağırsak dokulara nüfuz edebilir ne açık olmasa da, sadece hücre içi bakteri kurtarma sağlar. Burada açıklanan ek protokol mukus tabakası, epitel ve enfekte bağırsak dokularının lamina propria bölmesine hücre dışı ve hücre içi bakterilerin her ikisinin belirlenmesi için olanak sağlar. Bu prosedürde, gentamisin tüm kurtarılan bakteri doku içinde hücrelerin iç edildi sağlanması, tek hücre süspansiyonları tedavi etmek için kullanılır.
NAC ile üç yıkar genellikle yenidenbağırsak dokularından mukus çoğunluğu taşınır, ve birleştirilen yıkama sıvıları olarak, tripan mavi boyama ile belirlenen herhangi bir ökaryotik hücrelerde (canlı veya ölü), içermiyordu. Sitospin slayt hazırlıkları Diff-Quik boyama tarafından belirlenen ek yıkar görünür mukus vermemiştir. Avrupa Komisyonu ve LP fraksiyonların hücreli da Diff-Quik veya Giemsa boyama ile teyit edilebilir. AT kısmını kolayca bağırsak epitel hücreleri içinde mevcut olan birkaç intraepitelyal lenfositlerden ayırt edilebilir esas olarak, epitel hücreler, oluşmalıdır. LP fraksiyonu inflamatuar monositler doku sızmasından enfeksiyon sonrası bileşim değiştirir mononükleer hücrelerinin bir karışımını ihtiva eden, daha çeşitlidir.
Listeryoz gıda kaynaklı modeli L. geniş bir yelpazede kullanılabilir dahil olmak üzere monocytogenes izole, fare adapte InlA m-ifade suşu 15, burada vahşi tip EGDE ve silme mutant deri tarifBu suşların 16 vatives. Bir önceki çalışmada, intestinal kolonizasyon seviyesi bu suşlar arasında anlamlı bir farklılık olmadığını gösterdi, ancak, fare E-kaderin için yüksek afinite ligand ifade vermedi izole mezenterik lenf düğümlerine yayılması hafif bir kusur var mı ve dalak 16. Benzer şekilde, herhangi bir fare suşu bu bakteriyel patogenezi ve ana enfeksiyona karşı tepkileri de incelemek için cazip bir model alma sistemi, enfeksiyon için kullanılabilir. Henüz doğrudan bu test değil de Son olarak, burada kullanılan temel işlemleri gibi Salmonella, Yersinia, Escherichia, Campylobacter ve Citrobacter türleri gibi diğer gıda kaynaklı bakteriyel patojenler için yaygın olarak uygulanabilir olması gerektiğini öneriyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim. Burada açıklanan tüm deneyler Kentucky Üniversitesi'nde ICAUC onayı ile Laboratuar Hayvan Refahı (OLAW) için Office uygun olarak yapıldı.
Acknowledgments
Bu çalışma SEFD verilen Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI079442 ve AI091918) hibe tarafından desteklenmiştir
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brain Heart Infusion Agar | Difco | BD-241830 | |
| Lithium chloride | Sigma | L9650 | |
| Glycine | Omnipur | 4840 | |
| EDTA | Gibco | 15575-038 | |
| DTT | Sigma | D5545 | |
| Collagenase, type IV | Worthington | LS004089 | |
| DNAse I | Worthington | LS002007 | |
| Diff-Quik | Dade-Behring | B4132-1A | |
| PowerGen 1000 homogenizer | Fisher | 14-261-06 | |
| stainless steel type 304 mesh #80 | Small Parts, Inc. | CX-0080-C | |
| Cytospin | Statspin | M801-22 |
References
- Becker, L. A., Evans, S. N., Hutkins, R. W., Benson, A. K. Role of sigmaB in adaptation of Listeria monocytogenes to growth at low temperature. Journal of Bacteriology. 182, 7083-7087 (2000).
- Neunlist, M. R., et al. Effect of salting and cold-smoking on the culturability, viability, and virulence of Listeria monocytogenes strain Scott A. Journal of Food Protection. 68, 85-91 (2005).
- Aureli, P., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with corn contaminated by Listeria monocytogenes. N. Engl. J. Med. 342, 1236-1241 (2000).
- Dalton, C. B., et al. An outbreak of gastroenteritis and fever due to Listeria monocytogenes in milk. N. Engl. J. Med. 336, 100-105 (1997).
- Frye, D. M., et al. An outbreak of febrile gastroenteritis associated with delicatessen meat contaminated with Listeria monocytogenes. Clin. Infect. Dis. 35, 943-949 (2002).
- Salamina, G., et al. A foodborne outbreak of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes. Epidemiol. Infect. 117, 429-436 (1996).
- Mead, P. S., et al. Food-related illness and death in the United States. Emerging Infectious Diseases. 5, 607-625 (1999).
- Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: Clinical and experimental update. The Journal of Infectious Disease. 185, S18-S24 (2002).
- Condotta, S. A., Richer, M. J., Badovinac, V. P., Harty, J. T. Probing CD8 T cell responses with Listeria monocytogenes infection. Advances in Immunology. 113, 51-80 (2012).
- Disson, O., et al. Modeling human listeriosis in natural and genetically engineered animals. Nat Protoc. 4, 799-810 (2009).
- Czuprynski, C. J., Faith, N. G., Steinberg, H. A/J mice are susceptible and C57BL/6 mice are resistant to Listeria monocytogenes infection by intragastric inoculation. Infect. Immun. 71, 682-689 (2003).
- Gajendran, N., et al. Regional IFNgamma expression is insufficient for efficacious control of food-borne bacterial pathogens at the gut epithelial barrier. Int. Immunol. 19, 1075-1081 (2007).
- Lecuit, M., et al. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
- Pron, B., et al. Comprehensive study of the intestinal stage of listeriosis in a rat ligated ileal loop system. Infect. Immun. 66, 747-755 (1998).
- Wollert, T., et al. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
- Ghanem, B. ou, N, E., et al. InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice. PLoS Pathogens. , Submitted for publication (2012).
- Kowal, M., Buda-Lewandowska, D., Plytycz, B., Styrna, J. Day/night food consumption in mice is strain and age-dependent. Folia Biol. (Krakow). 50, 1-3 (2002).
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen. Nature reviews. Microbiology. 7, 623-628 (2009).
- Camejo, A., et al. The arsenal of virulence factors deployed by Listeria monocytogenes to promote its cell infection cycle. Virulence. 2, 379-394 (2011).
